Imaging Analyse van de Neuron tot Glia Interactie in Microfluïdische Cultuur Platform (MCP)-gebaseerde Neuronale Axon en Glia Co-cultuur systeem

Dit protocol beschrijft een nieuw co-cultureplatform voor neurale axonen en astroglia om interacties tussen neuronen en glia te analyseren met behulp van imaging met hoge resolutie. Eerst wordt de microfluïdische kweekkamer geassembleerd, worden neurale culturen voorbereid en worden de neurale axonen gestimuleerd om de andere zijde van de MCP binnen te dringen. Vervolgens worden gecultiveerde astrocyten toegevoegd om een gecompartimenteerd co-culturesysteem te vestigen; de resultaten, waaronder time-lapse imaging met confocale immunofluorescentiemicroscopie, kunnen helpen bij het begrijpen van de interacties tussen axonen, astroglia en neurale axonen.

We kregen oorspronkelijk het idee voor deze methode toen we probeerden het effect van neuronale uitlopers te scheiden van neuronale secretie bij de regulatie van GT. Personen die nog niet bekend zijn met deze methode zullen doorgaans moeite hebben met het induceren van axonen naar andere delen van het cellulaire compartiment. Hiervoor is een hoge densiteit van gezonde neuronen nodig, geplaatst op de neuronale zijde met de neuronen vlakbij de centrale kanalen.

De MCP open kamers zijn ontworpen voor gecompartimenteerde culturen van verschillende celtypen; polyurethaan- en lamininecoatings zijn noodzakelijk voor het uitplaten van neuronen en astrocyten in de co-cultuur. Breng eerst één milligram per milliliter polyurethaanoplossing aan op de steriele schaaltjes met glazen bodem en incubeer deze gedurende de nacht bij 37 °C. Was de gecoate schaaltjes met glazen bodem drie keer met dubbel gedestilleerd water en plaats ze vervolgens onder een steriele zuigkast om te drogen.

Coat daarna de schaal met 1 mg/mL laminine en laat dit één uur drogen onder UV-licht. De assemblage van de MCP op de schaal met glazen bodem moet vlak voor gebruik worden klaargemaakt. Positioneer het microfluïdische kweekplatform met de centrale verbindingskanalen aan de onderzijde en vorm een nauwe afsluiting met het gecoate glas.

Bodemschalen. Voeg aan beide zijden van het geassembleerde MCP reguliere kweekmedia voor neuronen of astrocyten toe. Incubeer de kamer gedurende twee tot vier uur bij 37 °C en controleer of er geen lekkage is tussen het MCP en het glas.

Onderste schaal. Corticale neuronale celculturen worden vers bereid uit muizenhersenen van embryonale dag 14 tot 16. Verwijder na dissectie van de muizenhersenen de meninges van de cortex onder de dissectiemicroscoop.

Gebruik een scheermesje om het weefsel fijn te malen tot kleine weefselblokjes en plaats de fijngehakte weefselblokjes na centrifugatie in een buis. Verwijder het medium boven het pellet en voeg 0,05% Tryin toe gedurende 10 minuten in een waterbad van 37 °C. Dissocieer de cellen door voorzichtig te tritueren met een vuurgepolijste Pasteurpipet.

Filter het monster door een zeef van 70 micron om een heldere neuronale celsuspensie te verkrijgen met behulp van neuron-plating. Medium aangevuld met 5% FBS zaad. 150 µL neuronen aan de rechterzijde van de geassembleerde MCP-plaat.

Een hoge dichtheid van neuronen, aangezien alleen de neuronen die zich hechten in het celretentiegebied in staat zijn om axonen door de centrale kanalen naar de andere zijde van de geassembleerde MCP te laten groeien. De volgende dag wordt het medium voorzichtig uit het celplaatgebied van de kamer geaspireerd en wordt het neuronplaatmedium vervangen door regulier neuronkweekmedium.

Voeg 20 nanogram per milliliter gliaal-afgeleide neurotrofische factor of GDNF toe aan de astrocytenzijde van de kamer in het medium. Dit creëert een chemische gradiënt die de uitgroei van axonen vanaf de neuronale zijde door de centrale kanalen van de geassembleerde MCP zal stimuleren. Controleer twee dagen later op axonen die het centrale kanaal zijn binnengedrongen.

