Name: In ovo Expressie van MicroRNA in ventrale Chick Middenhersenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-16T07:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Leer in ovo-elektroporatie van specifieke hersengebieden in kippenembryo's. Deze methode onderzoekt de rol van microRNA's in de ontwikkeling van het ventrale middenhersen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij erkennen K. Mikic, die naar de eerste fase van deze film en M. Nicolescu voor de miR beeld bijgedragen. C. Huber werd ondersteund door een beurs van de IZKF van de Universtitätsklinikum Tübingen, A. Alwin Prem Anand door de Fortune programma van de Universtitätsklinikum Tübingen.

1. Eisen voor In ovo Elektroporatie <ol><li> Voorbereiden van de vectorconstruct: miR sense en antisense primers werden ontworpen na de instructies van Ambion, getemperd en geligeerd in Apal / EcoRI verteerd pSilencer U6.1 vector. Na een succesvolle transformatie van de verkregen klonen werd gekweekt en pSilencer plasmide werd geïsoleerd door alkalische lysis methode waarbij een Qiagen midi bereiding kit. </li><li> Elektroden: Elektroden kunnen worden gekocht of gemakkelijk worden gebouwd 13. Wij gebruiken zelfgemaakte elektroden van platina draad (Φ = 0,2, 0,25 of 0,5 mm diameter) of in sommige gevallen een nog kleinere wolfraam draadelektrode (Φ = 0,1 mm) 8 afhankelijk van het gebied dat we willen elektroporatie. Verzengende weefsel te voorkomen, gebruiken we in de regel de dichter bij het weefsel hoe dunner de elektroden. Voor brede elektroporatie van middenhersenen, maken we gebruik van 0,5 mm platina draden gesoldeerd op een messing / roestvast stalen buisas en een elektrodehouder met een afstand van 3-5 mm (figuur 1) vast. Tot specifieke elektroporatie maken we 0,25 mm platinadraad anoden en 0,2 mm platina draad of 0,1 mm wolfraam voor de kathode met een afstand van ongeveer 1 mm of minder. </li><li> Oplossingen: Zijn de volgende oplossingen klaar: <ol><li> Geautoclaveerd kip Ringer, pH 7,5 (9,0 g NaCl, 0,42 g KCl, 0,24 g CaCl2, oplossen in 1 liter gedestilleerd water). </li><li> PBS (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 0,24 g KH 2 PO 4, 1,44 g Na 2 HPO 4, oplossen in 1L gedestilleerd H 2 O). </li><li> Snel groen: voorraad-oplossing 10 mg / ml gedestilleerd H 2 O </li><li> Langzaam drogende inkt (minder schellak en dus minder vergiftiging voor het embryo). Opmerking: Een blauwe dichroïsche filter bevestigd aan een vezeloptische lamp zoals beschreven in Canto-Soler en Adler 14 verbetert het contrast en kan de noodzaak om inkt te injecteren elimineren. </li></ol></li></ol><img src="/files/ftp_upload/50024/50024fig1.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50024/50024fig1highres.jpg"/> Figuur 1. Schematische weergave van de elektroden en de elektrode houder. (A, B, C) ​​platina draad werd gesoldeerd aan een zijde van een roestvrij stalen buisvormige schacht. Een gat was geboord in de andere kant van de buisvormige schacht dus die stekkers kunnen passen inch (A) Rood en blauw gekleurde draden waren verbonden met de pennen. Aan de andere kant werd de draad gemonteerd banaan connectoren die werken met de elektrische aansluitingen van de electroporator. (A, C) De platina draad werd gebogen in een engel van 90 °. Een laagje nagellak geïsoleerd de as boven de bocht. 2. Voorbereidingen Direct Voordat In ovo Elektroporatie <ol><li> Bereid het volgende materiaal: <ol><li> Verdunnen Ink met kip Ringer 01:06, voeg Antibiotica-Anti-schimmel oplossing (100x van Gibco) 1:100. </li><li> Bereid vector oplossing: 1-2 ug / ul per specifieke DNA in H2O aangevuld met Fast Green (01:20). </li><li> Steriliseren forceps, scharen, wolfraam naald en elektroden met 70% ethanol. </li><li> Trek micropipetten voor nucleïnezuur injectie van borosilicaatglas capillairen (lengte buitendiameter: 100 mm x 0.9 mm). We gebruiken een eenvoudige trekker PUL-1 (WPI, Berlijn) met de in tabel 1 instellingen. </li><li> Stel de parameters van de elektroporator zoals getoond in Tabel 2. </li></ol></li></ol><table border="1" ><tbody><tr><td fo:width="1in"> Parameters </td><td fo:width="1in"> Waarden </td></tr><tr><td> Warmte </td><td> 350 </td></tr><tr><td> Trek </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Snelheid </td&gt; <td> 50 </td></tr><tr><td> Vertraging </td><td> 200 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Instellingen voor PUL-1 <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1.5in"> Parameters </td><td fo:width="1.5in"> Waarden </td></tr><tr><td> Frequentie </td><td> 50 Hz </td></tr><tr><td> Vertraging </td><td> 20-50 msec * </td></tr><tr><td> Breedte </td><td> 20 msec </td></tr><tr><td> Spanning </td><td> 8-25 V * </td></tr><tr><td> Pols </td><td> 3-5 keer </td></tr><tr><td colspan="2"> * Afhankelijk van de elektrode diameter en afstand. Alstublieftrekening mee houden bij het veranderen van een van de parameters. </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Instellingen voor de Pulse Stimulator <ol start="2"><li> Bereid kippenembryo&#39;s voor elektroporatie: <ol><li> Incubeer bevruchte kippeneieren op hun lange zijde bij 37 ° C met 65% luchtvochtigheid voor 39 uur tot embryo&#39;s tussen Hamburger &amp; Hamilton (HH) verwerven stadia 15 9-11. Het embryo vestigt op het bovenste gedeelte van het ei, dus moet je markeren met een potlood lijn. </li><li> Ontsmet de eieren met 70% ethanol. </li><li> Doorboren van het ei op zijn bredere kant, waar de luchtspouw moet zijn. </li><li> Verwijder 1-2 ml eiwit. Dit zal het embryo los van de eierschaal. </li><li> Cello-tape de eierschaal om granaatscherven vallen op het embryo te vermijden. Gebruik een schaar om een ​​klein venster in de eierschaal rond het potlood lijn snijden. </li><li> Injecteer een beetje inktonder het gebied opaca het embryo zichtbaar. </li><li> Maak een snee in de vitelline membraan met een geslepen wolfraam naald tot een betere toegankelijkheid van het embryo voor nucleïnezuur injectie en elektroporatie bereiken. </li></ol></li></ol> 3. Elektroporatie en incubatie <ol><li> Voeg een paar druppels warm Ringer-oplossing op de embryo&#39;s. Dit verlaagt de embryo, oververhitting, plakken van de elektroden aan het weefsel en een medium voor de stroom tussen de twee elektroden. </li><li> Injecteer de vector vloeistof in het lumen van de neurale buis middenhersenen niveau. Als de DNA-expressievector bevat geen reportergen (bijv. EGFP), voeg een iets lagere concentratie reportergen vector (1 ug / ul miR expressie vector tot 0,9 ug / ul reportergen vector) aan de DNA-oplossing. Dit zal ervoor zorgen dat je herkent getransfecteerde cellen later 8. We maken gebruik van de zogenaamde pCAX vector, een soort cadeautje weerm C. Krull 13. </li><li> Voor een brede transfectie van de middenhersenen, plaats de elektroden links en rechts van het embryo ter hoogte van de middenhersenen. De afstand tussen de elektroden moet ongeveer 3-5 mm. De andere instellingen zijn 15V, 20 msec peulvruchten en 50 msec vertraging voor HH 10. De positie van de twee elektroden enigszins langs de dorso-ventrale (DV) as van de middenhersenen verzekert een brede transfectie van cellen de DV as transfectie. </li><li> Voor ventrale transfectie, voeg wat van de Bel aan het hoofd van de dooier membraan verhogen en plaats de anode onder ventrale middenhersenen. Als de kop niet stijgt duwt de elektrode het membraan dat dooier en embryo scheidt schroeien van de neurale buis voorkomen. De kathode moet boven de middenhersenen dorso-lateraal tegenover de anode geplaatst. Heeft de neurale buis niet aan. We transfecteren de linker ventrale helft van de middenhersenen om moeilijkheden met ontwikkeling van het hart te voorkomen. De afstand tussen de elektrodesis ongeveer 1-0,5 mm, de rest van de instellingen zijn 10V, 20 msec breedte en 50 msec vertraging. </li><li> Brengt u nog een druppel Saline op de top van de embryo&#39;s om het afkoelen en verwijder de luchtbellen. </li><li> Sluit de eieren met de band en incubeer gedurende ten minste 4 uur, de minimale tijd die vereist expressie vector. </li></ol> 4. Fixatie van kippenembryo&#39;s <ol><li> Verwijder de embryo&#39;s uit hun eieren. </li><li> Schoon embryo&#39;s onder een stereomicroscoop en de omvang van transfectie met een fluorescerende stereo microscoop. </li><li> Bevestig de embryo overnacht in 4% PFA bij 4 ° C. Ga verder met het snijden en / of vlekken (in situ hybridisatie, immunohistochemie) veranderingen in de getransfecteerde gebied geanalyseerd. </li></ol>

