Insuline en hippocampale Microinjection

Het algemene doel van deze procedure is om het metabolisme in de hippocampus te meten tijdens gedragstesten. Dit wordt bereikt door een geoefend dier chirurgisch voor te bereiden met een microdialysekannule. Op de dag van de test wordt een microdialyseprobe in de kannule ingebracht en wordt de flow van de PERFUSE acht bevestigd.

Vervolgens krijgt de probe de tijd om te equilibreren terwijl het dier in een controlekamer verblijft. Ten slotte worden passende analytische methoden toegepast, bijvoorbeeld een glucose-oxidase, NADP, N-A-D-P-H reactie en fluorimetrische analyse. Indien de glucosemeting wordt gebruikt om het niveau van het metabolisme en/of de neurochemische afgifte gedurende de testperiode aan te tonen, is een van de meest uitdagende aspecten van deze techniek de zorgvuldigheid die vereist is bij het hanteren van de microdialysebuisjes; bovendien kauwen de dieren vaak aan de lijnen of raken deze in de knoop als er onvoldoende voorzichtigheid wordt betracht.

De eerste keer dat ik hippocampale microdialyse gebruikte tijdens gedragstesten was tijdens mijn promotieonderzoek; we wilden controleren of de bestaande modellen voor de glucosevoorziening feitelijk verenigbaar waren met de bekende psychologische gegevens over de verbetering van het geheugen door glucose. Deze methodologie stelde ons in staat om aan te tonen dat de bestaande modellen voor de glucosevoorziening in de hersenen in feite volledig onjuist waren.

Bereid het dier voor volgens de standaard chirurgische procedures, leg de schedel bloot en boor gaten voor de plaatsing van de canule. Plaats een canule op vooraf bepaalde coördinaten en laat deze vervolgens langzaam zakken tot de doeldiepte. Zodra deze correct is gepositioneerd, wordt de canule met tandheelkundig cement op zijn plaats vastgezet.

Gebruik indien nodig een steriele chirurgische hechtdraad om de wond te sluiten. Ten slotte wordt een stylet gebruikt om de doorgankelijkheid van de canule te behouden. Bereid vervolgens de PERFUSE eight voor om te gebruiken voor microdialyse.

Er moet worden opgemerkt dat een nauwkeurige vloeistofsamenstelling essentieel is voor optimale resultaten. Op de dag van de test moet bovine serum albumin BSA worden toegevoegd en volledig worden opgelost. Na bereiding moet de PERFUSE eight worden gefilterd door een 0,2 micron filter.

Bereid vervolgens de behandeling voor die aan de hersenen zal worden toegediend, indien van toepassing, met behulp van een aliquot van de bereide A ECF. Hier wordt insuline klaargemaakt voor toediening in de hippocampus. Een nieuwe microdialyseprobe en -lijn moeten de dag vóór de test worden voorbereid.

Maak twee afzonderlijke lijnen voor de instroom en uitstroom. Gebruik PE 50-slangen om twee stukken FEP-slang van één meter lang te verbinden en zorg ervoor dat er een minimale dode ruimte tussen de lijnen is. De slangen moeten worden afgeknipt zoals afgebeeld om schuine uiteinden te creëren, zodat ze gemakkelijker in de PE 50-connectoren kunnen worden ingebracht.

Verbind de inlofslang met een Hamilton-spuit van één milliliter gevuld met steriel gefilterd gedeïoniseerd water en bevestig de probe aan het andere uiteinde, zodat het dier zich vrij kan bewegen tijdens het uitvoeren van de metingen. Verbind de in- en uitlopleidingen met een twee-kanaals draaischakel (swivel). Verbind vervolgens de uitlofslang met de pomp en laat deze draaien op 1,5 µL per minuut totdat er gedeïoniseerd water uit de uitlaatbuis van de probe stroomt.

Zet de pomp uit en verbind de andere lijn tussen de uitstroombuis en een monsteropvangbuis. Laat vijf milliliter door de buis lopen en plaats de probe overnight in een vial met steriel gedeïoniseerd water, waarbij u ervoor zorgt dat de probetip altijd nat blijft. 24 uur voor de test wordt het testsubject voorbereid door de dummy-stylet te verwijderen en een microdialyseprobe in te brengen die uitsluitend voor dit doel wordt gebruikt.

Vervolgens de dummy-stijl gedurende 10 minuten vervangen en de rat terug in de kooi plaatsen. Gebruik alternatieve wijze een nieuwe probe in deze fase en laat deze op hun plaats zonder te verwijderen tot het uitvoeren van de metingen. De volgende dag.

Vul op de dag van de microdialyse de Hamilton-spuit en het scintillatiebuisje met gefilterde A ECF en laat de pomp gedurende één uur equilibreren. Vul indien nodig een tweede Hamilton-spuit met de bereide behandeling en plaats deze in de spuitenpomp. De sleutel tot succes bij deze procedure is om kalm te blijven en het dier zeer uitgebreid te hanteren.

