Studie van de DNA-schade Checkpoint met behulp van

Het algemene doel van deze procedure is om het DNA-schadecontrolepunt te onderzoeken met behulp van xip-eiextracten als modelsysteem. Bereid eerst een extract met lage snelheid voor uit xip-eieren. Bereid vervolgens beschadigd sperma-chromatine voor met DNA-beschadigende methoden zoals MMS en UV-licht.

Bereid daarnaast de structuur voor die DNA-schade nabootst. Een T 70 wordt gebruikt om het DNA-schadepunt in LSE te activeren met het beschadigde spermachromatine of de a T 70. Uiteindelijk kunnen resultaten van blots inzicht bieden in het a TR check one-gemedieerde DNA-schadepunt in het eiextract van de xenopus.

Hallo. Ik ben CH Y van de afdeling biologie aan UNC Charlotte. Vandaag laten we u zien hoe pus-extract wordt gebruikt als modelsysteem om de schade aan de tech point-signalering te onderzoeken.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van dynamische instabiliteit, zoals de wijze waarop het DNA-schademerkpunt wordt geactiveerd. Dit protocol is bedoeld voor de bereiding van zowel opus eiextract als reagentia die het DNA-schademerkpunt induceren, en voor de analyse van het DNA-schademerkpunt en xap. Deze technieken zijn aanpasbaar aan diverse methoden voor het veroorzaken van DNA-schade, waaronder 4-NQO en etoposide.

Laten we beginnen met de studie naar het DNA-schadecontrolepunt. Om de vrouwelijke kikkers subcutaan te primen, injecteer je de dorsale lymfzakken met 100 units PMSG. Wacht minimaal twee dagen na het primen en induceer vervolgens de eiafzetting door elke geprimede kikker subcutaan in de dorsale lymfzakken te injecteren met 500 units humaan choriongonadotrofine; incubeer de geïnjecteerde kikkers gedurende 14 tot 20 uur in aparte emmers met twee liter Marx-gemodificeerde Ringer-oplossing.

Haal de kikkers uit de emmers en giet de MMR-oplossing af totdat er ongeveer 100 milliliter overblijft. Breng de eitjes vervolgens over van de emmers naar een bekerglas van 250 milliliter; verwijder het gelei van de eitjes door ongeveer elke 30 seconden 100 milliliters 2% cysteïne pH 7,8 toe te voegen. Roer de eitjes voorzichtig met een omgekeerde glazen Pasteurpipet met een diameter van 0,7 centimeter, decanteer en vervang dit twee keer door verse cysteïne.

Het detailproces zal ongeveer vijf tot 15 minuten duren. Wanneer de eitjes een compactere laag vormen op de bodem van het bekerglas, wordt de cysteïne-oplossing weggegooid en worden de eitjes drie keer gewassen met 0,25 XMMR-oplossing. Roer de eitjes met een glazen pipet en controleer op gezwollen witte slechte eitjes, die zich meestal in het midden van het bekerglas ophopen.

Verwijder de slechte eieren met een pasturepipet. Was de eieren vervolgens drie keer met eilysebuffer. Verwijder eventuele overgebleven slechte eieren en giet de eieren daarna in een Falcon-buis van 14 milliliter.

Compacteer de eieren door centrifugatie gedurende 55 seconden bij 188 ×g. Verwijder met een klinische tafelcentrifuge met een swing-out rotor het overtollige pufferbuffer boven de eierlaag. Voeg nu voor elke milliliter gecompacteerde eieren 0,5 µL van 10 mg/mL aprotinine, leptine of AL en 0,5 µL van 5 mg/mL cytokine B of cyto B toe. Centrifugeer de eieren bij 16.500 ×g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Gebruik hiervoor de Sarva RC six plus super speed centrifuge met een HB six swing-out rotor. Na centrifugatie worden de eieren in de buis gefractioneerd in drie lagen: lipidextract en eigeelpigment van boven naar beneden. Puncteer de zijkant van de Falcon-buis in het onderste gedeelte van de middelste extractlaag met een naald van 21 gauge.

Verwijder de naald voorzichtig, aangezien de punctienaald door plastic kan worden belemmerd. Plaats een nieuwe 21 gauge naald, bevestigd aan een spuit van 1 mL, in de punctiesteer om het extract te verzamelen.

Zuig het extract langzaam op, waarbij luchtbellen en contaminatie met de lipiden- en dooierpigmentlagen worden vermeden. Breng de extracten over in een gekoelde microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Voeg voor elke milliliter ei-extract 10 microliters van 10 milligram per milliliter toe.

