Name: Glasvezel-implantatie voor chronische Optogenetic Stimulatie van hersenweefsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Leer glasvezel-implantatie voor chronische optogenetische stimulatie van hersenweefsel bij wakke, zich gedragend muizen. Deze methode minimaliseert weefselschade en biedt betrouwbare lichtafgifte voor neurowetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen bevestigen dat deze techniek oorspronkelijk beschreven door Sparta et al.., 2012 en is gemakkelijk worden aangepast voor gebruik in ons laboratorium.

* Alle materialen samen met de respectieve fabrikanten en / of leveranciers worden onder het protocol. 1. Montage van Implant <ol><li> Een mengsel van warmte hardbare epoxy glasvezel door toevoeging van 100 mg verharder 1 g hars. </li><li> Meet en snijd ongeveer 35 mm van 125 urn glasvezel met 100 micrometer kern door het scoren van het met een wig-tip carbide schrijver. Plaats de schrijver loodrecht op de glasvezel en de score in een enkele, unidirectionele beweging. Het snijden van de vezels volledig beschadigt de vezel kern. </li><li> Plaats een LC keramische ferrule met een 127 micrometer boren zich in de bankschroef, bolle zijde naar beneden gericht. </li><li> Plaats de glasvezel in de ferrule. De glasvezel moet schuiven soepel en marginaal voorbij het ​​convexe einde van de ferrule (figuur 1a). </li><li> Breng een druppel van warmte-uithardende glasvezel epoxy aan het platte uiteinde en warmte met warmte kanon tot epoxy wordt zwart. De epoxy moetVul de ring als het wordt verwarmd voor huidvorming. De epoxy moet genezen binnen ~ 1 min van constante warmte applicatie. </li><li> Verwijder alle epoxy langs de zijden van de ferrule, omdat het zal verhinderen interfacing met de koppeling. </li><li> Polish de bolle kant van de klemring met een LC glasvezel polijstschijf (FOPD) op aluminiumoxide hard vellen op het polijstkussen (figuur 1b). Maak cirkelvormige rotatie patronen en polijsten op vier cijfers in de volgende volgorde: 5, 3, 1 0,3 micrometer grit. </li><li> Snijd de glasvezel aan het platte uiteinde op de juiste lengte zodanig dat het gebied van belang gericht. De lengte kan worden bepaald met de stereotactische atlas. </li><li> Test het implantaat door deze op de laser via het snoer van hieronder beschreven. De gepolijste uiteinde van het implantaat in de huls van de koppeling en moet direct contact met de tegenoverliggende ferrule. Het implantaat moet kunnen 10 mW van lichtopbrengst behouden gemeten bij de punt van ee implantaat vezels. Een slechte implantaat een zwak brandpunt nabij het uiteinde van de glasvezel. </li><li> Bewaar de afgewerkte implantaten (figuur 1c) in schuim tot gebruik. </li></ol> 2. Montage van Fiber Optic Koppeling Cord <ol><li> Een mengsel van warmte hardbare epoxy glasvezel als hierboven. </li><li> Meet en knip de juiste lengte van 220 micrometer glasvezel met 200 pm kern door het scoren van het met een wig-tip carbide schrijver. De lengte van de vezel moet toelaten de muis vrij bewegen de behuizing maar laat de muis te kauwen door de vezel. </li><li> Plaats de glasvezel in een lengte van furcatie slang iets langer dan de optische lengte. De buis moet een binnendiameter iets groter dan de glasvezel. </li><li> Strip ~ 25mm aan de ene kant van de glasvezel en plaats deze in het metalen uiteinde van een multimode FC MM Huls Vergadering met 230 micrometer droeg totdat deze stopt. De glasvezel moet steken door de Ferrule uiteinde (figuur 2a). </li><li> Bevestig de verbinding met cyanoacrylaat (super lijm) aan het metalen uiteinde. Bedek de verbinding met een connector Boot en polijst de ferrule eindigen met een FC FOPD. Maak cirkelvormige rotatie patronen en polish op vier cijfers in de volgende volgorde: 5, 3, 1, 0,3 um grit (Figuur 2b). </li><li> Strippen en het andere uiteinde van de glasvezel in een LC keramische