Name: Insuline en hippocampale Microinjection In vivo Microdialyse Tijdens ruimtelijk geheugen testen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Leer hoe u intrahippocampale micro-injectie combineert met in vivo microdialyse om hippocampale metabolisme te meten tijdens ruimtelijke geheugentests bij bewuste dieren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de NIH / NIDDK (DK077106 om ECM).

1. Chirurgie Voorbereiding <ol><li> Handling. Dieren (meestal ratten of muizen, hoewel de werkwijze voor microdialyse combinatie met gedragstherapie testen is grotendeels een algemeen alle vereiste nodig species-specifieke aanpassingen, bijvoorbeeld voor anesthesie) behandeld gedurende ten minste 10 min / dag minstens twee dagen voor de operatie. Uitgebreide behandeling is aangetoond dat dieren in een ongespannen toestand te laten op het moment van testen, waarbij mogelijke verwarren 2,4,5. Wij zullen ratten gedurende dit protocol als voorbeeld soort. Behandeling moet gebeuren zonder stress veroorzaakt door te trekken op bont van bijvoorbeeld latex of nitril handschoenen: dit kan het best worden bereikt met behulp van blote handen, in overleg met de faciliteit dierenarts en gezondheid van de werknemers ambtenaren. Als dit niet mogelijk is, katoen handschoenen worden gedragen belemmering meer handschoenen te voorkomen trekken aan de ratten vacht. </li><li> Steriel Veld Voorbereiding. Voorafgaand aan chirurgie, de Surgical gebied wordt bereid, een steriel veld opgesteld rond de stereotactische inrichting en een steriele doek geplaatst over de inrichting, die een verwarmingselement dat wordt gebruikt voor rat lichaamstemperatuur. Een circulerende warm water pad nauwkeurige thermostaat gebruikt om oververhitting van het dier. </li><li> Anesthesie inductie. De isofluraan vaporizer wordt gecontroleerd niveaus van isofluraan bevatten en verbonden met de inductiekamer. Verbindingen worden gecontroleerd om een ​​gesloten lus te bevestigen. De lucht-handling vacuüm systeem wordt gecontroleerd op operationeel zijn. Isofluraan verdamping wordt ingeschakeld en de dieren geplaatst in de inductiekamer met een 5% isofluraan in zuurstof mix: dat wil zeggen, 5% isofluraan toegevoegd in een stroom van 100% zuurstof en aan de inductiekamer. </li><li> Plaatsing in apparatuur. Dieren worden vastgezet in de stereotaxisch apparaat met behulp van earbars en een tand bar. Correcte earbar plaatsing resulteert in een onbeweeglijke hoofd en oren die plat liggen langs de earbars. Dierensnel bevestigd en de neus ingebracht in een speciaal ontworpen verdoving neuskegel; levering van verdampt isofluraan omgeschakeld van de inductiekamer de neuskegel en de verdoving mix ingesteld op 2-3% isofluraan in de zuurstofstroom naar de neuskegel leveren. </li><li> Bevestiging van de anesthesie. Een chirurgische anesthesie vlak wordt bevestigd door het leveren van een harde kneep de voet en aanblazen het oog, zou een eventuele reactie veroorzaken. Deze tests worden herhaald ongeveer 15 min intervallen gedurende chirurgie om handhaving van een chirurgische anesthesie vlak bevestigen. Haar wordt uit de incisieplaats voordat ze de steriele veld. </li></ol> 2. Chirurgie <ol><li> Animal eerste behandeling. Oogzalf wordt toegepast op elke oogbal het drogen te voorkomen. 1 ml steriele zoutoplossing gegeven sc eventuele uitdroging tijdens de operatie, en het lichaam is bedekt met een steriele doek. Betadine wordt toegepast op de hoofdhuid en afgestreken van het centrumuit met een wattenstaafje, 70% ethanol wordt eveneens bemonsterd en de twee zwabberen stappen worden nog tweemaal herhaald om een ​​geschikte incisie waarborgen. Huidcontact tijd betadine en alcohol ten minste 3 min vóór insnijding. Anesthesie wordt onderhouden en regelmatig gecontroleerd gedurende chirurgie; een sc injectie van carprofen 5 g / kg) gegeven om analgesie te initiëren en aseptische techniek wordt gebruikt. Analgesie wordt gegeven na inductie van de anesthesie bij alle stress te minimaliseren van injectie. </li><li> Incisie en schedel voorbereiding. Een 3-4 cm snede sagitally gemaakt in het centrum van de schedel. Een 1:1 mengsel van bupivicaine: epinefrine wordt plaatselijk aangebracht op verdere analgesie en bloeding minimaliseren. De hoofdhuid wordt gehouden uit de buurt van de incisie met behulp van chirurgische clips en steriele swabs worden gebruikt om bovenliggende membranen te verwijderen uit de schedel. Coördinaten voor het boren worden gemeten met behulp van bregma als referentiepunt, gemarkeerd met een steriele boor (of, als alternatief, een hand-held brandijzer device), en opnieuw bevestigd op juistheid voordat u gaat boren begint. Coördinaten voor specifieke hersengebieden van belang (bijvoorbeeld hier de hippocampus) worden bepaald met een brein atlas. Voor de