Name: Verwerking van de mens Vermindering mammoplasty en mastectomie weefsels voor Cultuur van de Cel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Leer hoe u menselijk mammaweefsel uit chirurgisch afval verwerkt tot epitheliale organoïden voor celcultuur. Deze methode scheidt epitheel van stroma via enzymatische digestie en filtratie voor langdurige groei.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

MAL, GAG, en MRS worden ondersteund door de NIA (R00AG033176 en R01AG040081) en door Laboratorium gericht onderzoek en ontwikkeling, US Department of Energy contract # DE-AC02-05CH11231.

1. Tissue Verwerking en Spijsvertering <ol><li> Zorg voor menselijk borstweefsel als discard materiaal van chirurgische procedures. Vermindering mammoplasties kan normale of goedaardige cellen fibroadenomen en gynecomastias voorzien goedaardige cellen, niet-tumor weefsels mastectomie (perifere of contralaterale een tumor of subcutane) voorzien cellen die kunnen variëren van normaal goedaardig tot die microtumors. Zorg voor een goede IRB goedkeuring bestaat voorafgaand aan het verkrijgen van de afvalstoffen. Al het materiaal moet worden behandeld overeenkomstig bloedoverdraagbare pathogenen regelgeving. </li><li> Plaats de stof in steriele containers met buffer of media (bijv. 01:01 Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium en Ham&#39;s F-12) aangevuld met 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 5 ug / ml Fungizone, 50U/ml polymyxine B, en 10% foetaal runderserum en transport naar het laboratorium bij 4 ° C. Vermindering mammoplasty weefsel kan worden opgeslagen of vervoerd bij 4 ° C gedurende 72 uur zonder noemenswaardige vermindering subsequent levensvatbaarheid van de cellen. Kleine stukjes van niet-afname mammoplasty weefsel kan vereisen meer een snelle verwerking. </li><li> Scheid de epitheliale gebieden van de stromale matrix van vetweefsel, bindweefsel en bloedvaten met behulp van een combinatie van steriel scalpel, tang en schaar. Knip stukjes weefsel met een schaar en plaats het in een grote glazen steriele schaal (bv. 150 mm). Voorzichtig ontleden van de epitheliale gebieden, die verschijnen als witte draden zijn ingebed in de geler stromale matrix, met behulp van de tang aan het materiaal en de scalpel te schrapen weg grove vette materiaal vast te houden. Om de spijsvertering te vergemakkelijken, snijd het epitheelweefsel in kleinere stukken van ~ 3-4 mm met tegengestelde scalpels en plaats in een 50 ml centrifugebuis. Als er grote hoeveelheden weefsel worden verwerkt, kan vers scalpelmesjes nodig zijn. Verwijder vet materiaal van de schotel zodat het volgens de institutionele regelingen. <ol class="lalpha"><li> In sterk vezelig weefsel (bijv. subcutane mastectomies met ernstige cystische fibrose), zal er meer witte vaste, niet-epitheliale materiaal. Het kan moeilijk te ontleden de epitheelcellen van dergelijke vezelachtige matrices. Grote stukken van vezelig materiaal kan worden gesneden in kleinere stukken die ~ 1-3 mm vierkant in het gebied en afzonderlijk verteerd. </li></ol></li><li> Plaats de uitgesneden epitheelweefsel in een conische centrifugebuis (50 ml of 15 ml) met weefsel omvattende niet meer dan een derde van het volume van de buis. Breng de buis volledige volume, waardoor slechts een kleine luchtruimte om te mengen tijdens het draaien met een tissue digestiemengsel (DME/F-12 of equivalent, 10 ug / ml insuline, antibiotica zoals hierboven en eindconcentratie van 10 % FCS, 200 U / ml ruwe collagenase en 100 U / ml hyaluronidase. </li><li> Plaats de buisjes op een rotator HulaMixer buis en draaien 360 ° C 8 rpm nacht bij 37 ° C. </li><li> Centrifugebuizen bij 600 xg gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant vet en medium voor verwijdering volgensING institutionele regelingen. </li><li> Controleer voltooiing van digestie door verdunnen van een kleine hoeveelheid van de pellet in medium. Spijsvertering is voltooid wanneer microscopisch onderzoek klompen cellen (organoids) met gladde verschijnen ductale, alveolaire of ductale-celstructuren zonder bijgevoegde stroma (Figuur 1A) toont. Vermindering mammoplasty weefsels zal meestal vertonen nog steeds aangesloten stroma na een nacht spijsvertering en zal extra spijsvertering tijd nodig. <ol class="lalpha"><li> Resuspendeer de pellet onvolledig verteerd in vers weefsel digestiemengsel en opnieuw incuberen met rotatie bij 37 ° C gedurende nog eens 4-12 uur. Herhaal de stappen 1.6 en 1.7. Als spijsvertering is nog onvoldoende opnieuw toe digestiemengsel de pellet en opnieuw incuberen met rotatie bij 37 ° C geroerd. De concentratie van enzymen kan worden beperkt tot over-digestie overnacht voorkomen. </li></ol></li><li> Wanneer de spijsvertering voltooid, buizen gecentrifugeerd bij 600 xg gedurende 5 min, zuigen de digestion mix, resuspendeer pellet in medium met antibiotica op ongeveer 15 ml/50 ml tube, 5 ml/15 ml buis. </li></ol> 2. Filtratie en Bevriezing van verteerd materiaal <ol><li> Overdracht aliquots van de geresuspendeerde pellet op een steriele 100 um zeef over een steriele 50 ml buizen. Laat het medium afvoer in de buis, dan opnieuw te wassen de organoids op de top 1-2x keer met 2-3 ml medium. Herhaal dit totdat alle geresuspendeerde pellet is overgedragen. Als er te veel organoids op het filter en het medium niet meer afvoeren gemakkelijk gebruik een nieuwe filter (s) voor het materiaal. Draai vervolgens de filter (s) op de top van een andere steriele buis en was de organoids in de buis met meer medium. Dit is de 100 micrometer organoid zwembad. </li><li> Neem het materiaal dat afgevoerd naar de oorspronkelijke 50 ml buis en herhaal het proces van 2,1 met behulp van een 40 um zeef, om de 40 um organoid zwembad, die meestal alveolaire structuren bevat te verkrijgen. Het materiaal dat afgevoerd in the buis vormt het filtraat zwembad, dat enkel / kleine groepjes van mesenchymale en epitheliale cellen en kleine stukjes van het vaatstelsel bevat. </li><li> Pellet de 100 urn, 40 urn, en het filtraat pools op 600 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Zuig