Name: Het analyseren van Murine Schwann Cell Development Samen Groeien Axonen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Leer een Schwann-celmigratie-assay om celontwikkeling langs groeiende axonen te analyseren met muizembryo's. Deze methode biedt inzicht in perifere zenuwregeneratie en verbetert traditionele technieken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Urmas Arumae bedanken voor het delen van een collageen-protocol en Jutta Fey en Ursula Hinz voor een uitstekende technische bijstand. Verder willen we Christian F. Ackermann, Ulrike Engel en de Nikon Imaging Center van de Universiteit van Heidelberg en ook Joachim Kirsch bedanken voor zo vriendelijk te helpen voor de video shoting. Het werk werd deels gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 592).

1. Bereiding van collageengels <ol><li> Bereid een voorraad medium, dat 455 ul 10x MEM, 112 ul 7,5% NaHCO3, 50 pl glutamine en NaOH. De concentratie en de hoeveelheid NaOH afhankelijk van de rat-tail collageen preparaat (zie 1.2), het uiteindelijke volume van de voorraad medium dat 1000 pi. </li><li> Bereid rat-tail collageen volgens Ebendal (1). Sla de collageenoplossing bij 4 ° C. Een verslechtering van de collageenoplossing kon niet worden vastgesteld. Na voorbereiding van een nieuwe partij, een schatting van de NaOH-concentratie die nodig is voor de voorraad medium (zie 1.1). Gebruik de pH-indicator van het medium voor titratie van de hoeveelheid en concentratie van NaOH. 800 ul zure rat-tail collageen moet een kleur rood te zetten wanneer het wordt gemengd met 210 ul van de voorraad medium. Indien de concentratie van NaOH te laag is collageen oplossing geel vanwege de pH indicator van het medium. Voeg de collageen aan het medium en meng zonder proucing bellen. Voer de volgende stappen op het ijs. De polymerisatie binnen 2 uur na de collageenoplossing en stock medium zijn gemengd en de nieuwe oplossing geïncubeerd bij 37 ° C. Test dit voordat een experiment. 1,3) Meng 800 ul van collageen oplossing met 210 ul van voorraad medium (zie 1.2). Plaats 100 ul van deze oplossing in putjes van een 8 goed kamer dia. Incubeer de glaasjes bij 37 ° C, 5% CO2 en vochtige omstandigheden in een celkweek incubator. Bereid de collageen gels onder een celcultuur bank en steriele omstandigheden. Het collageen verstijfselt binnen 2 uur. </li></ol> 2. Dissectie van embryonale SCGS <ol><li> Oogst embryo&#39;s van de tijd zwangere muizen (E16-18) uit de baarmoeder en bewaar ze in PBS tot nader nodig. </li><li> Prepareer een embryo van het amnion. Onthoofden het embryo caudale van de claviculaire niveau. Bevestig de kop op een silicium onderste schaal met &quot;insect-naalden&quot;. De ventrale zijde van het hoofd mee te maken heeft u eend moet je de submandibulaire regio te zien. De fixatie kan gemakkelijker voorbereiding. </li><li> Verwijderen van de huid van de submandibulaire regio links en rechts en daarmee de subcutane bindweefsel. </li><li> Verwijder de submandibulaire speekselklieren van hun locatie om van het uitzicht te wissen op het tongbeen, de infrahyoidal spieren en de m. sternocleidomastoideus. </li><li> Verwijder voorzichtig deze spieren om de weergave te wissen op het strottenhoofd en de luchtpijp. Verwijder de luchtpijp en het strottenhoofd. De halsslagaders zijn dan zichtbaar aan beide kanten op de prevertebrale spieren. De SCG ligt in de bifurcatie van de halsslagader en heeft een ovale vorm. Verwijder voorzichtig de ganglia en plaats ze in PBS. Verwijder voorzichtig de ganglia van de dissectie-instrumenten als ze vasthouden aan hen. Het is gunstig voor forceps en een naaldhouder bevestigd met een &quot;insect naald&quot; voor de SCG verwijderen gebruiken. </li><li> Eenmaal in PBS, slaan de ganglia bij kamertemperatuur in PBS tot ontleed enough ganglia. Reinig vervolgens de achterwortelganglia van bloedvaten en bindweefsel. Voer de SCG dissectie en schoonmaken onder een dissectie microscoop onder een laminaire stroming bank. </li><li> Plaats tenslotte de geëxplanteerde ganglia op het verstijfselde collageen