Verwerking van de mens Vermindering mammoplasty en mastectomie weefsels voor Cultuur van de Cel
3 januari 2013
Werkwijze voor menselijke mammaire chirurgische discard materiaal wordt beschreven. Verwerkte weefsel in de vorm van organoids, onbeperkt worden opgeslagen bevroren of in kweek zijn geplaatst voor lange termijn. Deze methode maakt experimentele onderzoek van normale menselijke epitheliale celbiologie en de effecten van exogene verstoringen.
Dit protocol is bedoeld om de epitheliale delen van de borstklier te isoleren, vrij van bijbehorende borststromacellen. Begin met de geaccumuleerde dissectie van het chirurgisch afgedankte materiaal om epitheliale structuren te verrijken door middel van enzymatische vertering. Scheid de epitheliale organoïden van het stromamateriaal buiten de basementmembraan.
Verwerk vervolgens de verteerde organoïden door cellezaailingen met vaste poriëngrootte om verrijkte fracties te verkrijgen. Zaai de organoïden voor directe cultuur of bevries de voorraden voor toekomstig gebruik. Uiteindelijk worden de epitheliale organoïden gebruikt om langetermijnculturen van normale humane borstepitheliale cellen te genereren.
Ik ontwikkelde deze methode voor het eerst eind jaren zeventig om het veld van humane epitheliale celbiologie en carcinogenese te bevorderen. Er was overvloedig chirurgisch afgedankt materiaal van normale menselijke hersenweefsels beschikbaar. Wat er nodig was, was een methode om dit bulk heterogene materiaal te verwerken om het geschikt te maken voor pure epitheliale celcultuur en media om langetermijngroei te ondersteunen.
Visuele demonstratie van deze methode is nuttig, vooral om te noteren hoe de grove dissectie wordt gedaan. Hoe zien goed verteerde organoïden eruit? De organoïden filteren en de organoïden voor cultuur plateren.
Het voordeel van deze techniek is dat het schone epitheliale fracties biedt, terwijl het stroma en de epitheliale cellen intact blijven. Organoïden, zoals we hebben gevonden, geven de beste initiële groei en maximaliseren het aantal cellen dat kan worden verkregen. Twee wetenschappers van het Lawrence Berkeley National Laboratory, James Garvey en Mark LeBarge, zullen nu deze procedure demonstreren vanuit het afgedankte materiaal van chirurgische procedures.
Verkrijg menselijk borstweefsel in steriele containers met buffer of compleet medium plus antibiotica bij vier graden Celsius. Snijd stukken van het weefsel en plaats ze in een grote steriele glazen schaal. Scheid de epitheliale gebieden van de stromamatrix van vetweefsel, bindweefsel en bloedvaten.
Dissect voorzichtig de witte strengen van epitheliale gebieden ingebed in de gelere stromamatrix uit. Houd het materiaal met forceps vast en schraap het grof vette materiaal weg met een scalpel. Snijd vervolgens met tegenoverliggende scalpels het epitheliale weefsel in stukken van ongeveer vier millimeter om de vertering te vergemakkelijken.
Breng het gedissekteerde epitheliale weefsel over in een 50 of 15 milliliter conische centrifugeerbuis. Bij zwaar fibreus weefsel. Er zal meer vast wit niet-epitheliaal materiaal zijn. Als het moeilijk is om de epitheliale cellen uit dergelijke fibreuze matrices te dissecteren.
Het weefsel kan in stukken van een tot drie millimeter vierkante oppervlakte worden gesneden en apart worden verteerd. Vul de buis met het verteringsmedium dat ruwe collagenase en hoge alur-dagen bevat, waarbij een kleine luchtruimen wordt achtergelaten om tijdens rotatie te mengen. Incubeer het monster een nacht bij 37 graden Celsius op een 360-graden rotator bij acht RPM Na vertering.
Pellet de monsters door centrifugatie van 600 G gedurende vijf minuten. Gooi het supernatant vet en medium weg volgens institutionele richtlijnen voor de verwijdering van menselijk weefsel. Om de weefselvertering te bewaken, verdun een kleine Eloqua van de pellet in medium en onderzoek microscopisch. Volledig verteerde organoïden zullen aangehechte stroma vertonen.