hippocampus microdialyse, gebruiken we een boorlocatie op 5.6 mm achter bregma, +5.0 laterale, en 3,0 ventrale dura uit. </li><li> Boren. Drie gaten geboord door de schedel, met en waarbij er slechts minimale kracht zoals die trauma aan de dura en de onderliggende membranen zeer gering of afwezig toepassing. Een gat is bij de gemeten plaats van canule inbrengen, de andere twee zijn gepositioneerd zoals geschikt voor het inbrengen van de schedel schroeven. Doel-en kleinbedrijf schroeven (bijv. 1,17 mm zelftappende schroeven; Fine Science Tools) worden ingebracht in deze gaten zonder impact op de hersenen onder, en worden gebruikt als ankerpunten voor latere tandheelkundig cement toepassing. </li><li> Canule plaatsing en sluiting. De canule is geplaatst op invoegcoördinaten, die opnieuw bevestigd de plaats van het gat geboord is,en wordt daarna langzaam verlaagd tot de gewenste diepte. Eenmaal goed geplaatst, wordt de canule vastgezet met tandheelkundig cement. Zo nodig wordt een steriele chirurgische hechtdraad gebruikt om de wond te sluiten. Een stilet wordt in de canule de doorgankelijkheid te handhaven. In dit protocol gebruiken we een CMA12 sonde en gids canule (CMA / Microdialyse). </li><li> Acute post-chirurgische zorg. 3 ml steriele zoutoplossing gegeven sc aan hydratatie gaan, een sc injectie van carprofen 5 g / kg) wordt ook gegeven aan analgesie leiden. Dieren worden uit de inrichting en in een verwarmde verkoeverkamer in een schone kooi, en gevolgd totdat zij volledig hersteld van anesthesie. Volledig herstel wordt beoordeeld door het herstel van de oprichtreflex en normale motoriek. Dieren worden vervolgens terug naar hun kooi en regelmatige deelneming kamer. </li><li> Korte-termijn follow-up zorg. Kooien van dieren die een operatie hebben ondergaan, zijn gemarkeerd met de datum van de operatie. Dieren worden ten minste eenmaal per dag gedurende minstens three dagen na de operatie, en gegeven een carprofen kauwbare tablet (2 mg) op de dag na de operatie en elk van de twee volgende dagen. Als dieren niet consumeren de carprofen, kan injecteerbaar carprofen worden gegeven aan adequate pijnstilling te garanderen. Bewaakt zowel de algehele gezondheid van het dier en de toestand van de wond (voor infectie, roodheid, etc.) naar aanleiding van de institutionele verzorging van dieren richtlijnen en het zoeken naar hulp of advies van dierenverzorgers of de dierenarts indien nodig. Belangrijker mee dat correcte verwerking en acclimatisering aan de experimentator essentieel: dieren uitgebreid behandeld, waaronder manipulatie van de canule, totdat er geen teken van nervositeit of stress blijft bij aanraking door de experimentator. </li><li> Latere dier zorg en behandeling. Dieren volgen nodige tests en euthanasie is afhankelijk van het goedgekeurde protocol en hun specifieke experimentele groep. </li></ol> 3. Microdialyse (MD) <ol><li> Perfusaten voorbereiding. Kunstmatige extracellulaire vloeistof (AECF) wordt gemaakt met 153,5 mM Na, 4,3 mM K, 0,41 mM Mg, 0,71 mM Ca, 139,4 mM Cl, 1,25 mM glucose, gebufferd bij pH 7,4 6 OPMERKING dat accurate vloeistof samenstelling van essentieel belang is:. Onjuistheden of gebruik andere, minder fysiologische vloeistoffen zoals Ringer&#39;s of PBS voor microdialyse zal leiden tot een aanzienlijke onjuiste resultaten 6. Bijzonder op dat de ionische samenstelling van de extracellulaire vloeistof (ECF) niet dezelfde als die van de CSF, Zoals blijkt uit een 2004 gedetailleerde studie van de hippocampus ECF 6. Op de testdag, bovine serum albumine (BSA) worden toegevoegd met 2% gewicht / gewicht en volledig opgelost, hierdoor verlies van peptiden, zoals insuline door naleving van de buis, en vermindert ook het risico van vloeistofverlies (ultrafiltratie) de probe membraan. Na bereiding, moet de perfusievloeistof gefiltreerd door een 0,2 um filter. </li><li> Als een behandeling zoals insuline wordt afgegeven aan de behain interessegebied (hier de hippocampus), bereid deze behandeling met een bekende hoeveelheid van het bereide AECF met de geschikte geneesmiddelconcentratie. Voor insuline, heeft een concentratie van 400 nM (66,7 μU / ul) voor levering via reverse microdialyse aangetoond hippocampale metabolische, cognitieve functie 7 beïnvloeden. Merk op dat de resulterende weefselconcentratie van insuline wordt hier gemeten en blijft onbekend. </li><li> Het opzetten van mD sonde en lijnen. Maak een frisse microdialyse probe en lijn de dag voorafgaand aan het testen. Maak twee afzonderlijke lijnen voor &quot;instroom&quot; en &quot;uitstroom&quot;. Gebruik PE50 buis twee 1 meter lange stukken FEP buis sluiten en dat er een minimale dode ruimte tussen de lijnen zorgen. Sluit de instroom slang een 1 ml Hamilton spuit met steriel gefiltreerd, gedeïoniseerd H 2 0 (dH 2 0) en vervolgens aan