ring (230 pm id boring) met de bolle kant distale. Breng een druppel epoxy op het platte uiteinde en verhit tot genezen. </li><li> Polish de bolle kant van de klemring met een FC FOPD op aluminiumoxide polijsten platen zoals hierboven beschreven. </li><li> Schuif een LC ferrule huls over de bolle kant van de ferrule tot halverwege de huls. </li><li> Plaats Krimpkous over de furcatie buis en mof en warmte te beveiligen en beschermen van de verbinding (figuur 2c). </li><li> Test de koppeling door deze op de laserbron en het meten van de lichtopbrengstut door de koppeling met een spectrofotometer. Het licht verlies tussen de laser output en de gemeten koppeling uitgang mag niet meer dan 30%. </li></ol> 3. Chirurgische implantatie * Dit is een tips-only procedure. Instrumenten zijn steriel maar handschoenen hoeven niet te wijten zijn aan een constante manipulatie tussen de instrumenten en apparatuur. <ol><li> Verdoven de muis met een intraperitoneale injectie Ketamine / Xylazine mengsel 100 en 10 mg / kg met een 30-gauge naald. </li><li> Scheer de hoofdhuid met tondeuse. Veeg de hoofdhuid met 70% isopropylalcohol, gevolgd door Betasept (4% Chloorhexidine-oplossing) schoonmaken voor twee minuten, eenmaal te herhalen. </li><li> Plaats de muis in de sterotaxic rig en zet het hoofd, ervoor te zorgen dat de schedel niveau. Breng oogzalf voor de ogen tot droog en postoperatieve pijn te voorkomen. Behoud anesthesie met isofluraan vervluchtigde (1-3% verdund met zuurstof, afhankelijk van de fysiologische toestand van de mouse, die voortdurend moet worden gecontroleerd door reactie op een staart knijpen). </li><li> Maak een insnijding door de middellijn van de hoofdhuid, waardoor de schedel uit het oog banen te lambda. Verdringen bindweefsel nodig. </li><li> Gebruik Serafin klemmen te leggen dat de huid en onderhouden van een toegang tot de schedel (figuur 3a). </li><li> Etch een geruit patroon over het gehele oppervlak van de schedel met een tandheelkundige pick. Weg te wassen puin met een steriele zoutoplossing. Goed afdrogen. </li><li> Breng waterstofperoxide (3%) om de blootgestelde schedel met een wattenstaafje voor ~ 2-3 seconden aan microporiën maken. Was meerdere malen en afdrogen. Als alternatief kunnen ankers worden geschroefd in de schedel, zoals beschreven in Sparta et al.. (2012). </li><li> Nogmaals, etsen een geruit patroon in de schedel met een tandheelkundige pick en weg te spoelen vuil met een zoutoplossing. Goed afdrogen. </li><li> Met een draaiend gereedschap, een kleine boorgat craniotomie (&lt;1 mm in diameter) met een steriele boor(Geautoclaveerd) boven het gebied van belang, bepaald door de stereotactische atlas gekalibreerd bregma en lambda. Zorg ervoor dat u de dura breken of beschadigt weefsel. Wegspoelen puin en afdrogen. </li><li> Plaats de glasvezel ferrule (implantaat) in de probe houder en sluit de stereotactische arm. </li><li> Plaats het implantaat op zijn plaats direct boven het gebied van belang met het stereotactische arm (figuur 3b). Als u de optische vezel in het hersenweefsel, moet de vezel langzaam voortbewogen met een snelheid van ~ 2 mm / min. De ferrule moet rusten op de resterende schedel. </li><li> Maak een mengsel van tandheelkundig cement. Het mengsel moet een voldoende lage viscositeit om gemakkelijk passen in de schedel. Mengsel bruikbaar voor 2-4 minuten. </li><li> Met een steriele tandenstoker een dunne, gelijkmatige laag tandheelkundig cement in de schedel en op het onderste gedeelte van het implantaat. De basislaag van tandheelkundig cement omvat ten zoveel oppervlakte op de schedel alsmogelijk. Laat de tandheelkundig cement in contact komen met de huid van de muis. Dit zal leiden tot meer problemen bij het hechten en irritatie van de muis. Als het tandheelkundig cement in contact komt met de huid, laat het gedeeltelijk drogen zodat de gehele