Herhaal de enzymatische vertering totdat het weefsel volledig is verteerd in pure organoïden. Als een tweede nachtelijke vertering nodig is, kan de concentratie van enzymen moeten worden verlaagd om oververtering te voorkomen. Goed verteerde organoïden zullen glad uitziende ductale of ductale alveolaire structuren vertonen, vrij van aangehecht stroma.
Wanneer de vertering voltooid is, resuspend het uiteindelijke pellet in medium, plaats antibiotica. Geef het verteerde monster in quats door een steriele 100 micron zeef over een steriele 50 milliliter buis. Nadat het medium in de buis is gedraind, spoel de organoïden af met drie milliliter medium.
Herhaal totdat al het resuspendeerde pellet is overgebracht. Draai vervolgens voorzichtig de filter om over een steriele buis en spoel de organoïden in de buis met meer medium. Dit is de 100 micron organoïd pool.
Geef nu het materiaal dat in de originele 50 milliliter buis is gedraind door een 40 micron zeef om de alveolaire structuren te scheiden van de filtraat pool van enkele cellen en kleine klonten van mesenchymale en epitheliale cellen en kleine stukken vaatweefsel. Centrifugeer de 100 micron 40 micron en filtraat pools bij 600 G gedurende vijf minuten. Reconstitueer elk monster met één milliliter van ccpm.
Twee vriesoplossingen per 0,1 milliliter verpakt palaat. Bewaar bij vier graden Celsius. Plaats voorzichtig 0,1 milliliter van elk van de twee organoïd pools.
Druppel voor druppel in een gelijkmatige verdeling over een of twee 35 millimeter schalen. Vermijd het krassen van het oppervlak van de schaal na een paar minuten om de organoïden te laten hechten. Voeg groeimedia langzaam toe om losraken van de organoïden te voorkomen.
Incubeer vervolgens de primaire culturen bij 37 graden Celsius in een bevochtigde CO2 incubator. Zaai ook 0,1 milliliter van de filtraat pool direct op weefselcultuurplastic met fibroblastmedium. Incubeer de primaire culturen bij 37 graden Celsius in een bevochtigde CO2 incubator.
Controleer na 24 tot 48 uur op celmigratie uit de organoïden en controleer na twee tot drie dagen op mitotische uitgroei van de cultuur. De cellen tot bijna confluentie, het medium om de twee tot drie dagen vernieuwend. Kleine stukken van de vaatbundel kunnen hechten en fibroblastcellen uitgroeien geven.
Bij significante fibroblastgroei. Voer differentiële trippinisatie uit om de fibroblasten van de grote epitheliale patches te verwijderen. Was de cellen eenmaal in STE-buffer.
Voeg vervolgens vers 0,5 milliliter STE toe om het schaaltje net te bedekken met continue microscopische observatie en zachte maar scherpe stoten van het schaaltje tegen een harde ondergrond. Zoek naar fibroblastloslating terwijl de epitheliale cellen nog steeds adhesief zijn. De primaire culturen wanneer de patches van epitheliale uitgroei bijna confluent zijn.
Om de primaire cultuur te behouden en meerdere secundaire culturen te genereren, gebruik gedeeltelijke trypsinisatie. Was de cellen
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode om chirurgisch weggeworpen menselijk borstweefsel te verwerken tot organoïden, die bevroren bewaard of gekweekt kunnen worden voor langdurige groei. Deze techniek vergemakkelijkt de studie van de biologie van normale menselijke epitheliale cellen en de impact van externe factoren.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Onderzoek naar menselijke epitheelcellen
Achtergrond
- Menselijk borstweefsel wordt vaak weggegooid tijdens chirurgische ingrepen.
- Er is behoefte aan methoden om epitheelcellen te isoleren van stromale componenten.
- Organoïden bieden een levensvatbaar model voor het bestuderen van de biologie van epitheelkweken.
- Deze methode is ontwikkeld om onderzoek naar carcinogenese en celbiologie te verbeteren.
Doel van de studie
- Om epitheelcellen uit melkklierweefsel te isoleren.
- Om een betrouwbare methode te creëren voor de langdurige kweek van menselijke mammaire epitheelcellen.
- Om experimentele analyse van de celbiologie en perturbaties mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Dissectie van chirurgisch afvalmateriaal om epitheliale structuren te verrijken.
- Enzymatische digestie om epitheliale organoïden van stromaal materiaal te scheiden.