de probe. </li><li> Microdialyse draaibaar. Om het vrije verkeer van dieren tijdens het gebruik van metingen, sluit een vloeistof draaibare op de inFlow en uitstroom lijnen, dicht bij de pomp, met behulp van extra FEP buis. Vergeet het inwendige volume van de draaibare slang en rekening gezien in timing van de bemonstering (hieronder). </li><li> Het opzetten van mD pomp. Zet de mD pomp en draaien op 1,5 pl / min tot u dH 2 0 het verlaten van de uitlaatbuis op de sonde. Dan, terwijl de pomp wordt uitgeschakeld, sluit u de andere lijn tussen de uitstroom buis en een monstername buis. Run 5 ml door de buis en plaats de sonde in een injectieflacon met steriel dH 2 0 &#39;s nachts, ervoor te zorgen dat de sonde altijd nat blijft. </li><li> Pre-indringende proefpersoon. 24 uur vóór de proef verwijderen dummy stylet van het hoofd van de rat en plaats een mD probe (alleen voor dit doel niet voor bemonstering) gedurende 10 minuten. Vervang vervolgens de dummy stilet en zet de rat in zijn kooi. Deze procedure is bedoeld om enig effect van reactieve gliosis minimaliseren de testdag 8 en in onze handen, geeft dit een goede results die passen gegevens van andere technieken en lijken hippocampus activatie 2,5,7,9 weerspiegelen; anderen gebruikt een soortgelijke benadering dat de sonde laat in plaats gedurende 24 uur vóór de meting, die ook een goede benadering indien schade aan de probe overnacht worden vermeden. </li><li> Probe evenwicht. Op de dag van microdialyse, vul de Hamilton spuit en scintillatievat met gefilterd AECF en pompen door equilibreren gedurende 1 uur. Indien nodig vult een tweede Hamilton spuit met bereid behandeling (bijvoorbeeld insuline-AECF) en plaats in de injectiepomp. </li><li> Probe inbrengen. Wanneer evenwicht is voltooid, verwijdert u de dummy stilet en voorzichtig de geëquilibreerde mD sonde in de hersenen van de rat via de canule. Plaats de rat in een doorzichtige plastic doos die een deel van het huis van de rat beddengoed bevat. Zorg ervoor dat als tegenwicht voor de buis: een 1,6 ml microcentrifuge buis gevuld met water om de slang buiten de kooi op een zodanige wijze dat de zwaartekracht de microdi houdt bevestigenALYSE lijnen unkinked, maar niet strak. Laat equilibreren probe in rat gedurende 2 uur. Aan het begin van deze periode, bevestigen dat de stroom van perfusaat wordt gedeblokkeerd: dit is het gemakkelijkst door het verzamelen van perfusaat uitstroom over een bepaalde periode en een gewicht van het monster te bevestigen dat de verwachte volume wordt het systeem verlaten. Elke sonde die opbrengsten &lt;90% van de verwachte volume, en niet zichzelf te corrigeren na het verwijderen en opnieuw invoegen, moet worden vervangen (anders oedeem op de sondepunt zal resulteren). Als de stroom is aanhoudend laag of afwezig is, controleert u alle aansluitingen op lekkage, bij gebreke daarvan, slangen los te koppelen in fasen om te zien of de blokkade kan worden geïsoleerd. Als het probleem niet is geïdentificeerd, vervang dan de sonde, als het probleem niet is opgelost, kan het nodig zijn om opnieuw te beginnen met nieuwe sonde en lijnen uit paragraaf 3.3. De twee uur equilibratie periode staat de bloed-hersenbarrière verzegelt rond de sonde en voorkomen van acute effect probe insertie. </li><li> Monsters. Zorg ervoor dat de correlation tussen monster dialyse (van hersenen) en inzameling (in buis) wordt nauwkeurig berekend. Bijvoorbeeld met gebruikmaking van twee meter FEP buizen tussen draaibare probe er een totaal volume tussen probe en verzameling van 30 pl en daarom duurt 20 minuten bij 1,5 ul / min debiet voor monster om door de probe, slangen, connectors en draaien aan het einde van buis bereiken collectie. Bij het verzamelen van monsters ervoor te zorgen dat u voldoende volume om de concentratie nodig is voor uw assays hebben te verzamelen. Hier zullen we gebruik maken van 5 min sample bakken, en dus verzamel 7,5 ul van dialysaat in elke collectie buis. </li><li> Beginstalen. Zodra evenwicht is voltooid, begint monstername. Verzamel tenminste drie monsters terwijl de rat in rust in het huis kamer voor een stabiel basislijn metingen </li><li> Behandeling timing. Zorg ervoor dat benodigde timing voor aanvang van de behandeling te berekenen voorafgaand aan het experiment: onthoud dat net zoals er een tijdsverschil tussen dialyseen monsterverzameling is er een vertraging (gewoonlijk identiek) tussen perfusaat waarbij de spuit en aankomen op hippocampus het dier. Vandaar dat in onze setup met een 30 ul volume tussen spuit en sonde, wijzigt u de spuit aan die met de behandeling perfusaat 20 min voordat u de behandeling te beginnen met aankomst op de hippocampus wensen. </li><li> Veranderen van spuiten. Een vloeistof schakelaar kan worden gebruikt indien gewenst, maar is niet nodig: op het