Name: Studie van de DNA-schade Checkpoint met behulp van Xenopus Egg Extracten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Leer het DNA-schade checkpoint onderzoeken met Xenopus-ei-extracten en beschadigde sperma-chromatine. Deze methode biedt inzicht in genoomstabiliteit en checkpoint-signalering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk wordt gedeeltelijk ondersteund door fondsen die door de Universiteit van North Carolina in Charlotte, Wachovia stichting fonds voor faculteit excellentie, en een subsidie ​​van NIGMS (R15GM101571).

1. LSE Voorbereiding <ol><li> Vrouw kikkers (Xenopus laevis) worden twee keer geïnjecteerd voor eieren ophalen. De eerste injectie (priming) is 100 U PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin) per kikker. Kikkers moet worden voorbehandeld ten minste twee dagen voor de inducerende leggen van eieren en gegrond kikkers zijn bruikbaar voor maximaal twee weken. Om prime kikkers, injecteren PMSG subcutaan in de dorsale lymfe zakken met behulp van een 3 ml spuit en 27 G-naald. </li><li> Om eieren leggen te induceren, injecteren 500 U hCG (humaan choriongonadotrofine) per geprimed kikker subcutaan in de dorsale lymfe zakken met behulp van een 27 G naald. Incubeer geïnjecteerde kikkers in aparte emmers met 2 liter oplossing 1x Marc&#39;s gemodificeerd Ringer (BMR). Laat kikkers 14 tot 20 uur om eieren te leggen stuk. </li><li> Verwijder de kikkers uit de emmers en giet de BMR-oplossing tot ongeveer 100 ml over is. Verkrijgen eieren uit de emmers door overdracht eieren naar een 250 ml bekerglas. </li><li> Dejelly eieren door toevoeging van 100 ml van 2% cysteine ​​(paspH op 7,8 met 10 M KOH). Zwenk de eieren met een omgekeerde glazen Pasteur pipet (0,7 cm in diameter) ongeveer elke 30 sec. Giet en tweemaal vervangen door vers cysteine ​​tijdens incubatie. Het dejellying is voltooid in ongeveer 5-15 min wanneer de eieren vormen een gecondenseerde laag op de bodem van het bekerglas. </li><li> Gooi de cysteïne oplossing weg en was eieren drie keer met 0,25 x MMR. Swirl de eieren in de oplossing door een glazen pipet. &quot;Bad&quot; eieren worden bepaald door simpele visuele inspectie en &quot;puffy&quot; wit uiterlijk. De &quot;slechte&quot; eieren accumuleren in het midden van het bekerglas na zwenken. Verwijder &quot;slechte&quot; eieren door een Pasteur pipet. </li><li> Was eieren met ei Lysis Buffer (ELB) drie keer. Verwijder eventuele extra &quot;slechte&quot; eieren door een Pasteur pipet. Giet de eieren in een 14 ml Falcon buis. </li><li> Draai de Falcon buis voor 55 sec op 188 xg (1.100 rpm) met behulp van de CL2 IEC klinische table-top centrifuge met een swingende emmer rotor om de eieren te comprimeren. Verwijder overtollig buffer van debovenkant van de legkippen. Voeg 0,5 ul van aprotinine / Leupeptine voorraad en 0,5 pi van cytochalasine B voorraad per ml verdichte eieren. </li><li> Centrifugeer eieren bij 16.500 xg (10.000 rpm) gedurende 15 min bij 4 ° C met de Sorvall supersnelle centrifuge RC6 plus met HB6 slingeren bucket rotor. Na centrifugeren eieren gesplitst in drie lagen in de buis: lipide extract en eigeel / pigment van boven naar beneden, respectievelijk. Prik in de zijkant van de Falcon buis in het onderste gedeelte van de middelste laag extract met een 21 G naald. Verwijder voorzichtig de naald als de punctienaald kan worden belemmerd door plastic. Plaats een nieuwe 21 G naald bevestigd aan een 1 ml spuit in de prikplaats om het extract te verzamelen. Langzaam zuigen het extract in de spuit om luchtbellen en besmetting met het lipide en eigeel / pigment lagen te voorkomen. </li><li> Plaats de extracten in een gekoeld 1,5 ml microcentrifugebuis. Voor elke milliliter ei-extract, voeg de volgende chemische voorraad oplossingen voor de indicated eindconcentratie (tussen haakjes): (1) 10 ul Cycloheximide (100 ug / ml), (2) 1 pl aprotinine / Leupeptin (10 ug / ml elk), (3) 1 pl cytochalasine B (5 ug / ml ) (4) 1 ui Dithiothreitol (1 mM) en (5) 0,33 pl nocodazole (3 ug / ml). Inverteer het ei zacht extract ten minste 10 maal. Dit is de LSE, die dient te geschieden verse en binnen 4 uur. De kwaliteit van LSE gecompromitteerd na 4 uur of vries-dooi. </li></ol> 2. Behandeling van sperma chromatine met DNA-beschadigende Approaches <ol><li> Bereid normale zaadcellen chromatine volgens de werkwijze eerder beschreven 13. </li><li> Bereid MMS-behandelde sperma chromatine <ol><li> Resuspendeer normale sperma chromatine in 0,5 ml buffer X. </li><li> Voeg ~ 5,5 pl MMS (9,1 M voorraad) 500 ul geresuspendeerd chromatine tot een eindconcentratie van 100 mM. </li><li> Incubeer sperma chromatine in microcentrifugebuis bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten draaien. </li><li> Draai de microcentrifuge buis 686 xg (2.100 rpm) gedurende 10 min bij kamertemperatuur met de IEC klinische centrifuge CL2 met swingende bucket rotor en buis adapters. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 0,5 ml buffer X plus BSA (3%), DTT (0,1 mM) en aprotinine / Leupeptin (10 ug / ml elk). </li><li> Herhaal de stappen (4) en (5) twee keer om het sperma chromatine te wassen. </li><li> De concentratie van zaadcellen chromatine met een hemocytometer en verdun tot 100.000 sperma / ul. Bewaar 5 pi aliquots in -80 ° C vriezer voor verder gebruik. </li></ol></li><li> Bereid UV-behandelde sperma chromatine <ol><li> Voeg de gewenste hoeveelheid (bijv. 10 pl) van normale zaadcellen chromatine op het oppervlak van een stuk Parafilm. </li><li> Plaats de Parafilm een ​​UV crosslinker. Stel de gewenste energie-parameter, afhankelijk van uw experiment, en beginnen om het sperma chromatine via UV-licht beschadigen. Bijvoorbeeld duurt ongeveer 21 sec te bereiken 1.000 J / m 2. </li><li> Na UV bestramediatie, UV-behandelde sperma chromatine worden toegevoegd aan ei extracten onmiddellijk. </li></ol></li></ol> 3. Voorbereiding van een DNA Damage-nabootsende Structuur (AT70) <ol><li> Los twee synthetische oligonucleotiden poly-(dA) 70 (aangeduid als A70) en poly-(dT) 70 (aangeduid als T70) in water tot een concentratie van 2 pg / pl respectievelijk. </li><li> Voeg 100 ul A70 en 100 ul T70 een 1,5 ml microcentrifugebuis. Kook gemengde synthetische oligo-oplossing gedurende 5 minuten bij 95 ° C in een