de supernatant, bereid elke buis in CPM II (DME/F-12 of equivalent met 44% FCS en 6% DMSO) met ongeveer 1 ml per 0,1 ml CPMII pakketvorm pellet. Houden op 4 ° C. </li><li> Seed een test schotel voor de 2 organoid zwembaden door het plaatsen van 0,1 ml geresuspendeerde materiaal in een 35 mm weefselkweek plastic schaal druppel voor druppel als in 3.2 hieronder. Het filtraat pool direct geënt op plastic weefselkweekplaten met fibroblast medium (DME/F-12 of equivalent met 10 ug / ml insuline en 10% FBS). </li><li> Aliquot het resterende materiaal in geresuspendeerde Nunc Type freezing ampullen (1 ml / 2 ml ampul). Bevriezen nacht bij -80 ° C en vervolgens overbrengen onmiddellijk de opslag in vloeibare stikstof. We hebben niet waargenomen significante verliezen van levensvatbaarheidin onze oorspronkelijke ampullen in bevroren toestand bewaard sinds de late jaren 1970. </li></ol> 3. Zaaien Bevroren Organoids en Subculture van primaire culturen <ol><li> Snel ontdooien van de bevroren ampul met de organoids in een 37 ° C waterbad. Zaad organoids in 2 tot 10 (meestal ~ 6) 60 mm schalen, of 1-3 100 mm schalen, afhankelijk van visuele schatting van het aantal organoids in de ampul. Ongeveer 20-40 organoids uitgezet per 60 mm schotel optimaal. </li><li> Ontdooide organoids worden zorgvuldig geplaatst, druppel voor druppel, op de schotel oppervlak met een 1 ml pipet of Pasteur pipet voor een gelijkmatige verdeling van organoids. Organoids geplaatst dicht bij elkaar zullen beperkte ruimte voor uitgroei hebben, waardoor er minder cellen voor subcultuur of bevriezing. Vermijd krassen op de schotel oppervlak (cellen niet geneigd zijn om het verleden krassen oppervlakken groeien). Wacht 1-2 minuten om de organoids te bevestigen en dan langzaam toe te voegen groeimedium om te vermijden dat de organoids (bijv. 2 tot 3 ml/60 mm schaal). Ikncubate bij 37 ° C in bevochtigde CO2 incubator. Dit zijn de primaire culturen. Momenteel gebruiken M87A + oxytocine (X) medium voor de meest robuuste HMEC groei (figuur 2). </li><li> Na 1 dag, controleer dan of de organoids zijn bevestigd. Voeg extra medium (bijv. 2 tot 3 ml/60 mm schaal). Celmigratie van organoids moet zichtbaar 24-48 uur en mitotische uitgroei van 48-72 uur na enting (Figuur 1B, C). Soms attachment slecht na 24 uur, met name indien plateren overdigested organoids of organoids van oudere vrouwen, maar de meeste preparaten zal hechten binnen 72 uur. Kleine stukjes van de vasculatuur kan aan en leiden tot fibroblast cellen uitgroei (Figuur 1D). </li><li> Feed culturen ten minste 3 keer per week. Cellen gekweekt in M87A-type media groeien tot bijna confluentie binnen 5-8 dagen, afhankelijk van de dichtheid van zaaien. </li><li> Als er significant fibroblast groei Differential trypsine (DT), gebaseerd op desnelle loslating van fibroblasten van het oppervlak plastic, nodig om de fibroblasten verwijderen. Wanneer de epitheliale plekken worden groot, aspiraat media, wassen schotel (bv., 1-2 ml/60 mm schaal) met STE (zoutoplossing, 0,05% trypsine, 0,02% EDTA), aspiratie, voeg verse 0,5 ml STE en laat op kamertemperatuur ongeveer 1 min onder voortdurend microscopische waarneming. Wanneer de fibroblasten los maar de epitheliale cellen nog adherent voorzichtig maar sterk de zijkant van de schaal stoten tegen een hard oppervlak om de fibroblasten en dan snel los te zuigen. Was eenmaal met PBS, en zuig weer. Culturen zwaar verontreinigd met fibroblasten kan het nodig zijn een extra DT. </li><li> Subculture primaire culturen wanneer grote epitheliale vlekken aanwezig zijn, maar voordat samenvloeiing. De dichtheid van organoid zaaien en gehechtheid beïnvloedt de benodigde tijd. De primaire kweek behouden en meerdere secundaire culturen, verdeeld over tijd realiseren voeren we Partial Trypsinizations (PT). </li><li> Aspiraat media, was een 60 mm schaal met 1-2 ml STE, voeg 0,5 ml verse STE voor te schotelen. Acht cel onthechting onder de microscoop bij kamertemperatuur gedurende 1-5 min. met zachte kloppen van de schotel naar cel onthechting bevorderen. Trypsinisatie moet worden gestopt wanneer ongeveer 50% van de cellen losgemaakt. Vroege PT&#39;s hebben meestal een snelle cel onthechting. Voor later PT kunnen cellen worden geplaatst bij 37 ° C voor snellere loslating, met zorgvuldige controle, omdat alle cellen snel loskomen. </li><li> Voeg 2 ml van serumbevattende media de schaal, tot repipette wassen en naar een steriele buis van 15 ml. Herhaal 2x met andere ~ 1-2 ml media, toevoeging was aan de buis. Opnieuw invoeren van de primaire schotel en terug te keren naar incubator. Tel de cellen in de buis met de haemocytometer. PT kan worden herhaald ongeveer 4 tot 8 keer met een goede cel hergroei in het primaire gerechten en gelijkwaardige groei op lange termijn van de subcultuur of bevroren secundaire (tweede passage cellen zijn genoemd secondaries, eenmaal subcultuur, cellen niet longer primaries). Zodra organoid materiaal is niet meer aanwezig in de primaire culturen, subcultuur secundaire laten een daling van de lange-termijn populatieverdubbelingstijd potentieel. </li><li><ol class="lalpha"><li> Voor subcultuur tot secundaire, zaad cellen direct uit de tube in de gerechten. Zaaien van 1-2 x 10 5 cellen/100 mm schotel in een robuuste medium zoals M87A + X zal leiden tot confluentie in 4-7 dagen. We voegen choleratoxine het medium in tweede passage van proliferatieve te verhogen; cholera toxine weggelaten in primaire kweek omdat het leidt tot meerlagige cel uitgroei van organoids. </li><li> Voor het invriezen als secundaire, pellet buis bij 600 xg gedurende 5 minuten, en resuspendeer in CPMII een uiteindelijke dichtheid van 10 6 cellen / ml. Aliquot geresuspendeerd cellen in Nunc Type bevriezing ampullen, overnacht bij -80 ° C vriezer en vervolgens onmiddellijk overbrengen naar opslag in vloeibare stikstof. </li></ol></li><li> Het wordt aanbevolen om cellen van de eerste PT bewaring bevriezen enGebruik cellen van de tweede PT voor subcultuur. Extra PTS kan bevroren bewaard voor toekomstig gebruik. </li></ol>

