Glasvezel-implantatie voor chronische Optogenetic Stimulatie van hersenweefsel
29 oktober 2012
De ontwikkeling van optogenetics biedt nu de middelen om nauwkeurig te stimuleren genetische gedefinieerde neuronen en circuits, In vitro En In vivo. Hier beschrijven we de montage en implantatie van een glasvezel voor chronische fotostimulering van hersenweefsel.
Het doel van het volgende experiment is om neuronale circuits op lange termijn te activeren en te bestuderen bij wakkere, zich bewegende muizen. Deze methode is aangepast van het concept dat oorspronkelijk werd beschreven in Sparta etal. Dit wordt bereikt door eerst een glasvezelkoppelingskabel samen te stellen, die de optische draaiconnector verbindt met de glasvezelimplantaat.
Vervolgens wordt de glasvezel geïmplanteerd over het hersengeweefsel van belang om een doorgang te creëren voor het licht om direct naar de rode kanaalexpresserende neuronen te reizen. Ten slotte wordt de lichtbron verbonden met de optische draaiconnector om een seriële verbinding te creëren van de lichtbron naar het hersengeweefsel. Uiteindelijk kan lichtgeïnduceerde activering van rode kanaalexpresserende neuronen worden geëvalueerd op basis van in vivo, elektrofysiologie en gedragsstudies.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals geleidecanules is dat het de schade aan het hersengeweefsel minimaliseert die wordt veroorzaakt door herhaalde inbrenging en verwijdering van een optische vezel. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de functie van neurale circuits, kan deze ook worden toegepast op andere systemen om de synaps en circuit-afhankelijke mechanismen die ten grondslag liggen aan bepaalde soorten neurologische stoornissen beter te begrijpen. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal.
Aangezien de implantatiestapjes moeilijk te beheersen zijn, draagt elke schijnbaar kleine stap sterk bij aan de algehele stabiliteit en betrouwbaarheid van de methode. Begin met het snijden van 35 millimeter van een 125 micron diameter glasvezel met een 100 micron kern door een wigpunt carbide scribeerstift loodrecht op de glasvezel te plaatsen en de vezel in een enkele unidirectionele beweging te scoren, gevolgd door rechtuit trekken. Plaats nu een LC keramische feral met een diameterboring van 127 micron met de convexe kant naar beneden in een vice en plaats vervolgens het glasvezelstuk in de feral.
De glasvezel moet soepel glijden en marginaal uitsteken voorbij het convexe uiteinde van de feral. Breng vervolgens één druppel vers bereide hitte-hardende glasvezel epoxy aan op het platte uiteinde van de feral en breng vervolgens een hittepistool aan op de epoxy. De epoxy moet de feral vullen terwijl deze wordt verwarmd en is uitgehard wanneer deze zwart wordt.
Na het uitharden, maakt u eventueel epoxy van de zijden van de feral schoon en gebruik vervolgens een LC glasvezel polijstschijf om cirkelvormige rotatiepatronen te maken om het convexe uiteinde van de feral op aluminiumoxide Polijstvellen op een polijstpad in vier afnemende graden te polijsten. Snijd vervolgens de glasvezel aan het platte uiteinde tot de juiste lengte om het gewenste gebied te targeten. Om de gepolijste glasvezel te testen, steekt u het gepolijste uiteinde van de implantaat in de hoes van de koppeling.
Totdat direct contact met de tegenoverliggende feral wordt gevoeld, zal een slechte implantaat een zwakke brandpunt hebben nabij de punt van de glasvezel, terwijl een goede implantaat een soepele concentrische cirkel van licht zal overbrengen zonder output. Krachten tot 10 milliwatt bewaren de voltooide implantaten in schuim tot gebruik. Begin met dit stap door een 220 micron diameter glasvezel met een 200 micron kern te meten en vervolgens te scoren om een muis vrij te laten bewegen, maar niet toe te staan dat de muis de vezel kauwt.
Breng vervolgens de glasvezel in een stuk furatiebuis met een binnendiameter iets groter en een lengte iets korter dan die van de glasvezel. Schil nu ongeveer 25 millimeter vanaf het ene uiteinde van de glasvezel en steek het in het metalen uiteinde van een multimode FC MM feral assemblage. Met een diameterboring van 230 micron totdat het stopt, moet de glasvezel uitsteken door het feral-uiteinde.