juiste moment, koppelt de instroom lijn van de controle-perfusaat spuit en snel verbinding te maken met de behandeling-perfusaat spuit. Dit duurt niet meer dan 5 sec tot wezenlijke onderbreking te voorkomen dat de perfusaat flow. Rekening mee dat dit proces moet worden teruggedraaid nadat de gewenste dosering is geleverd, als een in de tijd beperkte levering van de behandeling gewenst is. Alternatief kan de behandeling tot de bemonsteringsduur (zie figuur 2). Luchtbellen niet worden opgenomen in de lijn tijdens schakeling vanspuiten, deze kunnen verzamelen op de dialysemembraan en verminderen probe efficiency. </li><li> Behavioral testen. Als het uitvoeren van een gedrags-taak, volgt u deze procedure (zie punt 4 hieronder). NOTA VAN dat de coördinatie met de levering van de behandeling aan de hippocampus belangrijk is. Zo moet toediening van insuline worden getimed tot 10 minuten voor het begin van het testen van 10 optreden. Daarom moet de omschakeling naar een insuline-bevattende perfusaat optreden 30 minuten voorafgaand aan gedrags-testen (20 min voor perfusaat om door de lijnen plus 10 min gewenste levertijd vooruit testen). </li><li> Voltooiing van monstername. Na het verzamelen van de gewenste monsters, verwijder voorzichtig de sonde van het hoofd van het dier, wederom rekening houdend rekening te houden met vertraging tussen dialyse en monstername. Keer terug het dier naar zijn kooi en observeer de voet voor een post-experimentele verandering in gezondheid of zijn gedrag totdat het dier wordt gedood en de hersenen verwijderd om te bevestigen juistesonde plaatsing. Als offer niet onmiddellijk optreden, de terugkeer van de dummy stilet om de canule aan een introductie van vreemd materiaal te vermijden. </li><li> Analysis. De analysemethode afhankelijk van de analyt (en) van belang. Omdat dialyse sampling niet voor volledige analyt equilibreren bij de probe membraan moet monsterconcentraties worden gecorrigeerd ECF gebruikmaking van de zero-net-flux methode 11,12 geven. </li></ol> 4. Behavioral Testen <ol><li> Plaatsing op doolhof. Na basislijn monsters (dat wil zeggen, na ten minste drie monsters hebben afgerond dialyse, maar kan nog steeds in de uitstroom buis worden verzameld), beweeg de rat in de gedrags-testapparatuur. Passende taak kan worden gebruikt, de gegevens in figuur 1 werden verzameld met een vierarmig plus maze-vormige en het meten spontane afwisseling, die een maat is van ruimtelijke werkgeheugen: de rat wordt eerst geplaatst in de center van het doolhof en vrij kunnen 9,13 verkennen. Omdat elke gedrags test mogen worden gebruikt, de focus van dit protocol is niet op de specifieke taak gebruikt als een voorbeeld (dat elders 9,14,15 gedetailleerd), maar in het kort, zijn dieren toegelaten tot de doolhof te verkennen (de periode van het grijze vierkant in figuur 1) en gebruik hippocampally-afhankelijke processen geheugen waarvan armen behouden onlangs zijn bezocht. </li><li> Dialyseslang beweging tijdens het testen. Houd de slang zodat hij vrij kan bewegen, noch belemmeren de rat beweging of te mogen bewegen voor het dier en het af te leiden. Verblijf in plaats en het minimaliseren van uw eigen beweging, zodat u niet van invloed op de rat gedrag. </li><li> Vervolg monstername. Zoals tijdens de basislijn verplaatst u de uitstroom slang aan op een nieuwe collectie buis om de 5 minuten. </li><li> Afwisseling testen. Het dier zich vrij verkennen het doolhof gedurende 20 minuten. Noteer de volgorde en timing van de arm entries met gebruikmakingeen video-opname of met de hand voor latere taakuitvoering analyse 9,15. </li></ol> 5. Post-testen <ol><li> Eindmonster collectie. Na het testen, verwijder voorzichtig rat uit doolhof en terug te keren naar de kamer te controleren. Ga verder microdialyse monstername voor ten minste vier monsters aan de periode van het herstel van de taakuitvoering te dekken. </li><li> Probe verwijderen. Nadat alle monsters zijn verzameld, verwijder voorzichtig de sonde van het hoofd van het dier en breng het in een opslag flacon, de terugkeer van de dieren naar de kooi. </li><li> Probe opslag. Na terugkomst dier naar de kooi en het invullen van verzameling van alle resterende dialysaat, spoel de sonde met dH 2 0 en op te slaan in een scintillatieflesje gevuld met dH 2 0 en bedekt met parafilm. Spoel de slang door naar een spuit met een oplossing van 1:10.000 Kathon in dH 2 0 microben groei te voorkomen. Probes kunnen opnieuw worden gebruikt mits zij goede doorstroming en hebbengeen schade aan het membraan, met zorg deze regelmatig worden dan tien toepassingen. </li><li> Histologie. Dood het dier en verwijder de hersenen. Plak op een cryostaat en gebruik van standaard histologische technieken (bijv. cresyl violet kleuring) om de juiste plaatsing probe bevestigen. </li></ol>