- Filtratie door celzeven om verrijkte organoïde-fracties te verkrijgen.
- Kweek of invriezen van organoïden voor toekomstig gebruik.
Belangrijkste resultaten
- Zuivere epitheliale organoïden uit borstweefsel succesvol geïsoleerd.
- De mogelijkheid aangetoond om deze organoïden gedurende langere perioden te kweken.
- Visuele begeleiding geboden voor de dissectie- en verwerkingsstappen.
- Aangetoond dat organoïden een optimale groei en celopbrengst opleveren.
Conclusies
- De methode maakt een effectieve studie van menselijke mammaire epitheelcellen mogelijk.
- Het zorgt voor een zuivere scheiding van epitheelcellen van het stroma.
- Deze techniek kan het onderzoek naar epitheelbiologie en kanker verder bevorderen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Betrouwbare verwerking van chirurgisch weefsel uit de menselijke melkklier tot pure epitheliale organoïden maakt gestandaardiseerde, ziekterelevante cellsystemen mogelijk voor vroege ontdekking en mechanische risicoreductie in oncologie- en verouderingsonderzoek. Deze aanpak ondersteunt het voorspellende vertrouwen bij targetvalidatie en functionele studies door schaalbare, lineage-geverifieerde menselijke celmodellen te bieden. De methode pakt een kritiek omslagpunt aan voor translationele continuïteit en portfolio-triage in preklinische R&D.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & validatie van het target
- Maakt onderzoek naar mensspecifieke pathways bij epitheliale cel-differentiatie, senescentie en transformatie mogelijk.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door het leveren van lineage-geverifieerde, fysiologisch relevante celpopulaties.
- Verhoogt het voorspellende vertrouwen in target-validatie door gestandaardiseerde, reproduceerbare celbatches.
- Maakt high-throughput experimenteel onderzoek mogelijk met behulp van primair menselijk materiaal.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt gevalideerde, zuivere epitheliale fracties voor robuuste assay-ontwikkeling en compound-screening.
- Ondersteunt reproduceerbaarheid en schaalbaarheid door batch-standaardisatie en cryopreservatie van organoïden mogelijk te maken.
- Verbetert de assay-gereedheid door meerdere lineage-markers en functionele diversiteit te behouden.
- Maakt een betrouwbare evaluatie van compound-effecten in ziekte-relevante menselijke systemen mogelijk.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekte-relevante biologie voor de ontdekking en validatie van translationele biomarkers.
- Waarborgt continuïteit van vroege ontdekking tot preklinische validatie met behulp van menselijke modellen.
- Vermindert het risico op soortspecifieke artefacten door menselijk weefsel te verkiezen boven knaagdiermodellen.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling met fysiologisch relevante gegevens.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode voor weefselverwerking bevindt zich op het snijvlak van vroege ontdekking en preklinisch onderzoek, waardoor een continuüm ontstaat van hypothesetoetsing tot lead-identificatie en translationele studies.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden in menselijke epitheliale systemen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor assayontwikkeling en compound-profilering.
- Analytica: Biedt readouts op basis van lineage en markers voor vergelijkende analyse tussen verschillende condities.
- Translationeel onderzoek: Behouden van ziekterelateerde kenmerken voor biomarker-afstemming en preklinische modellering.
- Bedrijfsbrede hergebruik: Biedt een herbruikbaar, schaalbaar platform voor diverse experimentele behoeften binnen R&D-teams.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid en vermindert mechanistische ambiguïteit in studies met menselijke cellen.
- Operationele waarde: Standaardiseert workflows, verbetert de reproduceerbaarheid en ondersteunt schaalbare celproductie.
- Strategische waarde: Maakt gefundeerde go/no-go beslissingen mogelijk en vermindert biologische risico's in een laat stadium.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en voortgang van oncologie- en verouderingsprogramma's.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in weefseldissectie, enzymatische digestie en celcultuurtechnieken.
- Toegang tot steriele verwerkingsfaciliteiten en analytische infrastructuur voor verificatie van de cellijn is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor batchverwerking en kwaliteitscontrole.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende weefseltypen of ziektecontexten.
- Zorgvuldige monitoring van de digestie- en filtratiestappen is cruciaal om contaminatie te minimaliseren en de opbrengst te maximaliseren.
