Name: Passage TINTEN menselijke embryonale stamcellijnen-lijnen met trypsine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-10-12T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Leer de standaardmethode voor het passeren van HuES menselijke embryonale stamcellijnen met trypsine. Dit protocol behoudt gezonde, ongedifferentieerde en karyotypisch normale culturen voor betrouwbaar stamcelonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Algemeen We raden aan het ontdooien niet meer dan een monster op een gegeven moment om eenvoudige bediening zorgen. De handler moet ervoor zorgen niet te laten culturen op kamertemperatuur en een lage CO2 voor langere tijd. Alle centrifugeren van levende cellen gebeurt op 500 tot 600 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. MEF (muis embryonale cellen Feeder) <ol><li> Pre-warm MEF media tot 37 ° C. Verwijder de MEF flacon van -80 ° C en onmiddellijk onder water de onderste helft van de buis in een 37 ° C waterbad. Het duurt ongeveer 30-45 seconden voordat de cellen zijn 80% ontdooid (klein links diepvries gedeelte). </li><li> Snel de buis te brengen om de laminaire flow kap, spray neer met 70% alcohol, en overdracht cellen voorverwarmde media. </li><li> Aspireren van de gelatine-oplossing van borden eerder voorbereid. </li><li> Aliquot 2 ml van MEF oplossing in een druppelsgewijs wijze in elk van de zes waterputten. Zorg ervoor dat u gelijkmatig te verdelen over de MEF de put. De datum waarop de MEF plaat, en plaats in een 37 ° C incubator &#39;s nachts te laten MEFs te hechten aan bord. </li><li> Na 6 uur MEFs zal worden gehecht aan de plaat. Het is het beste om te gebruiken MEF platen 24-48 uur na plating. Gebruik GEEN een MEF plaat die meer dan 4 dagen oud. </li><li> Pre-warme tinten media en 0,05% trypsine / EDTA tot 37 ° C onder de motorkap, prelabel een steriele 50 ml conische buis. </li><li> Zorgvuldig aspireren de tinten media van de cultuur te worden gesplitst. Voorzichtig Was de putjes met 2 ml 1X fosfaat-gebufferde oplossing (PBS) per well. Zuig het PBS. Voeg 0,75 ml 0,05% trypsine / EDTA naar de waterput. </li><li> Vervanging van het deksel, en observeer de cellen onder 4x vergroting. De MEF rond de tinten koloniën moet beginnen terug te trekken. Wanneer de MEF voldoende zijn afgerond en de grenzen van de tinten kolonies zijn ruwe, terug de plaat aan de kap. Dit proces duurt ongeveer 5 minuten, absoluut niet langer dan 10 minuten of je cellen niet opnieuw groeien. </li><li> Voorzichtig pipet op en neer, het wassen van de bodem van de put, tot de MEF monolaag volledig vrijstaande (monolaag is kleverig en kan blijven in een stuk). </li><li> Breng de celsuspensie om een ​​50 ml conische buis met aanvullende TINTEN media. Spin de buis van de cellen 500xg voor 5 minuten, Aspireer uit de media, wees niet naar de cel pellet te verstoren. </li><li> Tot op het bord op een nieuwe plaat van MEF, voeg de juiste wijze bepaald volume van de cellen om extra TINTEN media, en pipet de oplossing 5-7 keer met een automatische pipet. </li><li> Verwijder de MEF media vanuit een nieuw plaat van MEFs. </li><li> Aliquot de tinten oplossing druppelsgewijs aan elk putje, en zorg ervoor dat de druppels gelijkmatig te verdelen over de put. Zonder het schudden van de plaat, zorgvuldig de cellen &#39;s nachts terug te keren naar een 37 ° C incubator te TINTEN koloniën zaad te laten. </li><li> TINTEN cellen uit een splitsing komen moet op dezelfde manier gedragen die coming out van een dooi. </li></ol>