<ol><li>Kutter, C., Svoboda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA%2C+siRNA%2C+piRNA%3A+Knowns+of+the+unknown%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">miRNA, siRNA, piRNA: Knowns of the unknown.</a> RNA Biol. 5, 181-188 (2008).</li>
<li>Szell, M., Bata-Csorgo, Z., Kemeny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enigmatic+world+of+mRNA-like+ncRNAs%3A+their+role+in+human+evolution+and+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">The enigmatic world of mRNA-like ncRNAs: their role in human evolution and in human diseases.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 141-148 (2008).</li>
<li>Li, X., Jin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+small+regulatory+RNAs+in+determining+neuronal+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity.</a> Nature reviews. Neuroscience. 11, 329-338 (2010).</li>
<li>Riedmann, L. T., Schwentner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA%2C+siRNA%2C+piRNA+and+argonautes%3A+news+in+small+matters%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">miRNA, siRNA, piRNA and argonautes: news in small matters.</a> RNA Biol. 7, 133-139 (2010).</li>
<li>Coolen, M., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+brain+development+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in brain development and physiology.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 19, 461-470 (2009).</li>
<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 230, 376-380 (1997).</li>
<li>Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shocking%27+developments+in+chick+embryology%3A+electroporation+and+in+ovo+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat. Cell Biol. 1, 203-207 (1999).</li>
<li>Momose, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+targeting+of+gene+expression+in+chick+embryos+by+microelectroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation.</a> Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).</li>
<li>Nakamura, H., Watanabe, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Misexpression+of+genes+in+brain+vesicles+by+in+ovo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Misexpression of genes in brain vesicles by in ovo electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 42, 199-201 (2000).</li>
<li>Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+and+temporally+controlled+electroporation+of+early+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos.</a> Nat. Protoc. 3, 419-426 (2008).</li>
<li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Gene Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> The EMBO journal. 1, 841-845 (1982).</li>
<li>Potter, H., Weir, L., Leder, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer-dependent+expression+of+human+kappa+immunoglobulin+genes+introduced+into+mouse+pre-B+lymphocytes+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Enhancer-dependent expression of human kappa immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 7161-7165 (1984).</li>
<li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Dev. Dyn. 229, 433-439 (2004).</li>
<li>Canto-Soler, M. V., Adler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+cup+and+lens+development+requires+Pax6+expression+in+the+early+optic+vesicle+during+a+narrow+time+window%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Optic cup and lens development requires Pax6 expression in the early optic vesicle during a narrow time window.</a> Developmental biology. , 294-2119 (2006).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.+1951%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951.</a> Dev Dyn. 195, 231-272 (1992).</li>
<li>Muramatsu, T., Nakamura, A., Park, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation%3A+a+powerful+and+convenient+means+of+nonviral+gene+transfer+to+tissues+of+living+animals+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation: a powerful and convenient means of nonviral gene transfer to tissues of living animals (Review).</a> Int J Mol Med. 1, 55-62 (1998).</li>
<li>Agoston, Z., Li, N., Haslinger, A., Wizenmann, A., Schulte, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+physical+interaction+of+Meis2%2C+Pax3+and+Pax7+during+dorsal+midbrain+development%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic and physical interaction of Meis2, Pax3 and Pax7 during dorsal midbrain development.</a> BMC Dev Biol. 12, 10(2012).</li>
<li>De Pietri Tonelli, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+detection+of+microRNAs+in+developing+vertebrate+embryos+after+acute+administration+of+a+dual-fluorescence+reporter%2Fsensor+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Single-cell detection of microRNAs in developing vertebrate embryos after acute administration of a dual-fluorescence reporter/sensor plasmid.</a> Biotechniques. 41, 727-732 (2006).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