Beveilig vervolgens de verbinding met cyanoacrylaat aan het metalen uiteinde en bedek de verbinding met een connector Boot polijst het feral-uiteinde met een FC-polijstschijf zoals zojuist gedemonstreerd. Na het afschuiven van het andere uiteinde van de glasvezel, steek het in een LC keramische feral met alleen het convexe uiteinde distaal. Breng vervolgens een druppel epoxy aan op het platte uiteinde en verwarm tot uitharding zoals zojuist gedemonstreerd.
Na het polijsten van het convexe uiteinde van de feral zoals zojuist gedemonstreerd, schuift u een LC feral-huls over het convexe uiteinde van de feral totdat de feral het middenpunt van de huls bereikt. Plaats vervolgens een hitteschrompbuis over de ationbuis en huls en verwarm de hitteschrompbuis om de verbinding veilig te stellen en te beschermen. Verbind tenslotte de feral met de laserbron en test het vervolgens door de lichtuitvoer door de koppeling te meten met een spectrofotometer, het lichtverlies tussen de laseruitvoer en gemeten koppelingsuitvoer mag niet meer dan 30%bedragen voordat u met de operatie begint.
Desinfecteer het operatiegebied met isopropielalcohol gevolgd door chloorhexidine-oplossing. Plaats vervolgens de muis in de stereotactische rig en bevestig het hoofd om ervoor te zorgen dat de schedel horizontaal is. Breng oftalmische zalf aan op de ogen van het dier om uitdroging en postoperatieve pijn te voorkomen.
Maak nu een incisie door de middenlijn van de hoofdhuid om de schedel bloot te leggen vanaf de oogkas tot de lambdanaad. Gebruik serafinklemmen om de huid terug te houden en toegang tot de schedel te behouden. Gebruik vervolgens een tandheelkundig priem om een gekarreerde patroon over het oppervlak van de schedel te etsen.
Was het resulterende puin weg met steriel zoutje. Na grondig drogen, gebruikt u een wattenstaafje om 3% waterstofperoxide aan te brengen op de blootgestelde schedel gedurende ongeveer twee tot drie seconden om microporiën te creëren. Was vervolgens de schedel meerdere keren met meer steriel zoutje en droog het grondig.
Na het etsen, wassen en drogen van het gekarreerde patroon in de schedel, steekt u de glasvezel feral implantaat weer in de sondehouder en verbindt u deze vervolgens met de stereotactische arm. Be
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor chronische fotostimulatie van genetisch gedefinieerde neuronen met behulp van glasvezeloptiek in wakkere, bewegende muizen. De techniek minimaliseert weefselschade aan de hersenen in vergelijking met traditionele methoden.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Optogenetica
- Neurale circuits
Achtergrond
- Optogenetica maakt een nauwkeurige controle van neuronale activiteit mogelijk.
- Chronische fotostimulatie biedt inzicht in de langetermijnfunctie van neurale circuits.
- Bestaande methoden kunnen aanzienlijke weefselschade veroorzaken.
- Deze methode beoogt een verbetering van eerdere technieken.
Doel van de studie
- Om neuronale circuits in real-time te activeren en te bestuderen.
- Om de effecten van licht op neuronen die channelrhodopsine tot expressie brengen te evalueren.
- Om het begrip van neurologische aandoeningen te vergroten.
Gebruikte methoden
- Assemblage van een glasvezelimplant voor lichttoediening.
- Chirurgische implantatie boven de beoogde hersengebieden.
- Gebruik van elektrofysiologie en gedragsstudies voor evaluatie.
- Testen van de lichtopbrengst en waarborgen van een correcte verbinding.
Belangrijkste resultaten
- De methode minimaliseert weefselschade op succesvolle wijze.
- Betrouwbare lichttoediening aan specifieke neuronale populaties werd bereikt.
- Gedragsmatige reacties op fotostimulatie werden gedocumenteerd.
- Er werd inzicht verkregen in de functie van neurale circuits.
Conclusies
- Deze techniek biedt een robuuste benadering voor het bestuderen van neurale circuits.
- Het kan worden aangepast voor diverse neurologische onderzoekstoepassingen.