<ol><li>Prowse, K. R., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+tissue-specific+regulation+of+mouse+telomerase+and+telomere+length%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Developmental and tissue-specific regulation of mouse telomerase and telomere length.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4818-4822 (1995).</li>
<li>Gil, J., Peters, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+INK4b-ARF-INK4a+tumour+suppressor+locus%3A+all+for+one+or+one+for+all%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of the INK4b-ARF-INK4a tumour suppressor locus: all for one or one for all.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 667-677 (2006).</li>
<li>Stampfer, M. R., Hallowes, R., Hackett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Normal+Human+Mammary+Epithelial+Cells+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Growth of Normal Human Mammary Epithelial Cells in Culture.</a> In Vitro. 16, 415-425 (1980).</li>
<li>Garbe, J. C., Bhattacharya, S., Merchant, B., Bassett, E., Swisshelm, K., Feiler, H. S., Wyrobek, A. J., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+distinctions+between+the+stasis+and+telomere+attrition+senescence+barriers+demonstrated+by+long-term+culture+of+normal+human+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular distinctions between the stasis and telomere attrition senescence barriers demonstrated by long-term culture of normal human mammary epithelial cells.</a> Cancer Res. 69, 7557-7568 (2009).</li>
<li>Chanson, L., Brownfield, D., Garbe, J. C., Kuhn, I., Stampfer, M. R., Bissell, M. J., LaBarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+is+a+dynamic+and+lineage-intrinsic+property+of+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 3264-3269 (2011).</li>
<li>Stampfer, M. R., Bartley, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+transformation+and+continuous+cell+lines+from+normal+human+mammary+epithelial+cells+after+exposure+to+benzo%28a%29pyrene%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Induction of transformation and continuous cell lines from normal human mammary epithelial cells after exposure to benzo(a)pyrene.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 2394-2398 (1985).</li>
<li>Brenner, A. J., Stampfer, M. R., Aldaz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+p16+expression+with+first+senescence+arrest+in+human+mammary+epithelial+cells+and+extended+growth+capacity+with+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Increased p16 expression with first senescence arrest in human mammary epithelial cells and extended growth capacity with inactivation.</a> Oncogene. 17, 199-205 (1998).</li>
<li>Olsen, C. L., Gardie, B., Yaswen, P., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raf-1-induced+growth+arrest+in+human+mammary+epithelial+cells+is+p16-independent+and+is+overcome+in+immortal+cells+during+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Raf-1-induced growth arrest in human mammary epithelial cells is p16-independent and is overcome in immortal cells during conversion.</a> Oncogene. 21, 6328-6339 (2002).</li>
<li>Stampfer, M. R., Garbe, J., Nijjar, T., Wigington, D., Swisshelm, K., Yaswen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+p53+function+accelerates+acquisition+of+telomerase+activity+in+indefinite+lifespan+human+mammary+epithelial+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Loss of p53 function accelerates acquisition of telomerase activity in indefinite lifespan human mammary epithelial cell lines.</a> Oncogene. 22, 5238-5251 (2003).</li>
<li>Chin, K., Ortiz de Solorzano, C., Knowles, D., Jones, A., Chou, W., Rodriguez, E. G., Kuo, W. -L., Ljung, B. -M., Chew, K., Myambo, K., Miranda, M., Krig, S., Garbe, J., Stampfer, M., Yaswen, P., Gray, J. W., Lockett, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+genome+instability+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Gene%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of genome instability in breast cancer.</a> Nat Gene. 36, 984-988 (2004).</li>
<li>Li, Y., Pan, J., Li, J. -L., Lee, J. -H., Tunkey, C., Saraf, K., Garbe, J. C., Whitley, M. Z., Jelinsky, S. A., Stampfer, M. R., Haney, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+changes+associated+with+breast+cancer+occur+as+normal+human+mammary+epithelial+cells+overcome+senescence+barriers+and+become+immortalized%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Transcriptional changes associated with breast cancer occur as normal human mammary epithelial cells overcome senescence barriers and become immortalized.</a> Mol. Cancer. 6, (2007).</li>
<li>Garbe, J. C., Holst, C. R., Bassett, E., Tlsty, T., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+p53+function+in+cultured+human+mammary+epithelial+cells+turns+the+telomere-length+dependent+senescence+barrier+from+agonescence+into+crisis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Inactivation of p53 function in cultured human mammary epithelial cells turns the telomere-length dependent senescence barrier from agonescence into crisis.</a> Cell Cycle. 6, 1927-1936 (2007).</li>
<li>Novak, P., Jensen, T. J., Garbe, J. C., Stampfer, M. R., Futscher, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Step-wise+DNA+methylation+changes+are+linked+to+escape+from+defined+proliferation+barriers+and+mammary+epithelial+cell+immortalization%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Step-wise DNA methylation changes are linked to escape from defined proliferation barriers and mammary epithelial cell immortalization.</a> Cancer Res. 69, 5251-5258 (2009).</li>
<li>Vrba, L., Garbe, J. C., Stampfer, M. R., Futscher, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+normal+human+mammary+cell+type+specific+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genom+Res%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of normal human mammary cell type specific miRNAs.</a> Genom Res. 21, 2026-2037 (2011).</li>
<li>LaBarge, M. A., Nelson, C. M., Villadsen, R., Fridriksdottir, A., Ruth, J. R., Stampfer, M. R., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mammary+progenitor+cell+fate+decisions+are+products+of+interactions+with+combinatorial+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments.</a> Integr. Biol. 1, 70-79 (2009).</li>
<li>Garbe, J. C., Pepin, F., Pelissier, F., Sputova, K., Fridriksdottir, A. J., Guo, D. E., Villadsen, R., Park, M., Petersen, O. W., Barowsky, A., Stampfer, M. R., Labarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+multipotent+progenitors+with+a+basal+differentiation+bias+during+aging+of+human+mammary+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Accumulation of multipotent progenitors with a basal differentiation bias during aging of human mammary epithelia.</a> Cancer Res. 72, 3687-3701 (2012).</li>
<li>Hammond, S. L., Ham, R. G., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+growth+of+human+mammary+epithelial+cells%3A+rapid+clonal+growth+in+defined+medium+and+extended+serial+passage+with+pituitary+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Serum-free growth of human mammary epithelial cells: rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 5435-5439 (1984).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Het menselijk borstweefsel verwerkingsmethode gepresenteerde kunnen verkrijgen van zuivere mammaire epitheelcellen van het heterogene mengsel van celtypen in de menselijke borst. Filtratie door poriën met een vaste grootte kan scheiding van verschillende delen van de borstklier (bijv. ductaal en ductale-alveolaire versus alveolaire) uit het verteerde stromale matrix. Isogene borstklieren fibroblasten kan worden verkregen aan de epitheelcellen te passen. Bevroren verteerd materiaal heeft behouden een goede levensvatbaarheid meer dan 30 jaar. Deze methode is succesvol gewerkt maar alle zeer vezelig borstweefsels en is eenvoudig uit te voeren. Andere variaties van borstweefsel verwerking bestaan ​​die niet epitheliale fracties die als levensvatbaar, schoon, of gescheiden te bieden. Plaatsing van verwerkte organoids in cultuur met een lage stress-inducerende media zoals M87A staat lange-termijn groei van HMEC met meerdere afstamming markers. HMEC die zijn gekweekt op plastic nog steeds de mogelijkheid generate 3D structuren met normale in vivo-achtige lineage relaties. Deze HMEC culturen zijn geschikt voor extensieve experimenteel onderzoek, met inbegrip van high throughput, van normaal HMEC gedrag en factoren die kunnen voortbewegen of remmen veroudering en transformatie.