heatblock. </li><li> Neem de droge bad block out (met de buis met AT mengsel erin), en laat het afkoelen tot kamertemperatuur op een lab bank. Deze temperatuur instelling duurt ongeveer 45-60 min.. </li><li> Het afgekoelde mengsel AT70 met een eindconcentratie van 2 ug / ul. Store 10 pi aliquots in AT70 -20 ° C vriezer voor verder gebruik. </li></ol> 4. Het activeren van de DNA-schade Checkpoint in LSE met beschadigde Sperma chromatine of een DNA-schade-Nabootsende Structuur <ol><li> DNA-beschadigingen induceert controlepost in LSE met beschadigde zaadcellen chromatine <ol><li> Voeg 50 ul van LSE een 1,5 ml microcentrifugebuis en aanvullen met 1 pi Energy mengsel en 2 ui beschadigde sperma chromatine (eindconcentratie 4.000 ~ sperma / ul reactie). </li><li> Incubeer de reactiebuis bij kamertemperatuur gedurende 90 min en schudt de buis elke 10 minuten. </li><li> Doseer 1 pi reactiemengsel op een microscoopglaasje aangevuld met 1 pi van nucleaire kleurstof oplossing na 30 min incubatie. Plaats een dekglaasje over het reactiemengsel en controleer kernen vorming via fluorescentiemicroscoop. Typisch zal door atoomkernen na 30 min incubatie, waarin DNA replicatie is gestart. </li><li> Neem 10 pi van het reactiemengsel in 90 pl monsterbuffer. Monsters worden geanalyseerd via immuunblotting met anti-Chk1 P-S344 of anti-Chk1 antilichamen. </li></ol></li><li> DNA-beschadigingen induceert controlepost in LSE met deAT70 <ol><li> Voeg 50 ul van LSE een 1,5 ml microcentrifugebuis aangevuld met 1 pi Energy mengsel en 1,6 pl Tautomycin stock. </li><li> Voeg 1,25 pl vooraf gemaakte AT70 (2 pg / pl) of water (als negatieve controle) aan elk reactievat. Incubeer de reacties bij kamertemperatuur gedurende 90 minuten. Flick de reageerbuisjes om de 10 minuten. </li><li> Voeg 10 ul van het reactiemengsel in 90 pl monsterbuffer. De monsters worden onderzocht via immunoblotting met anti-Chk1 P-S344 of anti-Chk1 antilichamen. </li></ol></li></ol> 5. Representatieve resultaten De beschadigde sperma chromatine of DNA schade-nabootsende structuur leiden tot de ATR/Chk1-mediated DNA schade checkpoint in de Xenopus ei extract systeem. Figuur 2A toont dat MMS Chk1 fosforylatie op Ser344 (Chk1 P-S344), een indicator van induceert ATR kinase activatie. Figuur 2B toont dat AT70 als DNA schade-nabootsende structure, ook triggers Chk1 fosforylering. Totaal Chk1 monsters worden gebruikt voor het laden controles beide voorbeelden. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4449/4449fig1.jpg" /> Figuur 1. Een diagram van de DNA schade checkpoint signaling. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4449/4449fig2.jpg" /> Figuur 2. Chk1 fosforylering wordt geïnduceerd door een MMS of AT70 behandelingen in Xenopus ei extracten. (A) MMS beschadigde sperma chromatine (MMS) of normale zaadcellen chromatine (Con) geïncubeerd in ei extracten gedurende 90 minuten. Chk1 fosforylatie op Ser344 (Chk1 P-S344) en de totale Chk1 in ei extracten worden onderzocht aan de hand immunoblotting. (B) AT70 of water (Con) worden toegevoegd in ei-extracten, respectievelijk. Monsters ook geanalyseerd via immunoblotting zoals in (A).