<ol><li>McNay, E. C., Fries, T. M., Gold, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreases+in+rat+extracellular+hippocampal+glucose+concentration+associated+with+cognitive+demand+during+a+spatial+task%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Decreases in rat extracellular hippocampal glucose concentration associated with cognitive demand during a spatial task.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (6), 2881(2000).</li>
<li>McNay, E. C., Gold, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+differences+in+hippocampal+extracellular+fluid+glucose+concentration+during+behavioral+testing+and+following+systemic+glucose+administration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gerontol.+A.+Biol.+Sci.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Age-related differences in hippocampal extracellular fluid glucose concentration during behavioral testing and following systemic glucose administration.</a> J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 56 (2), 66(2001).</li>
<li>McNay, E. C., McCarty, R. C., Gold, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+in+brain+glucose+concentration+during+behavioral+testing%3A+dissociations+between+brain+areas+and+between+brain+and+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Learn.+Mem%22%5BJournal%5D)">Fluctuations in brain glucose concentration during behavioral testing: dissociations between brain areas and between brain and blood.</a> Neurobiol. Learn. Mem. 75 (3), 325(2001).</li>
<li>McNay, E. C., Gold, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+glucose+concentrations+in+the+rat+hippocampus+measured+by+zero-net-flux%3A+effects+of+microdialysis+flow+rate%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Extracellular glucose concentrations in the rat hippocampus measured by zero-net-flux: effects of microdialysis flow rate.</a> 72 (2), 785(1999).</li>
<li>McNay, E. C., Sherwin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+recurrent+hypoglycemia+on+spatial+cognition+and+cognitive+metabolism+in+normal+and+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Effect of recurrent hypoglycemia on spatial cognition and cognitive metabolism in normal and diabetic rats.</a> Diabetes. 53 (2), 418(2004).</li>
<li>McNay, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+memory+processes+are+modulated+by+insulin+and+high-fat-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 93 (4), 546(2010).</li>
<li>McNay, E. C., McCarty, R. C., Gold, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+in+brain+glucose+concentration+during+behavioral+testing%3A+dissociations+between+brain+areas+and+between+brain+and+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+%26+Memory%22%5BJournal%5D)">Fluctuations in brain glucose concentration during behavioral testing: dissociations between brain areas and between brain and blood.</a> Neurobiology of Learning & Memory. 75 (3), 325(2001).</li>
<li>McNay, E. C., Williamson, A., McCrimmon, R. J., Sherwin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+and+neural+hippocampal+effects+of+long-term+moderate+recurrent+hypoglycemia%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Cognitive and neural hippocampal effects of long-term moderate recurrent hypoglycemia.</a> Diabetes. 55 (4), 1088(2006).</li>
<li>McNay, E. C., Sherwin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+artificial+cerebro-spinal+fluid+%28aCSF%29+to+artificial+extracellular+fluid+%28aECF%29%3A+microdialysis+perfusate+composition+effects+on+in+vivo+brain+ECF+glucose+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">From artificial cerebro-spinal fluid (aCSF) to artificial extracellular fluid (aECF): microdialysis perfusate composition effects on in vivo brain ECF glucose measurements.</a> Journal of Neuroscience Methods. 132 (1), 35(2004).</li>
<li>McNay, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+memory+processes+are+modulated+by+insulin+and+high-fat-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 93 (4), 546(2010).</li>
<li>Benveniste, H., Drejer, J., Schousboe, A., Diemer, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+cerebral+glucose+phosphorylation+and+blood+flow+after+insertion+of+a+microdialysis+fiber+through+the+dorsal+hippocampus+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Regional cerebral glucose phosphorylation and blood flow after insertion of a microdialysis fiber through the dorsal hippocampus in the rat.</a> Journal of Neurochemistry. 49 (3), 729(1987).</li>
<li>Benveniste, H., Diemer, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+reactions+to+implantation+of+a+microdialysis+tube+in+the+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Cellular reactions to implantation of a microdialysis tube in the rat hippocampus.</a> Acta Neuropathologica. 74 (3), 234(1987).</li>
<li>McNay, E. C., Fries, T. M., Gold, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreases+in+rat+extracellular+hippocampal+glucose+concentration+associated+with+cognitive+demand+during+a+spatial+task%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Decreases in rat extracellular hippocampal glucose concentration associated with cognitive demand during a spatial task.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2881(2000).</li>
<li>McNay, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+memory+processes+are+modulated+by+insulin+and+high-fat-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Hippocampal memory processes are modulated by insulin and high-fat-induced insulin resistance.</a> Neurobiol. Learn Mem. 93 (4), 546(2010).</li>
<li>Lonnroth, P., Jansson, P. -A., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microdialysis+method+allowing+characterization+of+intercellular+water+space+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">A microdialysis method allowing characterization of intercellular water space in humans.</a> American Journal of Physiology. 1987, E228(1987).</li>
<li>McNay, E. C., Gold, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+glucose+concentrations+in+the+rat+hippocampus+measured+by+zero-net-flux%3A+effects+of+microdialysis+flow+rate%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Extracellular glucose concentrations in the rat hippocampus measured by zero-net-flux: effects of microdialysis flow rate.</a> 72 (2), 785(1999).</li>
<li>Lalonde, R. obert <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurobiological+basis+of+spontaneous+alternation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+%26+Biobehavioral+Reviews%22%5BJournal%5D)">The neurobiological basis of spontaneous alternation.</a> Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 26 (1), 91(2002).</li>
<li>Richman, C., Dember, W., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+alternation+behavior+in+animals%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Psychology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous alternation behavior in animals: A review.</a> Current Psychology. 5 (4), 358(1986).</li>
<li>McNay, E. C., Canal, C. E., Sherwin, R. S., Gold, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+memory+with+septal+injections+of+morphine+and+glucose%3A+effects+on+extracellular+glucose+levels+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Modulation of memory with septal injections of morphine and glucose: effects on extracellular glucose levels in the hippocampus.</a> Physiol. Behav. 87 (2), 298(2006).</li>
<li>McNay, E. C., Gold, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+modulation+across+neural+systems%3A+intra-amygdala+glucose+reverses+deficits+caused+by+intraseptal+morphine+on+a+spatial+task+but+not+on+an+aversive+task%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Memory modulation across neural systems: intra-amygdala glucose reverses deficits caused by intraseptal morphine on a spatial task but not on an aversive task.</a> Journal of Neuroscience. 18 (10), 3853(1998).</li>
<li>Rex, A., Bert, B., Fink, H., Voigt, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-dependent+changes+of+extracellular+glucose+in+the+rat+hippocampus+determined+by+in+vivo+microdialysis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Stimulus-dependent changes of extracellular glucose in the rat hippocampus determined by in vivo microdialysis.</a> Physiol. Behav. 98 (4), 467(2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Alle oplossingen in microdialyse onmiddellijk worden gefilterd voor gebruik met behulp van een 0,2 um filter. Na het inbrengen van de sonde in de geleiding canule in acht om te bevestigen dat stroom wordt gehinderd en monstername plaatsvindt. Als de stroom stopt na het inbrengen, de meest waarschijnlijke oorzaak van schade aan de probe membraan veroorzaakt door onvoldoende zorg bij het insteken, en een nieuwe sonde moet worden vervangen. Zoals hierboven opgemerkt, is een belangrijk voordeel ...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> De meeste reagentia zijn standaard laboratoriumkwaliteit en kunnen worden verkregen uit een leverancier van keuze. Evenzo kan apparatuur zoals spuit pompen en slangen worden gebruikt van elk van verschillende fabrikanten. Specifieke items die hier gebruikt waarvoor gegevens zijn van belang: </td></tr><tr><td> CMA 12 microdialyse probes </td><td> CMA / Microdialyse </td><td> CMA-12-XXX </td><td> Deze zijn verkrijgbaar in diverse lengtes en cutoffs membraan, aangegeven met specifieke codes in de &quot;XXX&quot;. </td></tr><tr><td> Humane insuline (Humuline) </td><td> Eli Lilly </td><td> N / a </td><td></td></tr><tr><td> Liquid draaibare </td><td> Instech </td><td> 375/D/22QM </td><td> Dit specifieke swivel zeer lage torsie en interne volume, en een nonreactive kwarts voering. </td></tr></tbody></table>