laag cement kan worden afgepeld voor setting. </li><li> Laat het dan volledig opdrogen. </li><li> Breng ook lagen van tandheelkundig cement om een kleine verhoging vormen over de schedel en rond het implantaat, waardoor elke laag volledig laten drogen (Figuur 3c). Laat ~ 3-5 mm van de bolle kant van de ferrule schoon van cement, zodat een gladde, vrij verbinding. </li><li> Hechten de hoofdhuid over de heuvel van tandheelkundige cement en rond het implantaat met steriele, voor eenmalig gebruik zijde gevlochten hechtdraad (6-0) met een C22 naald. Verwijder na 7 dagen. Optioneel: Gebruik Vet Bond voor extra binding na het hechten. Zorg ervoor dat u minimaal Vet Bond te gebruiken. Teveel kan leiden tot ernstige beschadiging van de huid als gevolg van krabben. </li><li> ONMIDDELLIJKy na de operatie moet muis subcutaan worden geïnjecteerd met Ketprophen (5 mg / kg) om postoperatieve pijn te verminderen. Dit zou 24 uur later herhaald. Topische toepassing analgetica (Bupivicaine) en antibiotica (Neosporin) gehecht aan de huid en rond de basis van het implantaat. </li><li> Plaats de muis in een kooi boven een verwarming deken voor het herstel van anesthesie. Plaats de muis in een steriele, postoperatief herstel kooi. Het herstel kooi mogen geen beddengoed om de temperatuur te behouden en stikken. De muis kan worden teruggegeven aan de oorspronkelijke kooi of een nieuwe kooi een keer wakker. </li></ol> Juiste assemblage van de optische implantaat en koppeling resulteert in een minimale foton verlies tussen de lichtbron en het einde van de glasvezel in het gebied van belang. Goed gepolijste glasvezel moet zenden licht in een uniform, concentrische cirkel (figuur 2d). Met een zorgvuldige implantatie en hechten, het implantaat veroorzaakt geen zichtbare irritatie aande muis en kan ter plaatse blijven voor langdurige studies (figuur 3d,&gt; 1 maand ongepubliceerde waarnemingen) zonder significante afbraak van de glasvezel of de hoeveelheid doorgelaten licht. Onjuiste implantatie of hechten kan irritatie en kan resulteren in de muis krassen door de hoofdhuid, waardoor de tandheelkundig cement, of breuk van de flensbus van de tandheelkundig cement door persistent manipulatie. Een schematisch diagram van het samengestelde systeem kan worden gezien in figuur 4. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig1.jpg" /> Figuur 1. Montage van implanteerbare glasvezel. (A) De glasvezel wordt in de ferrule, iets uitsteekt voorbij de bolle kant aangegeven door de pijlpunt. (B) de bolle kant van de ring wordt gepolijst met een FOPD op steeds fijnere soorten vellen polijsten. (C) De afgewerkte implanteerbare vezel optic. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50004/50004fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig2.jpg" /> Figuur 2. Montage van glasvezel koppeling gebruikt om de ketting glasvezel afdichting aan het implantaat. (A) Glasvezel steken door de ferrule montage. (B) De ferrule zijde van het samenstel wordt ingebracht in de FOPD en gepolijst met steeds fijnere soorten polijstpapier. (C) De ferrule huls is aangebracht over de ferrule en vastgezet met krimpkous. (D) De afgewerkte glasvezel koppeling moet produceren een concentrische licht met minimale foton verlies. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig3.jpg" /> Figuur 3. Chirurgische implantatie van de glasvezel. (A) Het gehele oppervlak van de cranium wordt blootgesteld en bindweefsel wordt gewist. (B) De glasvezel implantaat in positie wordt gehouden met de stereotactische arm. (C) Dental cement wordt toegepast vaststelling van de glasvezel implantaat aan de schedel. (D)&gt; 1 maand na implantatie, is de huid genezen is rond het implantaat en er zijn geen tekenen van irritatie. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig4.jpg" /> Figuur 4. Schematische weergave van de functionele systeem