<table border="1"><tbody><tr><td> Glazen petrischaal 15 cm </td><td> VWR </td><td> 89000-308 </td></tr><tr><td> Schaar 6.5 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-594 </td></tr><tr><td> Forceps 8 &quot; </td><td> VWR </td><td> 82027-436 </td></tr><tr><td> Scalpels voor eenmalig </td><td> Miltex </td><td> Vier-vierhonderdelf </td></tr><tr><td> Collagenase </td><td> SIGMA </td><td> C0130 </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> SIGMA </td><td> H3506 </td></tr><tr><td> Insuline </td><td> SIGMA </td><td> I5500 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> SIGMA </td><td> D8418 </td></tr><tr><td> Pennicillin / streptomycine </td><td> Life Technologies </td><td> 15140-122 </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Life Technologies </td><td> 15290-018 </td></tr><tr><td> Polymyxine B sulfaat </td><td> Life Technologies </td><td> 21850-029 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Life Technologies</td><td> 26140-087 </td></tr><tr><td> 0,05% trypsine 100 ml </td><td> Life Technologies </td><td> 25300-054 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Life Technologies </td><td> 11039-021 </td></tr><tr><td> HulaMixer </td><td> Life Technologies </td><td> 159-20D </td></tr><tr><td> Celzeef 100 urn </td><td> BD Falcon </td><td> 352360 </td></tr><tr><td> Mobiele zeef 40 um </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr><tr><td> Buisjes 15 ml </td><td> Greiner Bio-One </td><td> Achttienhonderdenacht-tweehonderdéénenzestig </td></tr><tr><td> Buizen 50 ml </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 227 tot 261 </td></tr><tr><td> TC schotels 10 cm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 664 tot 160 </td></tr><tr><td> TC 6 cm schalen </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 628 tot 160 </td></tr><tr><td> Cryogene vials </td><td> Nalgene </td><td> 5000-1020 </td></tr><tr><td> Heamocytometer </td><td> Hauser Wetenschappelijke </td><td> 1490 </td></tr><tr><td> Centrifugeer </td><td> Eppendorf model </td><td> 5702 </td></tr></tbody></table>