Deze video toont een effectieve methode om plasmide transfecteren in de neuro-epitheliale cellen van specifieke gebieden van het kuiken middenhersenen. Rechthoekige elektrische pulsen van een laag voltage kan DNA in cellen van het kuiken neurale buis te introduceren in ovo 6,16. Echter, de nauwkeurigheid van DNA targeting vaak bemoeilijkt door grote elektrische veld, die stijgt door de relatief grote elektroden (Φ = 0,5 mm). We hebben geprobeerd om dat probleem aan te pakken met behulp van elektroden...

De erkenning van kleine niet-coderende RNA&#39;s als extra spelers voor genexpressie gestart met een nieuwe complexiteit om genomische programmering / genregulatie. Verschillende soorten niet-coderende RNA&#39;s zijn functioneel belang neurale cellen, waaronder kleine niet-coderende RNA&#39;s 1-4. MicroRNAs (miR of miRNA) bijvoorbeeld tonen verschillende en veranderende expressie profielen in ontwikkelende hersenen 5. Gerichte in ovo elektroporatie van kippenembryo&#39;s biedt een unieke gelegenheid voor de ruimtelijke en temporele controle van genexpressie en silencing tijdens de ontwikkeling. Deze video toont de verschillende stappen van het uitvoeren van ectopische expressie van miRs in specifieke gebieden van het kuiken middenhersenen behulp van in-ovo elektroporatie 6-10. Om een ​​langdurig effect van deze kleine niet-coderende RNA in cellen waarborgen, de DNA sequentie van miRs werden gekloneerd in mono-of bi-cistronische vectoren. Voor de in ovo elektroporatie, miR met vector wordt geïnjecteerd in de middenhersenen neurale buis door het blootstellen van het embryo na een kleine venster in de eierschaal. Op specifieke gebieden van de middenhersenen kleine plus (anode) en min (kathode) transfecteren platina-elektroden worden geplaatst op specifieke posities. Voor ventrale middenhersenen transfectie, wordt de anode geplaatst onder de linker ventrale middenhersenen en de kathode boven de rechterhelft van de middenhersenen alvorens een stroom. De opening in de eierschaal is afgesloten met tape en embryo&#39;s geïncubeerd zolang als nodig is voor analyse. Deze methode werd oorspronkelijk beschreven door Muramatsu et al.. 6 en verbeterd Momose et al.. 8 specifieke gebied transfectie. <img src="/files/ftp_upload/50024/50024schematic1.jpg" fo:content-width-="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50024/50024schematic1highres.jpg"/> Schematisch overzicht. <ol><li> Het embryo in het ei wordt blootgesteld door het snijden van een klein venster in the eierschaal. </li><li> De opgeloste vector (en) wordt geïnjecteerd in de middenhersenen behulp van een micro capillair. </li><li> Twee elektroden - parallel of onder en boven het embryo geplaatst - genereren van een pulserend elektrisch veld. </li><li> Het elektrische veld zorgt tijdelijk poriën in het celmembraan, welke men de cel door het negatief geladen DNA (of RNA) vergemakkelijken aangetrokken door de anode 11,12. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>Borosillicate glass capillaries </td><td>Hartenstein</td><td></td><td>Model: 0.9 mm</td></tr><tr><td>Microcapillary puller</td><td>WPI, Berlin</td><td></td><td>Model: Pul1-E</td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Intracel</td><td></td><td>Model: TSSIC</td></tr><tr><td>Stereomicroscope - fluorescentie </td><td>LEICA</td><td></td><td>Model: MZFLIII</td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Model: Stemi</td></tr><tr><td>Camera en software</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Model: Axiocam MRc/ Axiovision Re. 4.8</td></tr></tbody></table>