Cycloheximide, 1 µL van 10 mg/mL. Een pronin leptine, 1 µL van 5 mg/mL cytokine B, 1 µL van 1 M DTT en 0,33 µL van 10 mg/mL. Meng alles door het eiextract ten minste 10 keer voorzichtig om te keren, maar het extract op lage snelheid moet binnen vier uur worden gebruikt, omdat de kwaliteit van LSE anders in het gedrang komt.

Los na vier uur of na volledig ontdooien de twee synthetische oligonucleotiden op in water tot een concentratie van 2 µg/µL. Voeg 100 µL van elk oligo toe aan een microcentrifugebuis van 1,5 mL en incubeer dit gedurende vijf minuten in een heatblock op 95 °C. Neem de centrifugebuis met het oligo-mengsel uit de heatblock en laat deze afkoelen tot kamertemperatuur; verdeel het mengsel in aliquots van 10 µL voor bewaring bij -20 °C.

Het AL-monster is nu een A T 70-duplex met een uiteindelijke concentratie van twee µg per µL. Bereid normaal spermachromatine voor zoals beschreven door Tudor en Walter tot 0,5 mL chromatin. Voeg 5,5 µL 9,1 M MMS toe.

Plaats de monsterbuis gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een rotator met de IE CCL twee klinische centrifuge met zwaaibekerrotor en buisadapters. Centrifugeer het monster 10 minuten bij 686 ×g bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en was het pellet in 0,5 milliliters buffer X die B-S-A-D-T-T-A proin en leptine bevat.

Herhaal dit proces drie keer en resuspendeer het pellet in 0,5 milliliter Buffer x. Bepaal de concentratie van het spermachromatine met een hemocytometer.

Verdun vervolgens het monster tot 100.000 spermatozoa per µL en bewaar aliquota van 5 µL bij -80 °C. Breng de gewenste hoeveelheid normaal spermachromatine aan op het oppervlak van een stukje Parafilm en plaats het monster in een UV-crosslinker. Stel de gewenste energieparameter in en begin met het beschadigen van het spermachromatine via UV-licht.

Gebruik het met UV behandelde spermachromatine onmiddellijk om het DNA-schadecheckpoint in het bereide lagesnelheidsextract te induceren. Combineer 50 microliters LSE met één microliter energiemengsel en twee microliters beschadigd spermachromatine. Incubeer de reactie 90 minuten bij kamertemperatuur en tik elke 10 minuten tegen de buis, beginnend na ten minste 30 minuten.

Incubatie: breng één microliter van het reactiemengsel aan op een objectglas en voeg één microliter nucleaire dice-oplossing toe. Plaats een dekglas en controleer de vorming van kernen via een fluorescentiemicroscoop. Doorgaans vormen zich na 30 minuten incubatie ronde kernen, wat aangeeft dat de DNA-replicatie is gestart.

Evalueer daarnaast 10 µL van het reactiemengsel via immunoblotting met behulp van anti-check one-antilichamen. Combineer 50 µL LSE, 1 µL energiemengsel en 1,6 µL toto-mycine-stock in een microcentrifugebuisje. Voeg vervolgens 1,25 µL toe van ofwel een T 70 DNA-duplex met een concentratie van 2 µg/µL, of water voor de negatieve controle.

Incubeer de reacties 90 minuten bij kamertemperatuur en tik de reactiebuisjes elke 10 minuten aan. Voeg vervolgens 10 µL van het reactiemengsel toe aan 90 µL monsterbuffer voor western blot-analyse van check one protein. Het beschadigde spermachromatine of de DNA-beschadiging nabootsende structuur activeert effectief het door TR check one gemedieerde DNA-schadecontrolepunt in het xop-eicellextractsysteem in vergelijking met de door MMS geïnduceerde controle.

Controleer de fosforylering van Checkpoint kinase 1 op Serine 345, wat een indicator is voor de activatie van TR-kinase. Op dezelfde manier triggert een T70, als een DNA-schade-nabootsende structuur, ook de fosforylering van Checkpoint kinase 1. Zodra de methode onder de knie is, kan de LSE-preparatie in ongeveer één uur worden voltooid.

Omdat de kwaliteit van het extract na ongeveer vier uur afneemt, zijn snelheid en efficiëntie essentieel. Deze methoden kunnen worden gecombineerd met andere benaderingen om kritische vragen over de signalering van DNA-schade-checkpoints te beantwoorden. Er kan bijvoorbeeld een immunodepletie worden uitgevoerd om te testen of een doeleiwit vereist is in het DNA-schade-checkpoint.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe het D-schadecontrolepunt kan worden bestudeerd met behulp van pus-extract als modelsysteem. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.