<ol><li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li>
<li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATR%3A+an+essential+regulator+of+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">ATR: an essential regulator of genome integrity.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li>
<li>Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+the+ATR-mediated+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> Methods. 41 (2), 222-231 (2007).</li>
<li>Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+requirement+for+replication+in+activation+of+the+ATR-dependent+DNA+damage+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint.</a> Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).</li>
<li>Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+is+required+for+the+checkpoint+response+to+damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).</li>
<li>Kato, K., Strauss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+an+intermediate+in+DNA+synthesis+by+HEp.2+cells+treated+with+methyl+methanesulfonate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).</li>
<li>Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+checkpoint+regulates+the+rate+of+progression+through+S+phase+in+S.+cerevisiae+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage.</a> Cell. 82 (5), 841-847 (1995).</li>
<li>Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+Atr+in+phosphorylation+of+Chk1+and+cell+cycle+regulation+in+response+to+DNA+replication+blocks+and+UV-damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).</li>
<li>Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mre11-Rad50-Nbs1-dependent+processing+of+DNA+breaks+generates+oligonucleotides+that+stimulate+ATM+activity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO.+J%22%5BJournal%5D)">Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity.</a> EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).</li>
<li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claspin%2C+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).</li>
<li>Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+requirement+for+Xmus101+in+ATR-mediated+phosphorylation+of+Claspin+bound+Chk1+during+checkpoint+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling.</a> J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).</li>
<li>Shiotani, B., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+DNA+orchestrates+an+ATM-to-ATR+switch+at+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks.</a> Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).</li>
<li>Tutter, A. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+DNA+replication+in+a+soluble+cell-free+system+derived+from+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs.</a> Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).</li>
<li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Fractionation+of+Xenopus+laevis+Egg+Extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts.</a> J. Vis. Exp. (18), e891(2008).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Er zijn verschillende voordelen bij het ​​bestuderen van DNA schade checkpoint met Xenopus ei extracten. Het gebruik van ei extracten biedt een grote hoeveelheid celvrije extracten gesynchroniseerd interfase van de celcyclus. Het ei extracten gemakkelijk en goedkoop worden gemaakt. Het is relatief eenvoudig aan DNA of chromatine beschadigen en een defect in de DNA schade checkpoint blijkt na immunodepleting een doeleiwit uit ei extract. Vervolgens kan een potentiaalfunctie defect worden &quot;gered&quot; door a...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagentia </td></tr><tr><td> Anti-Chk1 P-S344 antilichaam </td><td> Cell Signaling </td><td> 2348L </td><td></td></tr><tr><td> Anti-antilichaam Chk1 </td><td> Santa Cruz </td><td> SC7898 </td><td></td></tr><tr><td> Aprotinine </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0219115880 </td><td></td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> Sigma </td><td> C7698-5G </td><td></td></tr><tr><td> Cytochalasine B </td><td> EMD </td><td> 250233 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) </td><td> VWR </td><td> JTF780-2 </td><td></td></tr><tr><td> hCG </td><td> Sigma </td><td> CG10-10VL </td><td></td></tr><tr><td> L-Cysteine </td><td> Sigma </td><td> C7352-1KG </td><td></td></tr><tr><td> Leupeptine </td><td> VWR </td><td>97063-922 </td><td></td></tr><tr><td> Methylmethaansulfonaat (MMS) </td><td> Sigma </td><td> 129925-5G </td><td></td></tr><tr><td> Nocodazole </td><td> Sigma </td><td> M1404-2MG </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> Monsterbuffer </td><td> Sigma </td><td> S3401 </td><td></td></tr><tr><td> Tautomycin </td><td> Wako Chemicals USA </td><td> 209-12.041 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Uitrusting </td></tr><tr><td> Emmer voor het leggen van eieren </td><td> Rubbermaid Commercial Products </td><td> 6308 </td><td></td></tr><tr><td> CL2 IEC centrifuge met swingende emmer rotor </td><td> Thermo Scientific </td><td> 004260F </td><td></td></tr><tr><td> HB6 swingende emmer rotor </td><td> Thermo Scientific </td><td> 11860 </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall RC6 plus SuperSpeed ​​centrifuge </td><td> Thermo Scientific </td><td> 46910 </td><td></td></tr><tr><td> UV-crosslinker </td><td> UVP </td><td> 95-0174-01 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Oplossingen </td></tr><tr><td> 1x MMR </td><td></td><td></td><td> 100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0,5 mM MgSO4, 2,5 mM CaCl2, 5 mM HEPES, breng de pH op 7,8 met 10 M NaOH </td></tr><tr><td> Aprotinine / Leupeptine voorraad </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml elk in water. Geheugen 20 pi aliquots bij -80 ° C. </td></tr><tr><td> Buffer X </td><td></td><td></td><td> 0,2 M sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, pH aangepast tot 7,5 door HCl </td></tr><tr><td> Cycloheximide voorraad </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml in water. Store 1 ml porties bij -20 ° C. </td></tr><tr><td> Cytochalasine B voorraad </td><td></td><td></td><td> 5 mg / ml in DMSO. Geheugen 20 pi aliquots bij -20 ° C. </td></tr><tr><td> Dithiothreitol (DTT) voorraad </td><td></td><td></td><td> 1 M in water. Store 1 ml porties bij -20 ° C. </td></tr><tr><td> ELB </td><td></td><td></td><td> 0,25 M sucrose, 1 mM DTT, 50 ug / ml cycloheximide, 2,5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7 </td></tr><tr><td> Nocodazole voorraad </td><td></td><td></td><td> 10 mg / ml in DMSO. 5 pi aliquots slaan bij -80 ° C. </td></tr><tr><td> Energie Mengsel </td><td></td><td></td><td> 375 mM creatinefosfaat, 50 mM ATP, en 25 mM MgCl2. Aliquots worden opgeslagen bij -80 ° C. </td></tr><tr><td> Nuclear kleurstofoplossing </td><td></td><td></td><td> 0,4 ug / ml Hoechst 33258, 25% glycerol(V / v), in 1x PBS </td></tr><tr><td> Tautomycin voorraad </td><td></td><td></td><td> 100 uM in DMSO. Opslaan 10 pi aliquots bij -80 ° C. </td></tr></tbody></table>