<ol><li>Edmond, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+bloodstream+infections+in+United+States+hospitals%3A+a+three-year+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Nosocomial bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis.</a> Clin. Infect. Dis. 29, 239-244 (1999).</li>
<li>Ramage, G., Bachmann, S., Patterson, T. F., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+multidrug+efflux+pumps+in+relation+to+fluconazole+resistance+in+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Investigation of multidrug efflux pumps in relation to fluconazole resistance in Candida albicans biofilms.</a> J. Antimicrob. Chemother. 49, 973-980 (2002).</li>
<li>Srinivasan, A., Uppuluri, P., Lopez-Ribot, J., Ramasubramanian, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+High-Throughput+Candida+albicans+Biofilm+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Development of a High-Throughput Candida albicans Biofilm Chip.</a> PLoS ONE. 6, 19036-19036 (2011).</li>
<li>Ramage, G., Vandewalle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+biofilm+formation+by+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Iberoam.+Micol%22%5BJournal%5D)">Characteristics of biofilm formation by Candida albicans.</a> Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).</li>
<li>Pierce, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+reproducible+96-well+plate-based+method+for+the+formation+of+fungal+biofilms+and+its+application+to+antifungal+susceptibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A simple and reproducible 96-well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing.</a> Nat. Protoc. 3, 1494-1500 (2008).</li>
<li>Lee, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cellular+microarray+for+high-throughput+toxicology+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cellular microarray for high-throughput toxicology assays.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 59-63 (2008).</li>
<li>Meyerhofer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+resist+films+produced+by+spinning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physics%22%5BJournal%5D)">Characteristics of resist films produced by spinning.</a> Journal of Applied Physics. 49, (1978).</li>
<li>Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+method+for+in+vitro+antifungal+susceptibility+testing+of+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).</li>
<li>Chandra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+the+fungal+pathogen+Candida+albicans%3A+Development%2C+architecture%2C+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: Development, architecture, and drug resistance.</a> Journal of Bacteriology. 183, 5385-5394 (2001).</li>
<li>Jabra-Rizk, M. A., Falkler, W. A., Meiller, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+biofilms+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Fungal biofilms and drug resistance.</a> Emerg. Infect. Dis. 10, 14-19 (2004).</li>
<li>Tobudic, S., Lassnigg, A., Kratzer, C., Graninger, W., Presterl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+activity+of+amphotericin+B%2C+caspofungin+and+posaconazole+on+Candida+albicans+biofilms+in+intermediate+and+mature+development+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Mycoses%22%5BJournal%5D)">Antifungal activity of amphotericin B, caspofungin and posaconazole on Candida albicans biofilms in intermediate and mature development phases.</a> Mycoses. 53, 208-214 (2010).</li>
</ol>

In deze video zien we hoe we routinematig passage TINTEN menselijke embryonale stamcellijnen in ons laboratorium. Efficiënte en regelmatige splitsen en passage is essentieel voor het behoud van een gezonde menselijke embryonale stamcellen lijn. Trypsine gemedieerde passage is een belangrijk voordeel van tinten cellijnen, is het echter belangrijk om niet meer dan trypsinize culturen of om een ​​groot deel van de afzonderlijke cellen tijdens de re-platting hebben.

TINTEN media 651,5 ml KO-DMEM 500 ml Penstrep 6,5 ml GlutaMAXTM 6,5 ml NEAA 6,5 ml 2-mercaptoethanol 0.5ul KO Serum Vervanging 65 ml Plasmanate 65 ml bFGF2 (10 ng / mL definitief) 0,65 ml

passage tinten menselijke embryonale stamcellijnen-lijnen met trypsine

Passaging HuES Human Embryonic Stem Cell-lines with Trypsin.

In deze video laten we zien hoe onze lab routinematig TINTEN menselijke embryonale stamcellijnen passages met trypsine. Menselijke embryonale stamcellen zijn artefacten van celkweek, en hebben de neiging om karyotypic afwijkingen te verwerven met een hoge populatie verdubbelingen. De juiste passage is essentieel voor het behoud van een gezonde, ongedifferentieerde, karyotypisch normale TINTEN menselijke embryonale stamcellen cultuur. Eerste, een groeiende cultuur wordt gewassen in PBS om de resterende media en celresten te verwijderen, dan cellen bedekt met een minimaal volume van warme 0,05% trypsine-EDTA. Trypsine is links op de cellen voor maximaal vijf minuten, dan cellen voorzichtig losgemaakt met een 2 ml serological pipet. De celsuspensie wordt verzameld en gemengd met een groot volume van tinten media, dan cellen zijn verzameld door zacht centrifugeren. Het geïnactiveerde trypsine media mengsel wordt verwijderd, en cellen opnieuw gesuspendeerd in voorverwarmde TINTEN media. Een passende verdeling ratio wordt berekend (over het algemeen 1u10-01u20), en cellen opnieuw uitgeplaat op een 1-2 dagen oude plaat met een monolaag van bestraalde muis embryonale fibroblasten feeder-cellen. De nieuw geplaatste TINTEN cultuur plaat is laat men het gedurende 48 uur, dan is de media wordt elke dag daarna. Het is belangrijk om niet naar beneden trpsinize tot een enkele celsuspensie, want dit verhoogt het risico van de invoering van karyotypic afwijkingen.

In deze video laten we zien hoe onze lab routinematig TINTEN menselijke embryonale stamcellijnen passages met trypsine.

Passage TINTEN menselijke embryonale stamcellijnen-lijnen met trypsine

In deze video demonstreren we hoe ons laboratorium routinematig HuES-humane embryonale stamcellijnen passageert met trypsine. Humane embryonale stamcellen zijn artefacten ...

passaging-hues-human-embryonic-stem-cell-lines-with-trypsin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video laat zien hoe menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) groeien op muis embryonale fibroblasten (MEF) feeder-cellen. Deel 1 van 3.