<ol><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Light-Induced+Activation+of+Neural+Circuitry+in+Trangenic+Mice+Expressing+Channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54, 205-218 (2007).</li>
<li>Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 165-16 (2010).</li>
<li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li>
<li>Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+and+imaging+technologies+for+circuit+based+neuroanatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy.</a> Nature. 461, 900-907 (2009).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits%3A+technology+for+probing+mammalian+brain+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).</li>
<li>Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+substrates+of+awakening+probed+with+optogenetic+control+of+hypocretin+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons.</a> Nature. 450, 420-424 (2007).</li>
<li>Sparta, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).</li>
<li>Stuber, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+transmission+from+the+amygdala+to+nucleus+accumbens+facilitates+reward+seeking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking.</a> Nature. 475, 377-380 (2011).</li>
<li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+a+hippocampal+engram+activates+fear+memory+recall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall.</a> Nature. 484, 381-385 (2012).</li>
</ol>

Optogenetics is een krachtige nieuwe techniek die ongekende controle over specifieke neuronale subtypes mogelijk maakt. Dit kan worden benut moduleren neurale circuits met anatomische en temporele precisie, maar worden de celtype willekeurige en invasieve effecten van elektrische stimulering door een elektrode. Implantatie van glasvezel zorgt voor consistente, chronische stimulering van neurale circuits meerdere sessies in wakker gedragen muizen met minimale schade aan weefsel. Dit systeem, dat oorspronkelijk ontwikkeld...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens of Apparatuur </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus # </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> LC Huls Sleeve </td><td> Precision Fiber Products (PFP) </td><td> SM-CS125S </td><td> 1.25 mm ID </td></tr><tr><td> FC MM voorgemonteerde connector </td><td> PFP </td><td> MM-CON2004-2300 </td><td> 230 micrometer Ferrule </td></tr><tr><td> Miller FOPD-LC Disc </td><td> PFP </td><td> M1-80754 </td><td> Voor LC adereindhulzen </td></tr><tr><td> Furcatie slangen </td><td> PFP </td><td> FF9-250 </td><td> 900 pm od, 250 pm id </td></tr><tr><td> MM LC Stick Ferrule 1,25 mm </td><td> PFP </td><td> MM-FER2007C-1270 </td><td> 127 micrometer ID Boring </td></tr><tr><td> MM LC Stick Ferrule 1,25 mm </td><td> PFP </td><td> MM-FER2007C-2300 </td><td> 230 pmID Boring </td></tr><tr><td> Warmte hardbare epoxy, verharder en hars </td><td> PFP </td><td> ET-353ND-16OZ </td><td></td></tr><tr><td> FC / PC en SC / PC Connector Polijsten Disk </td><td> Thorlabs </td><td> D50-FC </td><td> Voor FC adereindhulzen </td></tr><tr><td> Digitale optische vermogen en Energy Meter </td><td> Thorlabs </td><td> PM100D </td><td> Spectrofotometer </td></tr><tr><td> Polijsten Pad </td><td> Thorlabs </td><td> NRS913 </td><td> 9 &quot;x 13&quot; 50 Durometer </td></tr><tr><td> Aluminiumoxide Leppen (Polijsten) Vellen: 0,3, 1, 3, 5 micrometer grutten </td><td> Thorlabs </td><td> LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P </td><td></td></tr><tr><td> Standard Hard Bekleding Multimode Fiber </td><td> Thorlabs </td><td> BFL37-200 </td><td> Low OH, 200 pm Core, 0.37 NA </td></tr><tr><td> Fiber Stripping Tool </td><td> Thorlabs </td><td> T10S13 </td><td> Clad / Cobij: 200 pm / 300 urn </td></tr><tr><td> SILICA / SILICA Optical Fiber </td><td> Polymicro Technologies </td><td> FVP100110125 </td><td> High-OH, UV-Enhanced, 0,22 NA </td></tr><tr><td> 1x1 Glasvezel Rotary Joint </td><td> Dorische lenzen </td><td> FRJ_FC-FC </td><td></td></tr><tr><td> Mono Glasvezel Patchcord </td><td> Dorische lenzen </td><td> MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC </td><td></td></tr><tr><td> Krimpbuizen, 1/8 inch </td><td> Allied Electronics </td><td> 689-0267 </td><td></td></tr><tr><td> Warmte kanon </td><td> Allied Electronics </td><td> 972-6966 </td><td> 250 W; 750 tot 800 ° F </td></tr><tr><td> Katoen getipt applicators </td><td> Puriteinse Medical Products Company </td><td> 806-WC </td><td></td></tr><tr><td> VetBond weefselhechtmiddel </td><td> Fischer Scientific </td><td> 19-027136 </td><td></td></tr><tr><td> Flash prothese ligvlak </td><td> Yates Motloid </td><td> ColdPourPowder + Liq </td><td></td></tr><tr><td> BONN Miniatuur Iris schaar </td><td> Integra Miltex </td><td> 18-1.392 </td><td> 3-1/2 &quot;(8,9 cm), recht, 15 mm messen </td></tr><tr><td> Johns Hopkins Bulldog Clamp </td><td> Integra Miltex </td><td> Zeven-tweehonderdnegentig </td><td> 1-1/2 &quot;(3,8 cm), gebogen </td></tr><tr><td> MEGA-Torque Electric Lab Motor </td><td> Vector </td><td> EL-S </td><td></td></tr><tr><td> Panther Burs-Ball # 1 </td><td> Clarkson Laboratorium </td><td> 77,1006 </td><td></td></tr><tr><td> Violet Blue Laser System </td><td> CrystaLaser </td><td> CK473-050-O </td><td> Golflengte: 473 nm </td></tr><tr><td> Laser Power Supply </td><td> CrystaLaser </td><td> CL-2005 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 2 Laminectomie Forceps </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.223-20 </td><td></td></tr><tr><td> Sonde </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10.140-02 </td><td></td></tr><tr><td> 5 &quot;Straight Hemostat </td><td> Excelta </td><td> 35-PH </td><td></td></tr><tr><td> Vise met verzwaarde voet </td><td> Altex Electronics </td><td> PAN381 </td><td></td></tr></tbody></table>