Zodra de axonen het centrale kanaal binnengaan, bereiken ze gewoonlijk binnen één dag de andere zijde. Axonen blijven normaal gesproken ten minste één week intact nadat ze de andere zijde hebben bereikt. Na het dissociëren van de hersenen van P1 tot P3 muizen werden astrocyten gezaaid in polyurethaan-gecoate schalen van 10 centimeter.

Kweek de cellen gedurende de nacht, vul het astrocyte-kweekmedium dagelijks aan tijdens de volgende twee dagen, en daarna eens per drie dagen na zeven dagen wanneer de astrocyten een 90% confluente monolaag hebben gevormd, oogst de cellen met trypsin. Ongeveer vijf dagen nadat de neuronen zijn uitgeplaat, wordt het GDNF afgezogen. Zaai vervolgens 150 µL van de resuspendeerde astrocyten in de linkerzijde van de geassembleerde MCP. Wanneer axonen op het punt staan om binnen te dringen of net zijn binnengedrongen na het heruitplaten van de astrocyten, interageren axonen die de linkerzijde van de geassembleerde MCP zijn binnengedrongen direct met de astrocyten, hetzij door direct axonaal contact of door de afgifte van oplosbare factoren.

Controleer de astrocyten op aanhechting aan het celretentiegebied. Voer een immunostaining uit op de cellen in het gecompartimenteerde co-cultuursysteem om specifieke eiwitten te visualiseren, zoals die betrokken zijn bij de interactie tussen de axonen en de astrocyten. Het gecompartimenteerde co-cultuursysteem voor neuronen en astrocyten laat uitsluitend de neuronale uitlopers, in het bijzonder de axonen, selectief interageren met astrocyten.

Hier beschrijven we axoon-geïnduceerde transcriptionele activatie van de astroglia glutamaattransporter. In deze studies worden transgene muizen gebruikt, die een expressie van een EGF fluorescentiereporter hebben onder controle van de GT1 genomische promoter. Een hoge dichtheid aan neuronen wordt gekweekt in het celretentiegebied van de geassembleerde MCPA; een vergroot beeld toont de axonen die de centrale kanalen oversteken en de andere zijde binnengaan, waarbij kleuring voor bèta-III-tubuline de axonale groeikegel onthult.

Het MCP-systeem maakt monitoring mogelijk van de axonbundels terwijl ze door het centrale kanaal groeien en de andere zijde binnengaan. Immunokleuring voor GLT-1 identificeert astrocyten in de gliale zijde van het MCP-systeem. De afbeelding toont hier contact tussen axonen en GLT-1-positieve astrocyten.

De expressie van de EGFP-reporter correleert met de activatie van de endogene GT one-promotor, eiwitexpressie en functionele activiteit. Beoordeling van de GT one-promotoractiviteit in individuele astrocyten in C two laat een significant verhoogde GLT one-immunoreactiviteit zien in het gecompartimenteerde cocultuursysteem. Belangrijk is dat het MCP-systeem time-lapse-beelden mogelijk maakt om dynamische veranderingen te monitoren.

Bijvoorbeeld, deze gegevens tonen axon-geïnduceerde GT1-promotoractivatie met GT1-EGFP-astrocyten en wild-type neuronen één dag na het uitplaten van de astrocyten. Er is een minimale EGFP-fluorescentie waarneembaar. De EGFP-intensiteit neemt significant toe 48 uur na co-cultuur, wanneer de axonen zich diep in de astrocytenzijde bevinden en hier direct contact maken met de astrocyten.

Behandeling met kinine aan de neuronale zijde van de geassembleerde MCP induceerde neuronale celdood. Opvallend genoeg stimuleerde dit ook axonale retractie en degeneratie, evenals een afname van de axonale EGFP-fluorescentie. Deze dynamische veranderingen in de EGFP-fluorescentie-intensiteit in respons op de axonen toonden duidelijk aan dat de Astroglia GT one-promotoractiviteit wordt gemoduleerd door de axonale interactie.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u het kerncultuursysteem opzet met behulp van het microfluidische cultuurplatform; zodra deze techniek beheerst is, kan deze binnen enkele dagen correct worden uitgevoerd.