verwerking van de mens vermindering mammoplasty en mastectomie weefsels voor cultuur van de cel

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimenteel onderzoek van normale menselijke mammaire epitheelcellen (HMEC) beïnvloed en normale cellen verkrijgen abnormale eigenschappen kan worden vergemakkelijkt door in vitro kweeksystemen die beter model in vivo biologie. Het gebruik van mensen afgeleide materiaal voor onderzoek cellulaire differentiatie, veroudering, veroudering en immortalisatie is bijzonder voordelig gezien de vele belangrijke moleculaire verschillen in deze eigenschappen tussen mens en gewoonlijk gebruikt knaagdiercellen 1-2. Mammaire cellen aanwezig gunstig modelsysteem omdat grote hoeveelheden normale en afwijkende weefsels zijn gezien de frequentie van vermindering mammoplasty en mastectomie operaties. De melkklier bestaat uit een complex mengsel van vele verschillende celtypes, bijvoorbeeld epitheliale, adipose, mesenchymale, endotheliale. De epitheliale cellen zijn verantwoordelijk voor de gedifferentieerde functie borst van lactatieen ook de oorsprong van de overgrote meerderheid van de borstkankers. Wij hebben methoden ontwikkeld om borstklier chirurgische aflegstapel weefsels verwerken tot pure epitheliale componenten en mesenchymale cellen 3. Het verwerkte materiaal kan worden opgeslagen onbeperkt bevroren of gestart in primaire cultuur. Chirurgische discard materiaal naar het laboratorium en handmatig ontleed te verrijken voor epitheliale bevattend weefsel. Daaropvolgende digestie van het ontleed weefsel met collagenase en hyaluronidase strips stromale materiaal van het epitheel in het basale membraan. De verkregen stukjes van de epitheliale boom (organoids) kan worden gescheiden van de gedigereerde stroma door opeenvolgende filtratie op membranen van vaste poriegrootte. Afhankelijk poriegrootte kan fracties daarvan bestaande uit grotere ductale / alveolaire stukken kleiner alveolaire clusters of stromacellen. We hebben gezien superieure groei wanneer culturen worden geïnitieerd als organoids in plaats van als disassocieerd enkele cellen. Plaatsing van organoids in cultuur met behulp van lage-stress inducerende media ondersteunt groei op lange termijn van de normale HMEC met markers van meerdere afstamming types (myo, luminale, stamvader) 4-5. Voldoende aantallen cellen worden verkregen uit weefsel van een individu om uitgebreid experimenteel onderzoek met gestandaardiseerde cel batches, alsmede uitlezing met high throughput wijze mogelijk. Gekweekte HMEC zijn gebruikt in een breed scala van studies naar de normale processen die groei, differentiatie, veroudering, en senescentie, en hoe deze normale processen worden gewijzigd tijdens onsterfelijk en maligne transformatie 4-15,16. De effecten van groei in de aanwezigheid van extracellulaire matrix materiaal, andere celtypes en / of 3D cultuur kan worden vergeleken met groei op plastic 5,15. Gekweekte HMEC, beginnend met normale cellen, geven een experimenteel systeem tractable factoren onderzochtkunnen voortbewegen of voorkomen van menselijke veroudering en het ontstaan ​​van kanker.