gels met behulp van injectienaalden gemonteerd op een injectiespuit een eenvoudige bediening. </li><li> Incubeer de SCG explantaten op gegelatiniseerde collageen in een celkweek incubator bij 37 ° C met 5% CO2 en vochtige omstandigheden. </li></ol> 3. Behandeling van SCG Explantaten <ol><li> Na 1-2 uur incubatie dekking van de SCG explantatie van collageen met 100 ul Neurobasal celcultuur medium dat B27 supplement, glutamine en antibiotica. Nu de putjes van de kamer&#39;s bevatten een volume van 200 ul (100 ul gel en 100 ul medium). Voeg een 200 ul van het medium, maar nu met NGF (60 ng / ml) om axonale groei te bevorderen. Dienovereenkomstig de uiteindelijke NGF concentratie 30 ng / ml. </li><li><ol class="lalpha"><li> Om het begin van de SC migratie te onderzoeken, direct toe te voegen bijkomende factoren op dag in vitro 0 (DIV0). Los de factoren in het medium met NGF in de benodigde dubbele concentratie (2). </li><li> Om het effect op SCS die reeds begonnen migreren langs axonen analyseren voeg extra factoren DIV3 tot DIV4 (mogelijke stop van het experiment). Daartoe verwijder 180 ul van de oplossing op DIV3 en voeg 200 ul nieuwe medium dat NGF en andere factoren van belang bij de dubbele concentratie (2). </li></ol></li></ol> 4. Time-lapse imaging Gebruik een omgekeerde microscoop voor analyses. Verschillende doelen worden gebruikt, waarin het gezichtsveld en vergroting. Een belangrijk aspect is echter de werkafstand van de gebruikte doel, zoals beeldvorming van de SCG explantaten wordt uitgevoerd door het objectglaasje en collageengel. De opname snelheid van 1/10-30 minuut toonde goede resultaten (2). Echter, dit aspect moet worden aangepast aan de wetenschappelijke vraag. Een normale CCD camera kan worden gebruikt voor beeldopname. Voor time lapse imaging een celkweek incubatiekamer moet worden gehecht aan de objecttafel van de microscoop. Incubeer het weefsel tijdens imaging bij 37 ° C met 5% CO2 en vochtige omstandigheden. Start het incubatiesysteem een ​​uur voor de start van beeldvorming. Hierdoor kan de microscoop delen (bijv. doel) met de kamer dia aanpassen aan de temperatuur en voorkomt temperatuur veroorzaakte drift. Definieer specifieke analyses (binnen explant op en tussen verschillende explantaten) met behulp van de microscoop software en een software-gecontroleerde gemotoriseerde fase (meervoudig setup) voor gelijktijdige analyse van verschillende toegepaste omstandigheden de SCG explantaten. Voor time-lapse imaging wildtype weefsel en weefsel van transgene dieren kunnen worden gebruiktmarkeren van de SCS (S100B: GFP) (3). Voor grafische fluoroforen een fluorescerende lichtbron moet worden geïmplementeerd in de micropscope setup. Gebruik standaard filters. 5. Kwantificering van SC migratie afstanden <ol><li> Op het eindpunt (DIV4 bijvoorbeeld), bevestig de collageengels met 4% PFA in de kamer glijbaan voor 3-4 uur. Achtereenvolgens wassen collageengels 5 keer gedurende 10 minuten met PBS. Toepassing standaardprotocollen voor immunocytochemie (2). Als je nieuw bent in de voorbereiding van SCGS, controleert de identiteit van het ganglion als een sympathieke ganglion door immunohistochemie tegen tyrosine hydroxylase (TH) een gemeenschappelijke marker voor catecholaminerge cellen. Tijdens immunohistochemie (na het primaire antilichaam), overdragen bevattende explant collageengels aan platen met 24 putjes, die een groter volume, wat gunstig is voor het wassen van de gels zijn. </li><li> Na immunohistochemie, plaatst u voorzichtig het collageen gels op glasplaatjes. VoorzichtigVerwijder de resterende oplossing en laat het collageen drogen / krimpen tot twee dimensies. Dit maakt een eenvoudige metingen van afstanden (2). Daarna monteert u de monsters. </li><li> Tenslotte meet de migratie afstanden met behulp van Fiji (NIH)-software. Geen speciale plugins nodig daartoe. Om een ​​correcte metingen in micrometer mogelijk te maken, de correcte beeldvorming metadata en de instellingen onder de Fiji-, beeld-en schaal. Ook gebruik maken van Fiji voor de kwantificering van cellen. </li></ol>

