Het analyseren van Murine Schwann Cell Development Samen Groeien Axonen
21 november 2012
Hier beschrijven we een Schwann-cellen (SC) migratie assay waarin SC kunnen ontwikkelen langs axonen verlenging.
Het doel van het volgende experiment is om de ontwikkeling van schwan-cellen langs groeiende axonen, hun natuurlijke habitat, te analyseren. Dit wordt bereikt door eerst superieure cervicale ganglia, of S cgs van muis-embryo's te explaneren op collageenmatrijzen als tweede stap. De S cgs worden behandeld met zenuwgroeifactor of NGF, wat axonale groei van de SCG-neuronen op een coronale manier bevordert.
Naast axonale groei vanuit de X explan kunnen endogene schwan-cellen worden waargenomen die langs de uitgebreide axonen naar de periferie migreren. Schwan-celontwikkeling kan worden geanalyseerd door middel van time-lapse beeldvorming en ook door eindpuntanalyis van gefixeerd weefsel, wat afstandsmetingen mogelijk maakt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de scratch migratie-assay, is dat de natuurlijke habitat van de zwaancells in deze assay is opgenomen.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal. Aangezien de juiste samenstelling van de collageenmatrijzen en de juiste dissectie van de sgs de sleutel tot succes zijn. Deze stappen zijn niet bijzonder moeilijk te leren.
Ze hebben gewoon eerst oefening nodig. Terwijl we in een weefselkweekkap werkten, begrepen we onze voorwaarden met alle oplossingen op ijs. Bereid het stockkweekmedium en rattenstaartcollageen voor volgens de instructies in het geschreven protocol.
Meng 800 microliters rattenstaartcollageen met 210 microliters van het stockmedium. Zonder het introduceren van bubbels, zou de oplossing een rode kleur moeten behouden. Als de oplossing geel wordt, dan is de Ratal collageenoplossing te zuur en moet deze opnieuw worden gemaakt met een grotere concentratie natriumhydroxide. Pipetteer 100 micro van de oplossing in elk putje van een multiputtenplaat en zorg ervoor dat de bodem van elk putje volledig bedekt is.
Plaats de schalen in een bevochtigde weefselkweekincubator ingesteld op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende twee uur. Na de oogst worden E 16 tot E 18 embryo's in een petrischaal met PBS geplaatst en vervolgens van de amnion ontdaan en onthoofd op het niveau van de C clavicular. De kop en nekgebieden worden vervolgens overgebracht naar een schaal met siliconenbodem, en terwijl door een dissectiemicroscoop wordt gekeken, worden insectennaalden gebruikt om het weefsel in de submandibulaire en claviculaire gebieden vast te pinnen.
Gebruik nu pincetten om de huid en onderhuids weefsel van het submandibulaire gebied te verwijderen. Verwijder vervolgens de submandibulaire speekselklieren om de supra hyoid, infra hial en sternocleidomastoideusspieren te onthullen. Gebruik vervolgens pincetten om voorzichtig de infra hial en sternocleidomastoideusspieren te verwijderen om de larynx en trachea te onthullen.
Grijp de trachea met de pincetten en til de trachea en de larynx omhoog. Zodra de larynx en trachea zijn verwijderd, zijn de halsslagaders zichtbaar, aan beide kanten van de prevertebral spieren. De superieure cervicale ganglia bevinden zich in de bifurcatie van de halsslagaders en kunnen worden geïdentificeerd als een ovale vorm.
Gebruik pincetten en een naaldhouder gemonteerd met een insectensnaar om de superieure cervicale ganglia te verwijderen en plaats ze in een nieuwe schaal met PBS. Vervolgens worden alle bloedvaten of aangesloten weefsel van de ganglia verwijderd. Met behulp van spuitnaalden worden de gelatineerde collageengels uit de incubator verwijderd en worden spuitnaalden gemonteerd op spuiten gebruikt om de ganglia over te brengen naar de gels. Plaats de explanten in de weefselkweekincubator ingesteld op 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide en vochtige omstandigheden gedurende één tot twee uur.
Na één tot twee uur incubatie worden de superieure cervicale ganglion explanten uit de weefselkweekincubator gehaald en wordt 100 microliters neuro basaal medium met B 27 supplement, glutamine en antibiotica toegevoegd aan elke X explan. Vervolgens wordt ook 200 microliters neuro basaal medium met 60 nanogram per milliliter NGF toegevoegd aan de putjes om axonale groei te bevorderen.