Representatieve cijfers voor weefsels behoren geknipt organoids en in cultuur worden getoond in figuur 1. Onvolledig verteerd weefsel toont materiaal nog aan de buitenzijde van deze structuren en zal waarschijnlijk een fibroblast celgroei in primaire kweek, waarbij DT verwijderen. Overdigested weefsel zal minder glad buitengrenzen, en kan het langer duren om te hechten in primaire cultuur. Epitheliale uitgroei moet beginnen binnen 48-72 uur (1B, C). Kleine stukjes vasculatuur (1D) een bron van mesenchymale cellen uitgroei zijn. Epitheliale uitwassen tonen morfologisch heterogene populaties, met proliferatieve populaties die mengsels van cellen bevatten met markers geassocieerd met myo, stamvader, en luminale lineages (1E, 3C-E). De groei van de lage spanning media zoals M87A aangevuld met choleratoxine en oxytocine ondersteunt een superieure lange termijngroei van normale pre-stasis HMEC opzichte van eerdere formuleringen media (figuur 2). M87A-type media zal ook de groei van luminale en progenitorcellen doorvoeropeningen 4-8 (Figuren 3C-E, 4), daarna meeste cellen toon alleen myo lineage markers. HMEC gekweekt op plastic kunnen behouden hun vermogen om goede 3D ​​zelforganisatie vormen in micropatterned 3D microwells met luminale cellen interieur myo cellen (Figuur 4A, B), en georganiseerde structuren vormen wanneer uitgeplaat in Matrigel (4C, D). <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig1.jpg" alt="Figuur 1"/> Figuur 1. HMEC organoids en primaire cultuur. (A) Organoid met ductaal-alveolaire structuur na vertering en filtratie. (B, C) Organoids met ductaal en alveolaire structuur 2 dagen na plaatsing in de primaire cultuur, let op de begin cel outgrowth (witte pijlen). (D) Kleine bloedvat bevestigd en met het starten van fibroblast uitgroei van dezelfde culturen als B, C. (E) Epitheelcelproliferatie uitgroei van primaire organoid cultuur na 4 dagen. Lijnen worden geïdentificeerd door kleuring met antilichamen tegen K14 (rood) en K19 (groen); kernen werden gekleurd met DAPI (blauwe). Luminale (K14-/K19 +, groen), myo (K14 + / K19-, rood) en voorlopercellen (K14 + / + K19, geel) cellen zichtbaar. Ongekleurde cellen worden waargenomen in de kern organoid door onvolledige penetratie antilichaam. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig2.jpg" alt="Figuur 2"/> Figuur 2. Groei van HMEC culturen in verschillende media formuleringen. Organoids verkregen van een individu, monster 184, geïnitieerd in primaire culture met behulp van verschillende media formuleringen. Beste groei op lange termijn wordt verkregen met behulp van onze meest recente formulering, M87A + oxytocine (X) 4. Dit medium ondersteunttoename van meervoudige HMEC lijnen (zie Fig. 1E). Een eerdere media formulering MM 3 ontvangen minder heftige groei, terwijl een serumvrij medium, MCDB170 (commercieel MEGM) 17 leidt tot snelle inductie van het cycline kinase inhibitor p16 INK4a en selectie op afwijkende cellen 7,11,13. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3.jpg" alt="Figuur 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3highres.jpg"/> Figuur 3. Vergelijking van lineage diversiteit in onbeschaafde organoids en gekweekt HMEC bij 4 th passage. (A, B) FACS analyse van een woeste, enzymatisch gedissocieerd organoid voor (A) expressie van EpCAM en CD49f/alpha 6 integrine, en (B) CD227/Muc1 en CD10/CALLA. (C, D) FACS analyse van 4 th passage pre-stasis HMEC voor expressie van (C) en EpCAM CD49f/alpha 6 integrine, en (D) CD227/Muc1 en CD10/CALLA. Identificeerbare populations zijn gelabeld als LEP (uiten luminale markers EPCAM of CD227), lid van het EP (uitdrukken myo markers CD49f of CD10), of PROG (verrijkt in de CD49f + / EPCAM + bevolking). Merk op dat in de loop van de aanpassing aan de cultuur regulering van EpCAM en CD49f wijzigingen ten opzichte van onbeschaafde organoids. (E) Ongesorteerd HMEC en FACS-verrijkte LEP en EP&#39;er aan het 4 e passage gekleurd voor immunofluorescentie analyse van keratine K14 (MEP marker) en K19 (LEP marker) naar geslacht identificatie te controleren. Kernen gekleurd met DAPI verschijnen blauw. <img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4.jpg" alt="Figuur 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4highres.jpg"/> Figuur 4. Gekweekte HMEC kunnen vormen georganiseerde structuren met in vivo-achtige lineage relaties wanneer geplaatst in geschikte micro-omgevingen. (A) Pre-stasis 4 de passage HMEC waren FACS verrijkte into luminale LEP en myo MEP lineages met merkers voor CD227 en CD10, deze lijnen gecontroleerd door expressie van K14 en K19 (niet getoond). (B) Als ze samen gemengd in micropatterned microwells, de gekweekte cellen in staat waren om zelf-organisatie in dubbellagen met MEP aan de buitenkant en LEP interne [aangepast van Chanson et al.. 5]. Fluorescent gelabelde LEP (groen) en MEP (rood) werden afgebeeld met een confocale microscoop bij 0 uur, 24 uur en 48 uur na toevoeging aan de microwells (bovenste). HMEC controle werden willekeurig gelabeld met rode of groene fluorescente labels (lager). (C) Helderveld beeld van FACS-verrijkte progenitorcellen (cKit +) uitgeplaat in 3D (Matrigel) cultuur en geteeld voor 18 dagen. De resulterende structuren kunnen vertonen alveolaire morfogenese. (D) Structuren werden geëxtraheerd uit Matrigel en gekleurd met K14 en K19 te sporen; kernen werden tegengekleurd met DAPI. Immunofluorescente analyse toont georganiseerde structuren met de juiste luminale en basale polateit.

Werkwijze voor menselijke mammaire chirurgische discard materiaal wordt beschreven. Verwerkte weefsel in de vorm van organoids, onbeperkt worden opgeslagen bevroren of in kweek zijn geplaatst voor lange termijn. Deze methode maakt experimentele onderzoek van normale menselijke epitheliale celbiologie en de effecten van exogene verstoringen.