<ol><li>Ebendal, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEbendal%2C+T+%22Use+of+collagen+gels+to+bioassay+nerve+growth+factor+activity%22">Use of collagen gels to bioassay nerve growth factor activity</a>. Rush, R. A. IBRO Handh, John Wiley & Sons Ltd. (1989).</li>
<li>Heermann, S., SchmÃcker, J., Hinz, U., Rickmann, M., Unterbarnscheidt, T., Schwab, M. H., Krieglstein, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin+1+type+III%2FErbB+signaling+is+crucial+for+Schwann+cell+colonization+of+sympathetic+axons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Neuregulin 1 type III/ErbB signaling is crucial for Schwann cell colonization of sympathetic axons.</a> PloS One. 6 (12), e28692(2011).</li>
<li>Zuo, Y., Lubischer, J. L., Kang, H., Tian, L., Mikesh, M., Marks, A., Scofield, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia%2C+neurons%2C+macrophages%2C+and+dendritic+cells+for+vital+examination%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience.+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> The Journal of Neuroscience. The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (49), 10999-11009 (2004).</li>
<li>Levi-Montalcini, R., Booker, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EXCESSIVE+GROWTH+OF+THE+SYMPATHETIC+GANGLIA+EVOKED+BY+A+PROTEIN+ISOLATED+FROM+MOUSE+SALIVARY+GLANDS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">EXCESSIVE GROWTH OF THE SYMPATHETIC GANGLIA EVOKED BY A PROTEIN ISOLATED FROM MOUSE SALIVARY GLANDS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 46 (3), 373-384 (1960).</li>
<li>Meintanis, S., Thomaidou, D., Jessen, K. R., Mirsky, R., Matsas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuron-glia+signal+beta-neuregulin+promotes+Schwann+cell+motility+via+the+MAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The neuron-glia signal beta-neuregulin promotes Schwann cell motility via the MAPK pathway.</a> Glia. 34 (1), 39-51 (2001).</li>
<li>Yamauchi, J., Miyamoto, Y., Chan, J. R., Tanoue, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ErbB2+directly+activates+the+exchange+factor+Dock7+to+promote+Schwann+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">ErbB2 directly activates the exchange factor Dock7 to promote Schwann cell migration.</a> The Journal of cell biology. 181 (2), 351-365 (2008).</li>
<li>Anton, E. S., Weskamp, G., Reichardt, L. F., Matthew, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+and+its+low-affinity+receptor+promote+Schwann+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor and its low-affinity receptor promote Schwann cell migration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2795-2799 (1994).</li>
<li>Mahanthappa, N. K., Anton, E. S., Matthew, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+growth+factor+2%2C+a+soluble+neuregulin%2C+directly+increases+Schwann+cell+motility+and+indirectly+promotes+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial growth factor 2, a soluble neuregulin, directly increases Schwann cell motility and indirectly promotes neurite outgrowth.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 16 (15), 4673-4683 (1996).</li>
<li>Yamauchi, J., Chan, J. R., Shooter, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+regulate+Schwann+cell+migration+by+activating+divergent+signaling+pathways+dependent+on+Rho+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins regulate Schwann cell migration by activating divergent signaling pathways dependent on Rho GTPases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (23), 8774-8779 (2004).</li>
<li>Gumy, L. F., Bampton, E. T. W., Tolkovsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycaemia+inhibits+Schwann+cell+proliferation+and+migration+and+restricts+regeneration+of+axons+and+Schwann+cells+from+adult+murine+DRG%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Hyperglycaemia inhibits Schwann cell proliferation and migration and restricts regeneration of axons and Schwann cells from adult murine DRG.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 37 (2), 298-311 (2008).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., Kurokawa, H., Morimura, T., Hanyu, A., Hama, H., Osawa, H., Kashiwagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li>
<li>Park, D., Don, A. S., Massamiri, T., Karwa, A., Warner, B., MacDonald, J., Hemenway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+cell+death+using+an+Hsp90+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of cell death using an Hsp90 ligand.</a> Journal of the American Chemical Society. 133 (9), 2832-2835 (2011).</li>
<li>Shcherbo, D., Souslova, E. A., Goedhart, J., Chepurnykh, T. V., Gaintzeva, A., Shemiakina, I. I., Gadella, T. W. J., Lukyanov, S., Chudakov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+and+reliable+FRET%2FFLIM+pair+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins.</a> BMC Biotechnology. 9, 24(2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De ontwikkeling van het perifere zenuwstelsel een spannend. Wanneer de ontwikkeling is voltooid, worden axons ensheathed door SCS over de gehele lengte, die, in mensen, vaak meer dan 100 cm. Daartoe het juiste aantal vereiste SC moet worden vastgesteld tijdens de ontwikkeling en de SCS ook bewegen langs axonen zich aan de omtrek om de complete axonale dekking te garanderen. Dit geldt voor gemyelineerde maar ook voor unmeylinated axonen. In beide gevallen zijn alle axons in contact met SCS en afhankelijk van hun steun. O...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Materiaal </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> 10x MEM </td><td> Gibco </td><td> 21430 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumbicarbonaat (7,5%) </td><td> Gibco </td><td> 25080 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamine </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> NaOH </td><td> Merck </td><td> 109137 </td><td></td></tr><tr><td> NGF </td><td> Roche </td><td> 1058231 </td><td> R &amp; D # 556-NG-100 </td></tr><tr><td> Neurobasal Medium </td><td> Gibco </td><td> 21103 </td><td></td></tr><tr><td> B27 supplement </td><td> Gibco </td><td> 17504 </td><td></td></tr><tr><td> antibiotica </td><td> Gibco </td><td> 15640 </td><td></td></tr><tr><td> d-PBS </td><td> Gibco </td><td> 14040 </td><td></td></tr><tr><td> insect naalden </td><td> FST </td><td> 26.002-20 </td><td></td></tr><tr><td> injectienaald </td><td> Braun </td><td></td><td> BD # 300013 </td></tr><tr><td> 8 goed kamer slide </td><td> Lab tek </td><td> 177402 </td><td></td></tr></tbody></table>