glasvezel-implantatie voor chronische optogenetic stimulatie van hersenweefsel

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Het ophelderen van de patronen van neuronale connectiviteit is een uitdaging voor zowel de klinische en fundamentele neurowetenschappen. Elektrofysiologie is de gouden standaard voor het analyseren van patronen van synaptische connectiviteit, maar gekoppeld elektrofysiologische opnames kunnen zowel omslachtig en experimenteel te beperken. De ontwikkeling van optogenetics introduceert een elegante methode om neuronen en circuits stimuleren, zowel in vitro en in vivo een 2,3. Door gebruik celtype specifieke promoter activiteit opsin expressie in discrete neuronale populaties kan men nauwkeurig stimuleren genetisch gedefinieerde neuronale subtypes in verschillende circuits 4-6. Goed beschreven methoden neuronen, inclusief elektrische stimulatie en / of farmacologische manipulaties, stimuleren vaak willekeurig celtype, invasieve en kunnen beschadigen omliggende weefsels. Deze beperkingen kunnen veranderen normale synaptische functie en / of circuit gedrag. Bovendien wegensde aard van de manipulatie, de huidige methoden vaak acute en terminal. Optogenetics biedt de mogelijkheid om neuronen te stimuleren in een relatief onschadelijke wijze en in genetisch gerichte neuronen. De meeste studies met in vivo optogenetics momenteel een optische vezel geleid via een canule geïmplanteerd 6,7, maar beperkingen van deze methode zijn beschadigd hersenweefsel met herhaalde inbrengen van een optische vezel en potentiële breuk van de vezel binnen de canule. Gezien de snel groeiende gebied van de optogenetics, een meer betrouwbare methode van chronische stimulatie is noodzakelijk om op lange termijn studies te vergemakkelijken met een minimale collaterale weefselbeschadiging. Hier geven we onze gemodificeerd protocol als video artikel de werkwijze effectief en elegant beschreven in Sparta et al. vullen. 8 voor de vervaardiging van een glasvezel implantaat en zijn vaste bevestiging op de schedel van verdoofde muizen, en de montage van de fiberoptische koppeling verbinden van het implantaat aan een lichtbron. Het implantaat, verbonden met optische vezels om een solid-state laser, maakt een efficiënte methode om functionele neuronale circuits chronisch photostimulate met minder weefselschade 9 met kleine, afneembare tethers. Permanente bevestiging van de glasvezel implantaten zorgt voor een consistente, op lange termijn in vivo optogenetic studies van neuronale circuits in wakker, gedragen muizen 10 met minimale weefselbeschadiging.