studie van de dna-schade checkpoint met behulp van<em&gt; xenopus</em&gt; egg extracten

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

Op een dagelijkse basis, worden cellen blootgesteld aan verschillende endogene en milieubeschadigingen. Om deze beledigingen bestrijden zijn cellen ontwikkeld DNA schade checkpoint signalering als een controlemechanisme om DNA schade en direct cellulaire responsen waarnemen op DNA schade. Er zijn verschillende groepen van eiwitten genaamd sensoren, transducers en effectors betrokken bij DNA schade checkpoint signalering (figuur 1). In dit complex signaalweg ATR (ATM en Rad3 gerelateerde) is een van de belangrijkste kinases die reageren op DNA schade en replicatie stress. Geactiveerde ATR kan fosforyleren haar downstream substraten zoals Chk1 (Checkpoint kinase 1). Bijgevolg gefosforyleerd en geactiveerd Chk1 leidt tot veel stroomafwaarts gelegen in de DNA schade checkpoint waaronder celcyclus, transcriptie activatie DNA schade herstel en apoptose of senescentie (figuur 1). Als DNA beschadigd is, niet aan de DNA-schade checkpoint resultaten te activeren in unrepuitgezonden schade en vervolgens genomische instabiliteit. De studie van de DNA schade checkpoint verduidelijken hoe cellen genomische integriteit en een beter begrip van menselijke ziekten, zoals kanker, te ontwikkelen. Xenopus laevis ei extracten ontstaan ​​als krachtig celvrij extract modelsysteem DNA schade checkpoint onderzoek. Lage snelheid extract (LSE) werd aanvankelijk beschreven door de Masui groep 1. De toevoeging van demembranated sperma chromatine te LSE resulteert in vorming kernen waar DNA wordt gerepliceerd in een semiconservatieve wijze eenmaal per celcyclus. De ATR/Chk1-mediated checkpoint signaleringsroute wordt geactiveerd door DNA-schade of replicatie spanning 2. Twee methoden worden momenteel gebruikt om de DNA schade veroorzaken checkpoint: DNA beschadigende benaderingen en DNA schade gelijkende structuren 3. DNA schade kan worden veroorzaakt door ultraviolet (UV) bestraling, γ-straling, methyl methaanesulfonate (MMS), mitomycine C (MMC), 4-nitrochinoline-1-oxide (4-NQO) of aphidicoline 3, 4. MMS is een alkylerende stof die DNA-replicatie remt en activeert de ATR/Chk1-mediated DNA-schade checkpoint 4-7. UV bestraling activeert ook ATR/Chk1-dependent DNA schade checkpoint 8. De DNA schade gelijkende structuur AT70 is gegloeide complex van twee oligonucleotiden poly-(dA) 70 en poly-(dT) 70. De AT70-systeem is ontwikkeld in het laboratorium van Bill Dunphy&#39;s en wordt veel gebruikt om negen-twaalf veroorzaken ATR/Chk1 checkpoint signalering. We beschrijven protocollen (1) celvrije extracten ei (LSE) te bereiden, (2) Xenopus sperma chromatine behandelen met twee verschillende DNA beschadigen benaderingen (MMS en UV), (3) de DNA schade gelijkende structuur bereiden AT70, en (4) de ATR/Chk1-mediated DNA schade veroorzaken ijkpunt in LSE met beschadigde sperma chromatine of DNA schade-nabootsende structuur.

Xenopus ei extract is een nuttig modelsysteem om de DNA schade checkpoint onderzoeken. Dit protocol is voor de bereiding van Xenopus ei extracten en DNA schade checkpoint inducerende reagentia. Deze technieken kunnen worden aangepast aan een verscheidenheid van DNA beschadigende benaderingen in de studie van de DNA schade checkpoint signaling.

Studie van de DNA-schade Checkpoint met behulp van<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Extracten

Op dagelijkse basis worden cellen blootgesteld aan een verscheidenheid aan endogene en omgevingsgebonden belastingen. Om deze belastingen te bestrijden, hebben cellen DNA-schade- ...

Het algemene doel van deze procedure is om het DNA-schadecontrolepunt te onderzoeken met behulp van xip-eiextracten als modelsysteem. Bereid eerst een extract met lage snelheid voor uit xip-eieren. Bereid vervolgens beschadigd sperma-chromatine voor met DNA-beschadigende methoden zoals MMS en UV-licht.Bereid daarnaast de structuur voor die DNA-schade nabootst. Een T 70 wordt gebruikt om het DNA-schadepunt in LSE te activeren met het beschadigde spermachromatine of de a T 70. Uiteindelijk kunnen resultaten van blots inzicht bieden in het a TR check one-gemedieerde DNA-schadepunt in het eiextract van de xenopus.Hallo. Ik ben CH Y van de afdeling biologie aan UNC Charlotte. Vandaag laten we u zien hoe pus-extract wordt gebruikt als modelsysteem om de schade aan de tech point-signalering te onderzoeken.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van dynamische instabiliteit, zoals de wijze waarop het DNA-schademerkpunt wordt geactiveerd. Dit protocol is bedoeld voor de bereiding van zowel opus eiextract als reagentia die het DNA-schademerkpunt induceren, en voor de analyse van het DNA-schademerkpunt en xap. Deze technieken zijn aanpasbaar aan diverse metho

study-of-the-dna-damage-checkpoint-using-xenopus-egg-extracts

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De kinetochoor is waar de SAC initieert het signaal het toezicht op de mitotische segregatie van de zuster chromatiden. Een methode wordt beschreven om de werving en de omzet van een van de kinetochoor eiwitten en de coördinatie te visualiseren met het chromosoom beweging...