Teststoffen kunnen ook op dit moment worden toegevoegd, wat wordt gedefinieerd als dag in vitro nul om het effect op zwaancells die al zijn begonnen met migreren langs te bestuderen. Stofstoffen kunnen drie dagen in vitro worden toegediend door 180 microliters van de bestaande media te verwijderen en te vervangen door 200 microliters media met de stof van belang en NGF bij dubbele eindconcentratie, time-lapse beeldvorming wordt uitgevoerd met behulp van een omgekeerde microscoopopstelling die parallelle celkweekincubatie en time-lapse beeldvorming mogelijk maakt om verschillende teststoffen te vergelijken. In één experiment wordt aanbevolen om aan het einde van het experiment een multi-positie-instelling te gebruiken.
Na het fixeren van de explanten in de kweekschalen met 4% PFA gedurende drie tot vier uur en het wassen met PBS, voer de immunohistochemie uit om de X explant als de SCG te valideren. Blokkeer het weefsel met PBS dat 10% normaal ezelsserum en 2% tritton X 100 bevat gedurende twee uur. Volg vervolgens met primaire antilichaam incubatie in blokkeeroplossing gedurende de nacht. De volgende dag na primaire antilichaam incubatie, breng de X explan bevattende gels over naar een 24-puttenplaat na wassen met PBS. Incubeer vervolgens met fluorescentie-gelabelde secundaire antilichamen gedurende twee uur terwijl ze beschermd zijn tegen licht, was vervolgens met PBS en incubeer met dappy-oplossing gedurende 10 minuten.
Na meerdere keren wassen, plaats de collageengels met de X explan op een microscoop, schuif ze droog en monteer vervolgens met veal. Gebruik een standaard fluorescentiemicroscoop om beelden te verkrijgen voor latere kwantitatieve analyse. Het is handig als de microscoopsoftware in staat is om metadata op te nemen.
Kwantitatieve analyse van verkregen beelden kan worden uitgevoerd met Fiji of ImageJ-software, die gratis kan worden gebruikt voor wetenschappelijke toepassingen. Axonale groei van een schematisch SCGX EXPLAN gedurende vier dagen in vitro wordt gedemonstreerd in deze film. De immunohistochemie kan op
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een migratie-assay voor Schwanncellen waarmee de ontwikkeling van Schwanncellen langs uitgroeiende axonen, hun natuurlijke omgeving, kan worden waargenomen.
Belangrijkste Onderdeelen van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Schwanncellen (SCs) zijn cruciaal voor de regeneratie van perifere zenuwen.
- Inzicht in de migratie van SCs is essentieel voor het begrijpen van de mechanismen van zenusherstel.
- Bestaande assays weerspiegelen mogelijk niet nauwkeurig de natuurlijke omstandigheden van SCs.
- Deze studie maakt gebruik van een nieuwe assay om de omgeving van SCs beter na te bootsen.
Doel van de studie
- Om de ontwikkeling van Schwann-cellen langs groeiende axonen te analyseren.
- Om de migratie van SC te observeren in een gecontroleerde omgeving.
- Om traditionele migratie-assays te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Explantatie van superieure cervicale ganglia (SCG's) uit muisembryo's.
- Kweek van SCG's op collageenmatrices.
- Behandeling met nerve growth factor (NGF) om axonale groei te bevorderen.
- Time-lapse imaging en eindpuntsanalyse van gefixeerd weefsel voor afstandsmetingen.
Belangrijkste resultaten
- Er werd waargenomen dat SC's migreerden langs de verlengde axonen.
- De assay bootste effectief de natuurlijke habitat van Schwanncellen na.
- Afstandsmetingen leverden kwantitatieve gegevens op over de migratie van SC's.
- De methode vertoonde voordelen ten opzichte van traditionele scratch-migratieassays.
Conclusies
- Deze assay biedt een nauwkeuriger model voor het bestuderen van het gedrag van SC.
- De resultaten verbeteren het begrip van de ontwikkeling van SC in perifere zenuwen.