Blijf daarom kalm, beweeg langzaam en nauwkeurig en oefen bovenal. Wanneer de equilibratie voltooid is, verwijdert u de dummy-stilet en brengt u de geëquilibreerde microdialyseprobe voorzichtig via de canule in de hersenen van de rat in. Plaats de rat in een doorzichtige plastic bak met wat van de eigen nestmaterialen van de rat.

Zorg ervoor dat de slang is uitgebalanceerd. Bevestig een microcentrifugebuisje van 1,6 milliliter gevuld met water aan de slang buiten de kooi, zodanig dat de zwaartekracht voorkomt dat de microdialyselijnen knikken, maar zonder dat ze strak komen te staan. Laat de probe en de rat twee uur lang equilibreren.

Bevestig aan het begin van deze periode dat de doorstroming van Perfuse eight niet geblokkeerd is. Doe dit door de uitstroom van PERFUSE eight gedurende een gedefinieerde periode op te vangen en het monster te wegen om te bevestigen dat het verwachte volume het systeem verlaat voordat er monsters worden verzameld. Zorg ervoor dat de correlatie tussen monstrousdialyse en monstername nauwkeurig is berekend.

Hier is er een volume van 30 µL tussen de probe en het verzamelpunt bij een snelheid van 1,5 µL per minuut. Er is een vertraging van 20 minuten vanaf het moment dat het monster het brein verlaat tot het moment van verzameling. Verzamel na de equilibratieperiode ten minste drie monsters terwijl de rat in rust is in de homecage.

Om een stabiele basislijn van metingen vast te stellen vóór de gedragstesten, moet de timing van de toediening van de behandeling aan de hersenen zorgvuldig worden gepland. In deze opstelling, waarbij zich een volume van 30 µL bevindt tussen de spuitpunt en de probe die in de hersenen van het dier wordt ingebracht, vervangen we de behandelspuit door de profuse acht behandeloplossing 20 minuten voordat de behandeling de hippocampus moet bereiken. Om de spuiten te wisselen.

Koppel simpelweg de inlaatleiding los van de controle-PERFUSE eight-spuit en sluit deze snel aan op de behandel-PERFUSE eight-spuit. Dit mag niet langer dan vijf seconden duren om onderbreking van de PERFUSE eight-stroom te voorkomen. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden geïntroduceerd die de efficiëntie op het juiste tijdstip kunnen verminderen.

Verplaats de rat na toediening van de behandeling voorzichtig naar het gekozen apparaat voor gedragstesten. Hier wordt de spontane alternatie gemeten in een kruisvormig doolhof. Laat het dier gedurende 20 minuten vrij door het doolhof verkennen.

Leg de volgorde en timing van arm Aries vast, hetzij via een video-opname of handmatig, om monsters te verzamelen. Verplaats tijdens deze periode de uitstroomslang naar een nieuwe opvangbuis. Houd de slang elke vijf minuten zo vast dat deze vrij kan bewegen.

Het mag de beweging van de rat niet belemmeren, niet voor het dier bewegen en moet stil blijven staan, zodat uw bewegingen geen invloed hebben op het gedrag van de rat. Verwijder de rat na de test voorzichtig uit het doolhof en plaats deze terug in de controlekamer. Ga door met het verzamelen van microdialysemonsters voor ten minste vier monsters om de periode van herstel na de taakuitvoering te dekken.

Nadat de gewenste monsters zijn verzameld, wordt de probe voorzichtig uit de kop van het dier verwijderd en in een bewaarbeepje geplaatst. Plaats het dier terug in de thuiskooi en observeer het nauwgezet op eventuele veranderingen in de gezondheid of het gedrag na het experiment. Spoel tot slot de slangen door over te schakelen naar een spuit met een catho-oplossing om microbiële groei te voorkomen.

Dit voorbeeld laat een taakgerelateerde daling zien van glucose in de ECF van de hippocampus. Het grijze vak stelt de tijd voor die het dier in het doolhof heeft doorgebracht. De paarse lijn toont de glucoseconcentratie in de hippocampus bij dieren zonder doolhoftesten, terwijl de rode lijn de dieren vertegenwoordigt die de spontane alternatie-taak voor de voorpoten uitvoeren.

De oranje lijn toont metingen bij dieren die de eenvoudigere versie van deze taak met drie armen uitvoerden. De veranderingen in het hippocampusgehalte aan glucose en lactaat na toediening van insuline zijn hier zichtbaar. Let op dat deze veranderingen worden waargenomen zonder enige gedragstesten, en derhalve de impact van alleen insuline onder basiscondities weerspiegelen.

Het is essentieel om kalm te blijven bij het uitvoeren van deze procedure. Ratten kunnen stress bij de onderzoeker oppikken, waardoor ze onrustig worden, wat de procedure aanzienlijk kan bemoeilijken en waarschijnlijk uw resultaten kan beïnvloeden. Deze combinatie van technieken heeft een nauwkeurig neurochemisch onderzoek van gedragsprocessen mogelijk gemaakt.

Vergelijkbare technieken worden nu ook bij menselijke patiënten toegepast. Zo kunnen patiënten met epilepsie, bij wie elektroden zijn geïmplanteerd om de focus van de insulten te lokaliseren, ook microdialysecannules geïmplanteerd krijgen om metabole metingen mogelijk te maken.