Van MEF op I Matrigel: passage hESC &#39;s in de aanwezigheid van MEFs

De differentiatie van ESC samenvalt met cel-type specifieke veranderingen in de structuur en samenstelling van het chromatine. De detectie van deze veranderingen geeft waardevolle inzichten in de mechanismen die stemcellness en celdifferentiatie te definiëren. Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) vormt een waardevolle methode om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen stamcellen differentiatie ontleden.

Chromatine immunoprecipitatie van menselijke embryonale stamcellen

Deze video laat zien hoe het handhaven van de groei van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) in de feeder cel-vrije omstandigheden en hoe je continu passage hESC' s in de feeder cel-vrije omstandigheden. Bevestiging van hESC pluripotentie gegroeid in feeder celvrije voorwaarden door immunofluorescentie microscopie is ook aangetoond. Deel 3 van 3.

Van MEF tot Matrigel 3: passage uit hESC &#39;s Matrigel op Matrigel

Karyotypering is een eenvoudige en nuttige techniek op grote schaal gebruikt voor het opsporen van genetische veranderingen. Hier beschrijven we een stap voor stap protocol voor het chromosoom verspreiden bereiding van menselijke embryonale stamcellen voor het toezicht op de chromosomale status van deze cellen behouden in cultuur.

Chromosomale Spread Voorbereiding van menselijke embryonale stamcellen voor Karyotypering

Beschrijven we een klein molecuul-gebaseerd protocol voor de differentiatie van muis embryonale stamcellen in de oligodendrocyt voorloper cellen (OPC's). Dit protocol genereert Olig2 + NG2 + OPC's met een hoge efficiëntie met 30 dagen van differentiatie. We beschrijven ook een methode om "spike" OPC's die kunnen vuren actiepotentialen genereren.

Differentiatie van embryonale stamcellen in de oligodendrocyt Voorlopers

Geregisseerd differentiatie van hESC 's in de specifieke cellen heeft gegenereerd veel belangstelling voor regeneratieve geneeskunde. Wij bieden een beknopte, stap-voor-stap protocol voor het bepalen van...

Lot in kaart brengen van menselijke embryonale stamcellen door teratoom Formation

De micro-ontleed explantaten techniek is een robuuste en betrouwbare methode voor het isoleren van proliferatieve skeletspieren cellen van jonge, volwassen of embryonale spieren als bron van skeletspieren stamcellen. Uniek, zijn deze cellen zijn klonaal ontleend aan de skeletspieren stamcellijnen gebruikt voor in vivo transplantatie te produceren.

Volwassen en embryonale skeletspier Microexplant Cultuur en isolatie van de skeletspieren Stem Cells

Dit protocol biedt een eenvoudige en efficiënte manier om humane pluripotente stamcellen (hPSC's) te propageren met behulp van alleen geconditioneerd medium afgeleid van de menselijke placenta in een met gelatine beklede schaal zonder aanvullende exogene suppletie of hPSC-specifieke synthetische substraten.

A Novel Cultuur Model for Human Pluripotent Stem Cell Voortplanting op gelatine in Placenta-geconditioneerde Media

Het genereren van cardiomyocyten uit pluripotente stamcellen in vitro biedt toegang tot grote hoeveelheden hartweefsel in vitro voor fundamentele wetenschappen en klinische toepassingen. Dit protocol gebruikt de atrialiserende factor Grem2 om zowel het aantal verkregen cardiomyocyten te verhogen als om cardiomyocyten met een atriumfenotype te genereren.

Differentiatie van atriale cardiomyocyten uit pluripotente stamcellen Met behulp van de BMP Antagonist Grem2

Deze methode kan worden gebruikt om sarcomere verkorting te onderzoeken met behulp van pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten met fluorescerende sarcomere-eiwitten.

Sarcomere Verkorting van Pluripotente Stamcel-Afgeleide Cardiomyocyten met behulp van Fluorescerende-Tagged Sarcomere Eiwitten.

Om de beperkingen te vermijden die gepaard gaan met het enzymatisch of mechanisch passeren van menselijke embryonale stamcellen (hESC's) en door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) gekweekt op feedercellen, hebben we een snelle, effectieve, kostenefficiënte methode met een hoge opbrengst ontwikkeld voor het oogsten van hESC- of hiPSC-kolonies die worden onderhouden op een voedingscellaag van menselijke voorhuidfibroblasten met behulp van EDTA-gemedieerde kkleefkracht.

Snelle, kostenefficiënte, enzymvrije passaging van menselijke pluripotente stamcellen op voedingscellen door ethyleendiaminetetra-azijnzuur-gemedieerde dis-adhesie

Leer de standaardmethode voor het passeren van HuES menselijke embryonale stamcellijnen met trypsine. Dit protocol behoudt gezonde, ongedifferentieerde en karyotypisch normale culturen voor betrouwbaar stamcelonderzoek.

Passage TINTEN menselijke embryonale stamcellijnen-lijnen met trypsine

Meer video's verkennen