Verwerking van de mens Vermindering mammoplasty en mastectomie weefsels voor Cultuur van de Cel

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Dit protocol is bedoeld om de epitheliale delen van de borstklier te isoleren, vrij van bijbehorende borststromacellen. Begin met de geaccumuleerde dissectie van het chirurgisch afgedankte materiaal om epitheliale structuren te verrijken door middel van enzymatische vertering. Scheid de epitheliale organoïden van het stromamateriaal buiten de basementmembraan.Verwerk vervolgens de verteerde organoïden door cellezaailingen met vaste poriëngrootte om verrijkte fracties te verkrijgen. Zaai de organoïden voor directe cultuur of bevries de voorraden voor toekomstig gebruik. Uiteindelijk worden de epitheliale organoïden gebruikt om langetermijnculturen van normale humane borstepitheliale cellen te genereren.Ik ontwikkelde deze methode voor het eerst eind jaren zeventig om het veld van humane epitheliale celbiologie en carcinogenese te bevorderen. Er was overvloedig chirurgisch afgedankt materiaal van normale menselijke hersenweefsels beschikbaar. Wat er nodig was, was een methode om dit bulk heterogene materiaal te verwerken om het geschikt te maken voor pure epitheliale celcultuur en media om langetermijngroei te ondersteunen.Visuele demonstratie van deze methode is nuttig, vooral om te noteren hoe de grove dissectie wordt gedaan. Hoe zien goed verteerde organoïden eruit? De organoïden filteren en de organoïden voor cultuur plateren.Het voordeel van deze techniek is dat het schone epitheliale fracties biedt, terwijl het stroma en de epitheliale cellen intact blijven. Organoïden, zoals we hebben gevonden, geven de beste initiële groei en maximaliseren het aantal cellen dat kan worden verkregen. Twee wetenschappers van het Lawrence Berkeley National Laboratory, James Garvey en Mark LeBarge, zullen nu deze procedure demonstreren vanuit het afgedankte materiaal van chirurgische procedures.Verkrijg menselijk borstweefsel in steriele containers met buffer of compleet medium plus antibiotica bij vier graden Celsius. Snijd stukken van het weefsel en plaats ze in een grote steriele glazen schaal. Scheid de epitheliale gebieden van de stromamatrix van vetweefsel, bindweefsel en bloedvaten.Dissect voorzichtig de witte strengen van epitheliale gebieden ingebed in de gelere stromamatrix uit. Houd het materiaal met forceps vast en schraap het grof vette materiaal weg met een scalpel. Snijd vervolgens met tegenoverliggende scalpels het epitheliale weefsel in stukken van ongeveer vier millimeter om de vertering te vergemakkelijken.Breng het gedissekteerde epitheliale weefsel over in een 50 of 15 milliliter conische centrifugeerbuis. Bij zwaar fibreus weefsel. Er zal meer vast wit niet-epitheliaal materiaal zijn. Als het moeilijk is om de epitheliale cellen uit dergelijke fibreuze matrices te dissecteren.Het weefsel kan in stukken van een tot drie millimeter vierkante oppervlakte worden gesneden en apart worden verteerd. Vul de buis met het verteringsmedium dat ruwe collagenase en hoge alur-dagen bevat, waarbij een kleine luchtruimen wordt achtergelaten om tijdens rotatie te mengen. Incubeer het monster een nacht bij 37 graden Celsius op een 360-graden rotator bij acht RPM Na vertering.Pellet de monsters door centrifugatie van 600 G gedurende vijf minuten. Gooi het supernatant vet en medium weg volgens institutionele richtlijnen voor de verwijdering van menselijk weefsel. Om de weefselvertering te bewaken, verdun een kleine Eloqua van de pellet in medium en onderzoek microscopisch. Volledig verteerde organoïden zullen aangehechte stroma vertonen.Herhaal de enzymatische vertering totdat het weefsel volledig is verteerd in pure organoïden. Als een tweede nachtelijke vertering nodig is, kan de concentratie van enzymen moeten worden verlaagd om oververtering te voorkomen. Goed verteerde organoïden zullen glad uitziende ductale of ductale alveolaire structuren vertonen, vrij van aangehecht stroma.Wanneer de vertering voltooid is, resuspend het uiteindelijke pellet in medium, plaats antibiotica. Geef het verteerde monster in quats door een steriele 100 micron zeef over een steriele 50 milliliter buis. Nadat het medium in de buis is gedraind, spoel de organoïden af met drie milliliter medium.Herhaal totdat al het resuspendeerde pellet is overgebracht. Draai vervolgens voorzichtig de filter om over een steriele buis en spoel de organoïden in de buis met meer medium. Dit is de 100 micron organoïd pool.Geef nu het materiaal dat in de originele 50 milliliter buis is gedraind door een 40 micron zeef om de alveolaire structuren te scheiden van de filtraat pool van enkele cellen en kleine klonten van mesenchymale en epitheliale cellen en kleine stukken vaatweefsel. Centrifugeer de 100 micron 40 micron en filtraat pools bij 600 G gedurende vijf minuten. Reconstitueer elk monster met één milliliter van ccpm.Twee vriesoplossingen per 0,1 milliliter verpakt palaat. Bewaar bij vier graden Celsius. Plaats voorzichtig 0,1 milliliter van elk van de twee organoïd pools.Druppel voor druppel in een gelijkmatige verdeling over een of twee 35 millimeter schalen. Vermijd het krassen van het oppervlak van de schaal na een paar minuten om de organoïden te laten hechten. Voeg groeimedia langzaam toe om losraken van de organoïden te voorkomen.Incubeer vervolgens de primaire culturen bij 37 graden Celsius in een bevochtigde CO2 incubator. Zaai ook 0,1 milliliter van de filtraat pool direct op weefselcultuurplastic met fibroblastmedium. Incubeer de primaire culturen bij 37 graden Celsius in een bevochtigde CO2 incubator.Controleer na 24 tot 48 uur op celmigratie uit de organoïden en controleer na twee tot drie dagen op mitotische uitgroei van de cultuur. De cellen tot bijna confluentie, het medium om de twee tot drie dagen vernieuwend. Kleine stukken van de vaatbundel kunnen hechten en fibroblastcellen uitgroeien geven.Bij significante fibroblastgroei. Voer differentiële trippinisatie uit om de fibroblasten van de grote epitheliale patches te verwijderen. Was de cellen eenmaal in STE-buffer.Voeg vervolgens vers 0,5 milliliter STE toe om het schaaltje net te bedekken met continue microscopische observatie en zachte maar scherpe stoten van het schaaltje tegen een harde ondergrond. Zoek naar fibroblastloslating terwijl de epitheliale cellen nog steeds adhesief zijn. De primaire culturen wanneer de patches van epitheliale uitgroei bijna confluent zijn.Om de primaire cultuur te behouden en meerdere secundaire culturen te genereren, gebruik gedeeltelijke trypsinisatie. Was de cellen