het analyseren van murine schwann cell development samen groeien axonen

Analyzing Murine Schwann Cell Development Along Growing Axons

De ontwikkeling van de perifere zenuwen is een intrigerend proces. Neuronen sturen axonen om specifieke doelen, die bij de mens zijn vaak meer dan 100 cm afstand van de soma van het neuron innerveren. Neuronale overleving tijdens de ontwikkeling afhankelijk doel afgeleide groeifactoren maar ook op de steun van Schwann-cellen (SC). Daartoe SC ensheath axonen uit het gebied van de neuronale soma (of de overgang van centrale naar perifere zenuwstelsel) de synapsen of neuromusculaire junctie. Schwann cellen zijn derivaten van de neurale lijst en migreren als voorlopers langs nieuwe axons totdat de axon is bedekt met SC. Dit toont het belang van SC migratie voor de ontwikkeling van het perifere zenuwstelsel en onderstreept de noodzaak om dit proces te onderzoeken. Met het oog op SC ontwikkeling te analyseren, is een setup nodig die naast de SC&#39;s ook hun fysiologische substraat voor migratie, het axon omvat. Door intra-uteriene ontwikkeling <em&gt; in vivo imaging time-lapse echter niet haalbaar placentaire vertebraten zoals een muis (Mus musculus). Om dit te omzeilen, hebben we aangepast de superieure cervicale ganglion (SCG) explantatie techniek. Bij behandeling met zenuwgroeifactor (NGF) SCG explantaten verlengen axonen, gevolgd door SC precursoren migreren langs de axonen van de ganglion naar de periferie. Het mooie van dit systeem is dat de SC zijn afgeleid van een pool van endogene SC en dat ze migreren langs hun fysiologische axonen die steeds tegelijkertijd. Dit systeem is vooral intrigerend, want de SC ontwikkeling langs axonen kunnen worden geanalyseerd door time-lapse imaging, het openen van nieuwe mogelijkheden om inzicht te krijgen in SC migratie.