- Visuele demonstraties zijn essentieel voor een succesvolle implementatie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Chronische optogenetische stimulatie maakt aanhoudende ondervraging van neurale circuits in wakkere, bewegende modellen mogelijk, wat doelwitvalidatie en mechanische risicoreductie bij de ontdekking van neurowetenschappelijke geneesmiddelen ondersteunt. Deze glasvezelimplantatiemethode vermindert weefselschade en verbetert de betrouwbaarheid voor langetermijnstudies, waardoor het voorspellende vertrouwen in target engagement en circuitmodulatie wordt vergroot. Het dient als een herbruikbaar platform voor de preklinische evaluatie van neuromodulerende therapieën.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt precieze, celtype-specifieke stimulatie van genetisch gedefinieerde neuronale populaties mogelijk om therapeutische hypothesen en pathway-functies te onderzoeken.
- Operationele waarde: Ondersteunt reproduceerbare circuit-interrogatie met minimale invasiviteit, waardoor variabiliteit door acute of beschadigende stimulatiemethoden wordt verminderd.
- Predictieve waarde: Faciliteert longitudinale beoordeling van de effecten van target-modulatie op gedrag en elektrofysiologie, wat het vertrouwen in het target vergroot en mechanistische aannames minder riskant maakt.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een gestandaardiseerd, kwantificeerbaar systeem voor lichttoediening voor consistente optogenetische activatie over experimentele herhalingen heen.
- Operationele waarde: Maakt fotontransmissie met hoge getrouwheid en laag verlies (<30% verliesdrempel) mogelijk, wat de betrouwbaarheid en schaalbaarheid van de assay voor screening van verbindingen of genetica waarborgt.
- Assay-gereedheid: Produceert stabiele, chronische implantaten die compatibel zijn met downstream elektrofysiologie en gedragsmatige read-outs, wat de continuïteit tussen assays ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Ondersteunt chronische studies bij wakker, gedragend proefdieren die bevindingen uit de ontdekkingsfase verbinden met preklinische beoordelingen van werkzaamheid en veiligheid.
- Risico-gecorrigeerde Vooruitgang: Maakt herhaalde, longitudinale evaluatie van effecten op circuitniveau mogelijk, wat go/no-go-beslissingen informeert op basis van aanhoudende target-engagement.
- Relevantie voor Ziektemodellen: Maakt studie van synapse- en circuitafhankelijke mechanismen in modellen van neurologische aandoeningen mogelijk met minimale storende weefselschade.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie via leadidentificatie tot preklinische evaluatie, waardoor chronische circuitinterrogatie in elke fase mogelijk wordt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten en de verduidelijking van signaalpaden via precieze, reproduceerbare stimulatie van gedefinieerde neuronale circuits.
- Screening: Levert een gestandaardiseerde optische output voor betrouwbare activatie in screeningcampagnes die consistente stimulusparameters vereisen.
- Analytics: Maakt gecorreleerde elektrofysiologische en gedragsmatige metingen mogelijk om de respons van het circuit en de modulatie van het doelwit te kwantificeren.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt acute bevindingen met chronische uitkomsten via stabiele, langetermijnimplantaten in wakker modellen.
- Enterprise Hergebruik: Vertegenwoordigt een platformcapaciteit voor herhaaldelijk gebruik in verschillende projecten, waardoor herontwikkelingskosten worden verlaagd en de methodologische consistentie wordt verbeterd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door chronische, celtype-specifieke circuitinterrogatie mogelijk te maken met minimale weefselvariabelen.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid door gestandaardiseerde fabricage, koppeling met gering verlies en stabiele chronische fixatie.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door het verminderen van uitvalpercentages als gevolg van weefselschade en het mogelijk maken van longitudinale gegevensverzameling bij individuele subjecten.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door duurzame, vertaalbare gegevens op circuitniveau te leveren voor beslissingen over de verdere ontwikkeling van targets.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in microchirurgie, het hanteren van glasvezels en optogenetische preparatie.
- Is afhankelijk van precisie-instrumenten, waaronder stereotaxische frames, rotatieboren, polijstsystemen en spectrophotometrische validatie.
- Vereist cross-team standaardisatie tussen de teams voor chirurgie, optica en gedragswetenschappen voor consistente resultaten.
- Omvat overwegingen voor aanpassing aan verschillende hersengebieden, vezellengtes en tethering-systemen op basis van de doeldiepte en de beweging van het dier.
- Omvat praktische beperkingen, zoals de afhankelijkheid van chirurgische vaardigheden en de noodzaak van validatie van de optische doorvoer na implantatie.