- De methode kan worden toegepast voor verder onderzoek naar zenuwregeneratie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Deze assay maakt directe observatie mogelijk van de migratie van Schwanncellen langs fysiologisch groeiende axonen, waardoor een fysiologisch relevanter model wordt geboden voor het bestuderen van de ontwikkeling van perifere zenuwen en herstelmechanismen. Door het natuurlijke axonale substraat te integreren, wordt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van targets voor neurotherapeutische ontdekking verbeterd, in het bijzonder bij het verminderen van risico's met betrekking tot mechanismen van axonale geleiding en gliale ondersteuning. Het systeem ondersteunt vroege discovery-workflows door kwantitatieve migratiegegevens te genereren die kunnen bijdragen aan lead-identificatie en de selectie van preklinische modellen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen met betrekking tot axonale-gliale interacties en het verduidelijken van signaalpaden bij de ontwikkeling van het perifere zenuwstelsel mogelijk.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door het valideren van functionele target-engagement in een ziekterelevant systeem dat endogene migratie van Schwann-cellen nabootst.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream-workflows door een reproduceerbaar platform vast te stellen voor de analyse van de migratie van Schwann-cellen.
- Operationele waarde: Pakt de standaardisatie van assays en het genereren van kwantitatieve output aan, waardoor een betrouwbare evaluatie van verbindingen in migratiegebaseerde screenings mogelijk wordt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Bespreekt de relevantie voor ziekten en de afstemming van translationele biomarkers door het modelleren van een sleutelproces in de regeneratie van perifere zenuwen.
- Operationele waarde: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door een mechanistische readout te bieden voor risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van Early Discovery tot Lead Identification en preklinisch onderzoek, ter ondersteuning van hypothesetoetsing, pathway-verduidelijking en biologische risicoreductie in pijplijnen gericht op neurobiologie.
- Discovery Biology: Legt uit hoe de methode bijdraagt aan hypothesetoetsing, padverduidelijking of biologische risicoreductie van axonale groeiprocessen en gliale migratie.
- Screening: Beschrijft de gereedheid van de assay, reproduceerbaarheid of kwantitatieve resultaten wanneer het artikel dit ondersteunt, specifiek afstandmetingen van de migratie van Schwann-cellen langs axonen.
- Analytics: Benadrukt metingen, read-outs of statistische resultaten die teams helpen om condities te vergelijken, inclusief kwantificering van de migratieafstand via analyse van gefixeerd weefsel en time-lapse imaging.
- Translational Research: Verbindt de methode met preklinische continuïteit of biomarker-afstemming enkel wanneer de bron dit ondersteunt, met de focus op mechanismen van perifere zenuwregeneratie.
- Enterprise Reuse: Presenteert de methode als een herbruikbare capaciteit in plaats van een eenmalige techniek, aanpasbaar binnen diverse neurotherapeutische ontdekkingsprogramma's.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid, doelwitvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit in axonale-gliale communicatie.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van assays voor Schwanncelmigratie op collageenmatrices.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium binnen neuroregeneratieve programma's.
- Impact op het portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van kwantitatieve migratiegegevens.
Overwegingen voor implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in embryonale dissectie, weefselkweek en immunofluorescentietechnieken.
- Behoeften aan instrumentatie en analytische infrastructuur omvatten omgekeerde microscopen voor time-lapse imaging en fluorescentiedetectiesystemen.
- Eisen voor standaardisatie tussen teams voor de bereiding van de collageenmatrix, de behandeling van explantaten en protocollen voor antilichaamvalidatie.
- Overwegingen voor adaptatie over verschillende modelsystemen, in het bijzonder voor het uitbreiden van de assay naar andere neurale ganglia of transgene Schwann-celreporters.
- Praktische beperkingen op basis van het bronmateriaal omvatten de afhankelijkheid van de beschikbaarheid van embryonaal weefsel en de noodzaak voor een nauwkeurige bereiding van de collageengel om zure condities te vermijden die de axonale groei verstoren.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:27
Preparation of Collagen Gels
2:27
Dissection of Embryonic Superior Cervical Ganglia
4:34
Treatment of Superior Cervical Ganglion Explants
5:55
Immunohistochemistry and Quantification of Schwann Cell Migration Distances
7:38
Results: Schwann Cell Development Along Growing Axons
9:12
Conclusion