De ontwikkeling van optogenetics biedt nu de middelen om nauwkeurig te stimuleren genetische gedefinieerde neuronen en circuits,<em&gt; In vitro</em&gt; En<em&gt; In vivo</em&gt;. Hier beschrijven we de montage en implantatie van een glasvezel voor chronische fotostimulering van hersenweefsel.

Glasvezel-implantatie voor chronische Optogenetic Stimulatie van hersenweefsel

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Het doel van het volgende experiment is om neuronale circuits op lange termijn te activeren en te bestuderen bij wakkere, zich bewegende muizen. Deze methode is aangepast van het concept dat oorspronkelijk werd beschreven in Sparta etal. Dit wordt bereikt door eerst een glasvezelkoppelingskabel samen te stellen, die de optische draaiconnector verbindt met de glasvezelimplantaat.Vervolgens wordt de glasvezel geïmplanteerd over het hersengeweefsel van belang om een doorgang te creëren voor het licht om direct naar de rode kanaalexpresserende neuronen te reizen. Ten slotte wordt de lichtbron verbonden met de optische draaiconnector om een seriële verbinding te creëren van de lichtbron naar het hersengeweefsel. Uiteindelijk kan lichtgeïnduceerde activering van rode kanaalexpresserende neuronen worden geëvalueerd op basis van in vivo, elektrofysiologie en gedragsstudies.Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals geleidecanules is dat het de schade aan het hersengeweefsel minimaliseert die wordt veroorzaakt door herhaalde inbrenging en verwijdering van een optische vezel. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de functie van neurale circuits, kan deze ook worden toegepast op andere systemen om de synaps en circuit-afhankelijke mechanismen die ten grondslag liggen aan bepaalde soorten neurologische stoornissen beter te begrijpen. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal.Aangezien de implantatiestapjes moeilijk te beheersen zijn, draagt elke schijnbaar kleine stap sterk bij aan de algehele stabiliteit en betrouwbaarheid van de methode. Begin met het snijden van 35 millimeter van een 125 micron diameter glasvezel met een 100 micron kern door een wigpunt carbide scribeerstift loodrecht op de glasvezel te plaatsen en de vezel in een enkele unidirectionele beweging te scoren, gevolgd door rechtuit trekken. Plaats nu een LC keramische feral met een diameterboring van 127 micron met de convexe kant naar beneden in een vice en plaats vervolgens het glasvezelstuk in de feral.De glasvezel moet soepel glijden en marginaal uitsteken voorbij het convexe uiteinde van de feral. Breng vervolgens één druppel vers bereide hitte-hardende glasvezel epoxy aan op het platte uiteinde van de feral en breng vervolgens een hittepistool aan op de epoxy. De epoxy moet de feral vullen terwijl deze wordt verwarmd en is uitgehard wanneer deze zwart wordt.Na het uitharden, maakt u eventueel epoxy van de zijden van de feral schoon en gebruik vervolgens een LC glasvezel polijstschijf om cirkelvormige rotatiepatronen te maken om het convexe uiteinde van de feral op aluminiumoxide Polijstvellen op een polijstpad in vier afnemende graden te polijsten. Snijd vervolgens de glasvezel aan het platte uiteinde tot de juiste lengte om het gewenste gebied te targeten. Om de gepolijste glasvezel te testen, steekt u het gepolijste uiteinde van de implantaat in de hoes van de koppeling.Totdat direct contact met de tegenoverliggende feral wordt gevoeld, zal een slechte implantaat een zwakke brandpunt hebben nabij de punt van de glasvezel, terwijl een goede implantaat een soepele concentrische cirkel van licht zal overbrengen zonder output. Krachten tot 10 milliwatt bewaren de voltooide implantaten in schuim tot gebruik. Begin met dit stap door een 220 