Axonale groei wordt vergemakkelijkt van SCG explantaten na behandeling met NGF (4) (film schema S1 figuur 1 schema). Dit proces is gemakkelijk zichtbaar door een omgekeerde microscoop en kan gevolgd worden door time-lapse imaging (film S2). Als een wetenschapper is nieuw voor ontleden SCG van muis embryo&#39;s adviseren wij een validatie van de techniek via een eenvoudige anti-tyrosine hydroxylase (TH) immunohistochemie. TH is een gemeenschappelijke marker voor catecholaminergische neur...

Hier beschrijven we een Schwann-cellen (SC) migratie assay waarin SC kunnen ontwikkelen langs axonen verlenging.

Het analyseren van Murine Schwann Cell Development Samen Groeien Axonen

The  development of peripheral nerves is an intriguing process. Neurons send out  axons to innervate specific targets, which in humans are often more than ...

Het doel van het volgende experiment is om de ontwikkeling van schwan-cellen langs groeiende axonen, hun natuurlijke habitat, te analyseren. Dit wordt bereikt door eerst superieure cervicale ganglia, of S cgs van muis-embryo's te explaneren op collageenmatrijzen als tweede stap. De S cgs worden behandeld met zenuwgroeifactor of NGF, wat axonale groei van de SCG-neuronen op een coronale manier bevordert.Naast axonale groei vanuit de X explan kunnen endogene schwan-cellen worden waargenomen die langs de uitgebreide axonen naar de periferie migreren. Schwan-celontwikkeling kan worden geanalyseerd door middel van time-lapse beeldvorming en ook door eindpuntanalyis van gefixeerd weefsel, wat afstandsmetingen mogelijk maakt. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals de scratch migratie-assay, is dat de natuurlijke habitat van de zwaancells in deze assay is opgenomen.Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal. Aangezien de juiste samenstelling van de collageenmatrijzen en de juiste dissectie van de sgs de sleutel tot succes zijn. Deze stappen zijn niet bijzonder moeilijk te leren.Ze hebben gewoon eerst oefening nodig. Terwijl we in een weefselkweekkap werkten, begrepen we onze voorwaarden met alle oplossingen op ijs. Bereid het stockkweekmedium en rattenstaartcollageen voor volgens de instructies in het geschreven protocol.Meng 800 microliters rattenstaartcollageen met 210 microliters van het stockmedium. Zonder het introduceren van bubbels, zou de oplossing een rode kleur moeten behouden. Als de oplossing geel wordt, dan is de Ratal collageenoplossing te zuur en moet deze opnieuw worden gemaakt met een grotere concentratie natriumhydroxide. Pipetteer 100 micro van de oplossing in elk putje van een multiputtenplaat en zorg ervoor dat de bodem van elk putje volledig bedekt is.Plaats de schalen in een bevochtigde weefselkweekincubator ingesteld op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende twee uur. Na de oogst worden E 16 tot E 18 embryo's in een petrischaal met PBS geplaatst en vervolgens van de amnion ontdaan en onthoofd op het niveau van de C clavicular. De kop en nekgebieden worden vervolgens overgebracht naar een schaal met siliconenbodem, en terwijl door een dissectiemicroscoop wordt gekeken, worden insectennaalden gebruikt om het weefsel in de submandibulaire en claviculaire gebieden vast te pinnen.Gebruik nu pincetten om de huid en onderhuids weefsel van het submandibulaire gebied te verwijderen. Verwijder vervolgens de submandibulaire speekselklieren om de supra hyoid, infra hial en sternocleidomastoideusspieren te onthullen. Gebruik vervolgens pincetten om voorzichtig de infra hial en sternocleidomastoideusspieren te verwijderen om de larynx