insuline en hippocampale microinjection<em&gt; in vivo</em&gt; microdialyse tijdens ruimtelijk geheugen testen

Hippocampal Insulin Microinjection and In vivo Microdialysis During Spatial Memory Testing

Glucose metabolisme is een nuttige marker voor lokale neurale activiteit, die de basis vormen van de methoden zoals 2-deoxyglucose en functionele magnetische resonantie beeldvorming. Het gebruik van dergelijke methoden in diermodellen vereist anesthesie en dus zowel verandert de hersenen staat en voorkomt gedragsmaatregelen. Een alternatieve methode is het gebruik van in vivo microdialyse om de continue meting van de hersenen extracellulaire concentraties van glucose, lactaat en verwante metabolieten in wakker ongebreidelde dieren nemen. Deze techniek is bijzonder nuttig in combinatie met taken om zich op specifieke hersengebieden en / of acute farmacologische manipulatie, bijvoorbeeld hippocampus metingen tijdens een ruimtelijk werkgeheugen taak (spontane afwisseling) tonen een dip in extracellulair glucose en lactaat stijging die die wijzen op verhoogde glycolyse 1,2 en intrahippocampale toediening van insuline zowel verbetert het geheugen en verhoogt de hippocampus glycollyse 3. Stoffen zoals insuline kan worden geleverd aan de hippocampus via dezelfde microdialyse probe gebruikt om metabolieten te meten. Het gebruik van spontane afwisseling als maat hippocampus functie is ontworpen om beschamen vermijden stressvolle motivators (bijv. voetschok), fixeren, of beloningen (bijvoorbeeld voeding), die zowel taakuitvoering en metabolisme te veranderen, deze taak ook een meten van motorische activiteit die controle mogelijk maakt voor niet-specifieke effecten van de behandeling. Samen deze methoden tot directe meting van de neurochemische en metabole variabelen regelgedrag.