micron diameter glasvezel met een 200 micron kern te meten en vervolgens te scoren om een muis vrij te laten bewegen, maar niet toe te staan dat de muis de vezel kauwt.Breng vervolgens de glasvezel in een stuk furatiebuis met een binnendiameter iets groter en een lengte iets korter dan die van de glasvezel. Schil nu ongeveer 25 millimeter vanaf het ene uiteinde van de glasvezel en steek het in het metalen uiteinde van een multimode FC MM feral assemblage. Met een diameterboring van 230 micron totdat het stopt, moet de glasvezel uitsteken door het feral-uiteinde.Beveilig vervolgens de verbinding met cyanoacrylaat aan het metalen uiteinde en bedek de verbinding met een connector Boot polijst het feral-uiteinde met een FC-polijstschijf zoals zojuist gedemonstreerd. Na het afschuiven van het andere uiteinde van de glasvezel, steek het in een LC keramische feral met alleen het convexe uiteinde distaal. Breng vervolgens een druppel epoxy aan op het platte uiteinde en verwarm tot uitharding zoals zojuist gedemonstreerd.Na het polijsten van het convexe uiteinde van de feral zoals zojuist gedemonstreerd, schuift u een LC feral-huls over het convexe uiteinde van de feral totdat de feral het middenpunt van de huls bereikt. Plaats vervolgens een hitteschrompbuis over de ationbuis en huls en verwarm de hitteschrompbuis om de verbinding veilig te stellen en te beschermen. Verbind tenslotte de feral met de laserbron en test het vervolgens door de lichtuitvoer door de koppeling te meten met een spectrofotometer, het lichtverlies tussen de laseruitvoer en gemeten koppelingsuitvoer mag niet meer dan 30%bedragen voordat u met de operatie begint.Desinfecteer het operatiegebied met isopropielalcohol gevolgd door chloorhexidine-oplossing. Plaats vervolgens de muis in de stereotactische rig en bevestig het hoofd om ervoor te zorgen dat de schedel horizontaal is. Breng oftalmische zalf aan op de ogen van het dier om uitdroging en postoperatieve pijn te voorkomen.Maak nu een incisie door de middenlijn van de hoofdhuid om de schedel bloot te leggen vanaf de oogkas tot de lambdanaad. Gebruik serafinklemmen om de huid terug te houden en toegang tot de schedel te behouden. Gebruik vervolgens een tandheelkundig priem om een gekarreerde patroon over het oppervlak van de schedel te etsen.Was het resulterende puin weg met steriel zoutje. Na grondig drogen, gebruikt u een wattenstaafje om 3% waterstofperoxide aan te brengen op de blootgestelde schedel gedurende ongeveer twee tot drie seconden om microporiën te creëren. Was vervolgens de schedel meerdere keren met meer steriel zoutje en droog het grondig.Na het etsen, wassen en drogen van het gekarreerde patroon in de schedel, steekt u de glasvezel feral implantaat weer in de sondehouder en verbindt u deze vervolgens met de stereotactische arm. Be

fiber-optic-implantation-for-chronic-optogenetic-stimulation-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Volwassen geboren neuronen van de bulbus olfactorius kan optogenetically worden gecontroleerd met behulp van Channelrhodopsin2 expressie lentivirale injectie in de rostrale migratie stroom en chronische fotostimulering met een geïmplanteerd miniatuur LED.

Selectieve Viral Transductie van Adult geboren Olfactorische Neuronen voor chronische In vivo Optogenetic Stimulatie

De recente ontwikkeling van de neurowetenschappen tools die genetica en optica combineren, aangeduid als "optogenetics", stelt de controle over neurale circuit activiteit met een ongekend niveau van ruimtelijke en temporele resolutie. Hier bieden wij een protocol voor de integratie in vivo opnemen met optogenetic manipulatie van genetisch gedefinieerde subsets van de prefrontale cortex en subicular piramidale neuronen.