en trachea te onthullen.Grijp de trachea met de pincetten en til de trachea en de larynx omhoog. Zodra de larynx en trachea zijn verwijderd, zijn de halsslagaders zichtbaar, aan beide kanten van de prevertebral spieren. De superieure cervicale ganglia bevinden zich in de bifurcatie van de halsslagaders en kunnen worden geïdentificeerd als een ovale vorm.Gebruik pincetten en een naaldhouder gemonteerd met een insectensnaar om de superieure cervicale ganglia te verwijderen en plaats ze in een nieuwe schaal met PBS. Vervolgens worden alle bloedvaten of aangesloten weefsel van de ganglia verwijderd. Met behulp van spuitnaalden worden de gelatineerde collageengels uit de incubator verwijderd en worden spuitnaalden gemonteerd op spuiten gebruikt om de ganglia over te brengen naar de gels. Plaats de explanten in de weefselkweekincubator ingesteld op 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide en vochtige omstandigheden gedurende één tot twee uur.Na één tot twee uur incubatie worden de superieure cervicale ganglion explanten uit de weefselkweekincubator gehaald en wordt 100 microliters neuro basaal medium met B 27 supplement, glutamine en antibiotica toegevoegd aan elke X explan. Vervolgens wordt ook 200 microliters neuro basaal medium met 60 nanogram per milliliter NGF toegevoegd aan de putjes om axonale groei te bevorderen.Teststoffen kunnen ook op dit moment worden toegevoegd, wat wordt gedefinieerd als dag in vitro nul om het effect op zwaancells die al zijn begonnen met migreren langs te bestuderen. Stofstoffen kunnen drie dagen in vitro worden toegediend door 180 microliters van de bestaande media te verwijderen en te vervangen door 200 microliters media met de stof van belang en NGF bij dubbele eindconcentratie, time-lapse beeldvorming wordt uitgevoerd met behulp van een omgekeerde microscoopopstelling die parallelle celkweekincubatie en time-lapse beeldvorming mogelijk maakt om verschillende teststoffen te vergelijken. In één experiment wordt aanbevolen om aan het einde van het experiment een multi-positie-instelling te gebruiken.Na het fixeren van de explanten in de kweekschalen met 4% PFA gedurende drie tot vier uur en het wassen met PBS, voer de immunohistochemie uit om de X explant als de SCG te valideren. Blokkeer het weefsel met PBS dat 10% normaal ezelsserum en 2% tritton X 100 bevat gedurende twee uur. Volg vervolgens met primaire antilichaam incubatie in blokkeeroplossing gedurende de nacht. De volgende dag na primaire antilichaam incubatie, breng de X explan bevattende gels over naar een 24-puttenplaat na wassen met PBS. Incubeer vervolgens met fluorescentie-gelabelde secundaire antilichamen gedurende twee uur terwijl ze beschermd zijn tegen licht, was vervolgens met PBS en incubeer met dappy-oplossing gedurende 10 minuten.Na meerdere keren wassen, plaats de collageengels met de X explan op een microscoop, schuif ze droog en monteer vervolgens met veal. Gebruik een standaard fluorescentiemicroscoop om beelden te verkrijgen voor latere kwantitatieve analyse. Het is handig als de microscoopsoftware in staat is om metadata op te nemen.Kwantitatieve analyse van verkregen beelden kan worden uitgevoerd met Fiji of ImageJ-software, die gratis kan worden gebruikt voor wetenschappelijke toepassingen. Axonale groei van een schematisch SCGX EXPLAN gedurende vier dagen in vitro wordt gedemonstreerd in deze film. De immunohistochemie kan op

analyzing-murine-schwann-cell-development-along-growing-axons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In dit artikel wil beschrijven stapsgewijs de...