Ratten moeten snel herstellen van een operatie en wees alert, beweeglijk en actief binnen de 30 minuten na beëindiging van de anesthesie. Het effect van de canule kap moet minimaal indien de ingreep wordt uitgevoerd schoon en minimale tandheelkundig cement. Als een teken van infectie wordt opgemerkt tijdens de post-operatieve monitoring, of de rat is op geen enkele manier tekenen van nood of ongemak, onmiddellijk te beëindigen het experiment, dit zou moeten zijn uiterst zeldzaam. Tijdens de behandeling voorafgaand aan d...

Modulatie van hippocampally-afhankelijke ruimtelijk werkgeheugen door middel van directe intrahippocampale micro-injectie, begeleid en gevolgd door<em&gt; In vivo</em&gt; Microdialyse voor metabolieten in bewuste, gedragen dieren.

Insuline en hippocampale Microinjection<em&gt; In vivo</em&gt; Microdialyse Tijdens ruimtelijk geheugen testen

Glucosemetabolisme is een nuttige marker voor lokale neurale activiteit en vormt de basis voor methoden zoals 2-deoxyglucose en functionele magnetische resonantie...

Het algemene doel van deze procedure is om het metabolisme in de hippocampus te meten tijdens gedragstesten. Dit wordt bereikt door een geoefend dier chirurgisch voor te bereiden met een microdialysekannule. Op de dag van de test wordt een microdialyseprobe in de kannule ingebracht en wordt de flow van de PERFUSE acht bevestigd.Vervolgens krijgt de probe de tijd om te equilibreren terwijl het dier in een controlekamer verblijft. Ten slotte worden passende analytische methoden toegepast, bijvoorbeeld een glucose-oxidase, NADP, N-A-D-P-H reactie en fluorimetrische analyse. Indien de glucosemeting wordt gebruikt om het niveau van het metabolisme en/of de neurochemische afgifte gedurende de testperiode aan te tonen, is een van de meest uitdagende aspecten van deze techniek de zorgvuldigheid die vereist is bij het hanteren van de microdialysebuisjes; bovendien kauwen de dieren vaak aan de lijnen of raken deze in de knoop als er onvoldoende voorzichtigheid wordt betracht.De eerste keer dat ik hippocampale microdialyse gebruikte tijdens gedragstesten was tijdens mijn promotieonderzoek; we wilden controleren of de bestaande modellen voor de glucosevoorziening feitelijk verenigbaar waren me

hippocampal-insulin-microinjection-vivo-microdialysis-during-spatial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Source: Provenzano, G., et al. Immunohistochemical Visualization of Hippocampal Neuron Activity After Spatial Learning in a Mouse Model of Neurodevelopmental Disorders. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates immunohistochemical imaging to visualize hippocampal neuronal activation. Stained brain sections reveal darker regions under a bright-field microscope, indicating activated neurons.