Een methode voor High Fidelity optogenetic controle van individuele piramidale neuronen<em&gt; In vivo</em

Optogenetica is een krachtig hulpmiddel geworden voor gebruik in gedragsneurowetenschappelijke experimenten. Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor het ontwerp en de installatie van lasersystemen en biedt een volledig protocol voor het uitvoeren van meerdere en gelijktijdige in vivo optogenetische stimulaties die compatibel zijn met de meeste gedragstestparadigma's bij knaagdieren.

In vivo optogenetische Stimulatie van de knaagdieren centrale zenuwstelsel

Dit protocol beschrijft de stappen en gegevensanalyse die nodig zijn om optogenetisch functioneel magnetische resonantiebeeldvorming (ofMRI) met succes uit te voeren. ofMRI is een nieuwe techniek die high-field fMRI-uitlezing combineert met optogenetische stimulatie, waardoor het mogelijk wordt om celtype-specifieke kaarten van functionele neurale circuits en hun dynamica in de gehele levende hersenen te maken.

Optogenetische Functionele MRI

Hier presenteren we een methode voor het leveren van Virale expressievectoren in de hersenen met behulp van zijde fibroin films. Met deze methode kunt gerichte levering van expressievectoren met zijde/AAV gecoate optische vezels, taps toelopende optische vezels en craniale windows.

In Vivo Gerichte expressie van Optogenetic eiwitten met behulp van Silk/AAV Films

Met optogenetische manipulatie van specifieke neuronale populaties of hersengebieden kan gedrag worden gewijzigd met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie bij vrij bewegende dieren. Door het gebruik van verschillende optogenetische tools in combinatie met chronisch geïmplanteerde optische vezels, kan een verscheidenheid aan neuronale modulaties en gedragstesten worden uitgevoerd.

Optogenetische manipulatie van neuronale activiteit om gedrag te moduleren in vrij bewegende muizen

Hier presenteren we de fabricagemethode van een optrode-systeem met optische vezels voor lichtafgifte en een elektrode-array voor neurale opname. In vivo experimenten met transgene muizen die channelrhodopsine-2 tot expressie brengen, tonen de haalbaarheid van het systeem voor gelijktijdige optogenetische stimulatie en elektrofysiologische registratie.

Optrode Array voor gelijktijdige optogenetische modulatie en elektrische neurale opname

Dit protocol beschrijft een chirurgische ingreep voor het uitvoeren van ruggenmergchirurgie en voor het implanteren en vastzetten van een optische schacht over het ruggenmerg bij knaagdieren.

Implantatie van opto-elektronische apparaten in het ruggenmerg van knaagdieren

We hebben een vereenvoudigde en kosteneffectieve aanpak ontwikkeld voor de fabricage van elektroden en hebben opnames gemaakt van signalen in meerdere regio's bij vrij bewegende muizen. Door gebruik te maken van optogenetica, naast elektrofysiologie in meerdere regio's en registratie van calciumsignalen, kon de onthulling van neuronale activiteiten in verschillende regio's in het aanvalsaanmaakmodel worden vastgesteld.

Een geïntegreerde methode voor het maken van flexibele en handige elektrofysiologische optrodes voor in-vivo-opname in meerdere regio's

Dit protocol biedt een geïntegreerde methode die virale aflevering, implantatie van optroden, fototrombotische inductie, gelijktijdige registratie van astrocyten- en neuronale activiteit, en optogenetische stimulatie van astrocyten omvat. Deze geïntegreerde methode heeft als doel gelijktijdig onderzoek te bieden naar de relatie tussen astrocyten en neuronen over de acute tot chronische stadia van ischemische beroerte.

Een geïntegreerde methode voor fototrombotische beroertemodellering en in vivo optroderegistratie van neuronale en astrocytische activiteit bij zich gedragende muizen

Leer glasvezel-implantatie voor chronische optogenetische stimulatie van hersenweefsel bij wakke, zich gedragend muizen. Deze methode minimaliseert weefselschade en biedt betrouwbare lichtafgifte voor neurowetenschappelijk onderzoek.

Glasvezel-implantatie voor chronische Optogenetic Stimulatie van hersenweefsel

Meer video's verkennen