Analyse van de Schwann-astrocyte Interacties gebruik In Vitro Testen

Genetische Studie van de regeneratie van axonen met gekweekte volwassen dorsale wortel ganglion neuronen

This video demonstrates the coculturing model of a dorsal root ganglion explant and Schwann cells. In coculture conditions, ascorbic acid promotes the differentiation of Schwann cells into myelinating forms. Myelinating Schwann cells wrap the axons multiple times to create a myelin sheath, which is essential for nerve function.

Co-culturing of a Dorsal Root Ganglion Explant with Schwann Cells for Neuron Myelination

We presenteren hier een geoptimaliseerd protocol om foetale muizen te genotyperen, kleuren en voorbereiden voor de beeldvorming van perifere nociceptor axon projecties in het hele dier, als een effectieve methode om sensorische axon groei fenotypen te beoordelen in zich ontwikkelende genetisch gemodificeerde muizen.

Whole-mount Imaging van Muis Embryo Sensory Axon Projecties

Lichtmicroscooptechnieken gekoppeld aan biochemische analyses verduidelijken de betrokkenheid van SNARE-gemedieerde exocytose bij netrine-afhankelijke axonvertakking. Deze combinatie van technieken maakt identificatie mogelijk van moleculaire mechanismen die axonvertakking en celvormverandering controleren.

Gebruik makend van gecombineerde methoden om de rol van de plasmamembraan Delivery Tijdens Axon vertakking en neuronale Morphogenesis Definieer

Dit protocol beschrijft de isolatie van dorsale wortelganglion (DRG) neuronen geïsoleerd uit ratten en de kweek van DRG neuronen op een statisch voorgerekt celkweeksysteem om de uitlijning van axonen te verbeteren, met daaropvolgende co-cultuur van Schwann-cellen (SC's) om myelinisatie te bevorderen.

Een aanpak ter verbetering van Alignment en Myelination van dorsale wortel ganglion Neuronen

Hier beschrijven we een protocol voor het visualiseren van motor neuron projectie en axon arborization in transgene Hb9::GFP muis embryo's. Na immunokleuring voor motorische neuronen, we gebruikten licht blad fluorescentie microscopie op afbeelding embryo's voor verdere kwantitatieve analyse. Dit protocol is van toepassing op andere neuron navigatie processen in het centrale zenuwstelsel.

Visualisatie van Motor Axon navigatie en kwantificering van Axon Arborization In muis embryo's met behulp van licht blad fluorescentie microscopie

Een ex vivo slice assay maakt het mogelijk om de zenuw uitgroei van de Oculomotor in real-time te laten afbeelen. Segmenten worden gegenereerd door het insluiten van E 10.5 ISLMN: GFP embryo's in agarose, snijden op een vibratome, en groeien in een podium-top incubator. De rol van Axon guidance trajecten wordt beoordeeld door remmers toe te voegen aan de cultuur media.

Ex vivo Oculomotor segment cultuur van embryonale GFP-uitdrukken van muizen voor timelapse-beeldvorming van Oculomotor zenuw uitgroei

In het cocultuursysteem van dorsale wortelganglia en Schwann-cellen kan myelinisatie van het perifere zenuwstelsel worden bestudeerd. Dit model biedt experimentele mogelijkheden om perifere myelinisatie te observeren en te kwantificeren en om de effecten van interessante verbindingen op de myelineschede te bestuderen.

In vitro myelinisatie van perifere axonen in een cocultuur van dorsale wortel ganglionexplantaten en Schwann-cellen

Tijdens de ontwikkeling van de hersenschors ontstaan neuronen en gliacellen in de ventriculaire zone die het ventrikel bekleedt en migreren ze naar het hersenoppervlak. Bij dit proces zijn veel genen betrokken. Dit protocol introduceert de techniek voor de time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen.

Time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen in embryonale hersenplakjes van muizen

Leer een Schwann-celmigratie-assay om celontwikkeling langs groeiende axonen te analyseren met muizembryo's. Deze methode biedt inzicht in perifere zenuwregeneratie en verbetert traditionele technieken.

Het analyseren van Murine Schwann Cell Development Samen Groeien Axonen

Meer video's verkennen