Imaging Hippocampal Neuronal Activation In Mouse Brain Sections

MicroRNA een belangrijke rol spelen in hersenstructuur en functie. Hier beschrijven we een methode om hippocampus miRNA dwingen over-expressie met behulp van stereotactische injectie van een aangelegde miRNA-expressie lentivirus. Deze benadering kan dienen als een relatief snelle manier om te...

Stereotactische injectie van MicroRNA expressie Lentivirussen om de muis Hippocampus CA1 regio en Evaluatie van de Behavioral Outcome

Het doel van dit protocol is om ruimtelijke cognitie bij knaagdieren te onderzoeken. Het double-H waterlabyrint is een nieuwe test, die bijzonder nuttig is om de verschillende componenten van leren, consolidatie en geheugen, evenals de interactie van geheugensystemen, te verduidelijken.

De Double-H Maze: een robuuste Behavioral Test voor leren en geheugen in Knaagdieren

We beschrijven een immunohistochemie protocol om het profiel van de hippocampus neuron activering studeren na blootstelling aan een ruimtelijke leertaak in een muismodel gekenmerkt door cognitieve tekorten van neurologische oorsprong. Dit protocol kan worden toegepast op zowel genetische of farmacologische muismodellen gekenmerkt door cognitieve tekorten.

Immunohistochemische Visualisatie van hippocampus Neuron activiteit na Ruimtelijke Leren in een muismodel van Neurodevelopmental Disorders

Terwijl multifotonenbeeldvorming alleen effectief is op beperkte diepten van het weefseloppervlak, is het mogelijk om via pCLE op elke diepte beeldvorming met een resolutie van 3 μm te bereiken. Hier presenteren we een protocol om pCLE-beeldvorming uit te voeren om de microvasculaire dynamiek in de hippocampus van ictale en wildtype muizen te meten.

In vivo vezelgekoppelde preklinische confocale laserscanning-endomicroscopie (pCLE) van hippocampuscapillairen bij wakkere muizen

Deze methode beschrijft een chronische voorbereiding die optische toegang tot de hippocampus van levende muizen mogelijk maakt. Deze voorbereiding kan worden gebruikt voor het uitvoeren van longitudinale optische beeldvorming van neuronale structurele plasticiteit en activiteit-opgeroepen cellulaire plasticiteit over een periode van enkele weken.

Longitudinale Two-photon beeldvorming van dorsale Hippocampal CA1 in levende muizen

Dit artikel presenteert experimentele procedures voor het beoordelen van geheugenstoornissen bij pilocarpine-geïnduceerde epileptische muizen. Dit protocol kan worden gebruikt om de pathofysiologische mechanismen van epilepsie-geassocieerde cognitieve achteruitgang te bestuderen, wat een van de meest voorkomende comorbiditeiten bij epilepsie is.

Beoordeling van de geheugenfunctie bij pilocarpine-geïnduceerde epileptische muizen

Het hier gepresenteerde protocol geeft informatie over de gelijktijdige elektro-encefalografie (EEG) en gedragsbeoordeling in realtime. We hebben alle stappen in dit protocol besproken als een aantrekkelijke oplossing voor onderzoekers op vele gebieden van de neurowetenschappen, met name op het gebied van leren en geheugen.

Gelijktijdige monitoring van draadloze elektrofysiologie en geheugengedragstest als een hulpmiddel om hippocampale neurogenese te bestuderen

Dit artikel is bedoeld om een systematisch protocol te beschrijven om horizontale hippocampale hersenplakken bij muizen te verkrijgen. Het doel van deze methodologie is om de integriteit van hippocampale vezelroutes te behouden, zoals het perforantpad en het bemoste vezelkanaal om deukende gyrusgerelateerde neurologische processen te beoordelen.

Horizontale Hippocampal Plakjes van de Hersenen van de Muis

Dit artikel demonstreert de voorbereiding van een op maat gemaakt beeldvormingsvenster aangevuld met infusiekanule en de implantatie ervan op het CA1-gebied van de hippocampus bij muizen.

Craniotomie procedure voor het visualiseren van neuronale activiteiten in Hippocampus van zich gedragende muizen

Dit artikel beschrijft een methode voor chronische in vivo observatie van de rustende microglia in de hippocampus CA1 van de muis met behulp van nauwkeurig gecontroleerde chirurgie en twee-fotonenmicroscopie.

In Vivo Chronische twee-foton beeldvorming van microglia in de hippocampus van de muis

Leer hoe u intrahippocampale micro-injectie combineert met in vivo microdialyse om hippocampale metabolisme te meten tijdens ruimtelijke geheugentests bij bewuste dieren.

Insuline en hippocampale Microinjection

Meer video's verkennen