processing-human-reduction-mammoplasty-mastectomy-tissues-for-cell

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

In dit rapport tonen we een systeem te isoleren en cultuur donor cellen van de muis borstklier, en orthotopically deze cellen transplantatie in ontvangende muizen om de stromale analyseren: epitheel interacties tijdens mammatumor ontwikkeling.

Borstklieren transplantatie van stromale cellen en carcinoom cellen in C57BL/6J Muizen

Primaire celcultuur met behulp van intact weefsel organoids biedt een modelsysteem dat de meercellige in vivo micro-omgeving nabootst. We ontwikkelden een serum-vrij primaire borst epitheel weefselkweek model dat gemengde celkweek geslachten en exposities gedifferentieerde morfologie bestendigt, zonder enzymatische weefsel verstoring. Borst organoids blijven nog gedurende&gt; 6 maanden.

Niet-enzymatische, Serum-vrije Tissue Culture van Pre-invasieve borstlaesies voor Spontane Generatie van Mammospheres

We hebben een nieuwe ex vivo model om de werking van hormonen in de menselijke borst bestuderen ontwikkeld. Het is gebaseerd op microstructuren weefsel geïsoleerd uit chirurgische borstweefsel monsters die weefselarchitectuur, intercellulaire interacties en paracrienen behouden.

Een<em&gt; Ex vivo</em&gt; Model naar Hormoon Actie studie in de menselijke borst

Drijvende mammosfeer-assays kunnen de subset van stamcel-achtige borstkankercellen onderzoeken die overleven in suspensie-omstandigheden en verhoogde tumorigenese vertonen wanneer ze in muizen worden geïmplanteerd. Dit protocol biedt een handige in vitro maatstaf voor sfeervormingsvermogen, een proxy voor in vivo tumorigenese, terwijl het de analyse van het stamcel-geassocieerde transcriptionele landschap vergemakkelijkt.

Mammosphere Formation Assay van menselijke borstkanker weefsels en cellijnen

Dit protocol biedt experimentele in vitro tools om de transformatie van menselijke borstcellen te evalueren. Gedetailleerde stappen naar de follow-up cel proliferatie tarief, verankering-onafhankelijke groeicapaciteit, en de distributie van cellijnen in 3D-culturen met kelder membraan matrix worden beschreven.

In Vitro Evaluatie van Oncogene Transformatie in Human Mammary Epithelial Cells

Dit experimentele protocol beschrijft de isolatie van BCSC's uit borstkankercel- en weefselmonsters, evenals de in vitro en in vivo assays die kunnen worden gebruikt om bcsc-fenotype en -functie te beoordelen.

Isolatie en functionele beoordeling van menselijke borstkankerstamcellen uit cel- en weefselmonsters

Dit protocol beschrijft de constructie van een in vitro microfysiologisch systeem voor het bestuderen van borstkanker met behulp van primair menselijk borstweefsel met kant-en-klare materialen.

Borstkanker modelleren in menselijk borstweefsel met behulp van een microfysiologisch systeem

Dit protocol bespreekt een aanpak voor het genereren van epitheliale organoïden uit primair normaal en tumor borstweefsel door middel van differentiële centrifugatie. Verder zijn instructies opgenomen voor driedimensionale kweek en immunofluorescente beeldvorming van ingebedde organoïden.

Het genereren en afbeelden van muis en menselijke epitheliale organoïden uit normaal en tumor borstweefsel zonder passaging

De huidige studie rapporteert een eenvoudiger, tijdbesparend en economisch protocol om primaire menselijke borstepitheelcellen (HMEC's) efficiënt te isoleren en te laten groeien uit kleine hoeveelheden borstweefsel. Dit protocol is geschikt voor het snel produceren van primaire HMEC's, zowel voor laboratorium- als klinische toepassingen.

Isolatie en kweek van primaire menselijke borstepitheelcellen

Dit protocol beschrijft een gedefinieerde hydrogel-gebaseerde methode om menselijke borstorganoïden te genereren die belangrijke kenmerken van mammariummorfogenese recapituleren in een gecontroleerd driedimensionaal kweeksysteem.

Een gedefinieerde hydrogel-gebaseerde methode voor het genereren van driedimensionale menselijke borstorganoïden die mammaire morfogenese recapituleren

Leer hoe u menselijk mammaweefsel uit chirurgisch afval verwerkt tot epitheliale organoïden voor celcultuur. Deze methode scheidt epitheel van stroma via enzymatische digestie en filtratie voor langdurige groei.

Verwerking van de mens Vermindering mammoplasty en mastectomie weefsels voor Cultuur van de Cel

Meer video's verkennen