Studeren Mitotische Checkpoint door te laten zien Dynamic kinetochoor Protein Gedrag en Chromosoom Motion in Living<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytieel Embryo&#39;s

Een werkwijze wordt beschreven voor het analyseren eiwitafbraak met radioactief gemerkt en luciferase-fusie-eiwitten in Xenopus ei extract en de aanpassing voor high-throughput screening kleinmoleculige modulatoren van eiwitafbraak.

Reconstitutie van β-catenine afbraak in<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Extract

De vraag hoe chromatine toezichthouders en chromatine staten van invloed op het genoom in vivo is de sleutel tot ons begrip van hoe vroeg lot van de cel beslissingen worden genomen in het zich ontwikkelende embryo. ChIP-Seq-de meest populaire benadering van chromatine functies onderzoeken op mondiaal niveau wordt hier geschetst voor Xenopus embryo.

Genoom-brede Snapshot van chromatine regelgevers en staten in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryo&#39;s van Chip-Seq

De moleculaire mechanismen van de decondensatie van sterk gecompacteerde mitotische chromatine zijn slecht gedefinieerd. We presenteren een celvrije test op basis van mitotische chromatineclusters geïsoleerd uit HeLa-cellen en Xenopus laevis eierextract die het decondensatieproces in vitro getrouw reconstrueert.

Een Cell Gratis Assay om te studeren Chromatine decondensatie aan het eind van Mitosis

Door encapsulating ei extracten van Xenopus laevis in water-in-olie micro presenteren we een methode voor het genereren van in vitro zichzelf onderhoudende mitotische oscillaties op het niveau van eencellige.

Reconstructie van de celcyclus oscillaties in Micro van cel-vrije Xenopus ei extracten

Na DNA-schade activeren menselijke cellen essentiële hersteltrajecten om de integriteit van hun genoom te herstellen. Hier beschrijven we de methode van indirecte immunofluorescentie als een middel om DNA-hersteleiwitten te detecteren, hun ruimtelijke en temporele rekrutering te analyseren en de eiwitinteractie op de sites van DNA-schade te helpen ondervragen.

Visualisatie van DNA Repair Proteins Interaction door Immunofluorescentie

We beschrijven een methode voor de bereiding en live beeldvorming van onverdunde cytoplasmatische extracten van Xenopus laevis-eieren .

Xenopus laevis | Voorbereiding van ei-extract en live beeldvormingsmethoden voor het visualiseren van dynamische cytoplasmatische organisatie

Het doel van dit protocol is om live imaging te gebruiken om de effecten van oxidatieve schade op de lokalisatie en dynamiek van subcellulaire structuren in Drosophila eierstokken te visualiseren.

Visualiseren van de effecten van oxidatieve schade op Drosophila Egg Chambers met behulp van Live Imaging

Dit artikel introduceert essentiële stappen van immunostaining en chromatine immunoprecipitatie. Deze protocollen worden vaak gebruikt om DNA-schadegerelateerde cellulaire processen te bestuderen en om de rekrutering van eiwitten die betrokken zijn bij DNA-reparatie te visualiseren en te kwantificeren.

Visualiseren en kwantificeren van endonuclease-gebaseerde site-specifieke DNA-schade

Het handhaven van de integriteit van het oöcytengenoom is noodzakelijk om de genetische getrouwheid in het resulterende embryo te waarborgen. Hier presenteren we een nauwkeurig protocol voor het detecteren van DNA-dubbelstrengsbreuken in vrouwelijke geslachtscellen van zoogdieren.

Detectie van DNA-dubbelstrengsbreuken in eicellen van muizen

Leer het DNA-schade checkpoint onderzoeken met Xenopus-ei-extracten en beschadigde sperma-chromatine. Deze methode biedt inzicht in genoomstabiliteit en checkpoint-signalering.

Studie van de DNA-schade Checkpoint met behulp van

Meer video's verkennen