in ovo expressie van microrna in ventrale chick middenhersenen

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Niet-coderende RNA&#39;s extra spelers regulatie van genexpressie. Gerichte in ovo elektroporatie van specifieke gebieden biedt een uniek instrument voor ruimtelijke en temporele controle van een buitenbaarmoederlijke microRNA expressie. Echter, ventrale hersenstructuren zoals ventrale middenhersenen zijn nogal moeilijk te bereiken voor eventuele manipulaties. Hier tonen we een efficiënte manier om miRNA electroporate in ventrale middenhersenen met behulp van dunne platina-elektroden. Deze werkwijze biedt een betrouwbare manier om specifieke gebieden van de middenhersenen en een nuttig instrument voor in vivo studies transfecteren.

De omvang van de middenhersenen gebied getransfecteerd met miR zichtbaar is door de expressie van GFP van een reporter vector geïnjecteerd samen met de miR expressie vector (Figuur 2). Gebruik platina elektroden met een diameter van 0,5 mm en geplaatst parallel aan de as van AP middenhersenen leidt normaliter de transfectie van een groot gebied langs de DV-en AP-as, zoals achterhersenen, middenhersenen en soms diencephalon (fig. 2A en B). De grootte van de elektroden leidt tot een grote...

Ectopische expressie is een techniek om de microRNA&#39;s rol in de ontwikkeling van de hersenen toe te lichten. Echter, gericht op specifieke gebieden met behulp van in-ovo elektroporatie is een uitdaging. Hier tonen we een efficiënte manier om selectief electroporate ventrale en dorsale middenhersenen regio.

In ovo Expressie van MicroRNA in ventrale Chick Middenhersenen

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

Een ovale elektroporatie begint met het openen van het actum om het embryo van de wang bloot te leggen. Bij hamburger-Hamilton stadia negen tot 11 wordt DNA in de regio van de middenhersenen geïnjecteerd. Vervolgens worden elektroden links en rechts van de middenhersenen geplaatst en wordt er een elektrische spanning aangelegd.Dit zorgt ervoor dat murale progenitorcellen in de ventriculaire zone het DNA opnemen voor ventrale transfectie. Eén elektrode, de anode, wordt geplaatst onder het membraan dat de A onder het gebied van het middenbrein bedekt.De kathode wordt lateraal dorsaal geplaatst aan de tegenovergestelde zijde van het middenhersenen voordat er een elektrische spanning wordt aangelegd. Let erop dat de elektroden de neurale buis niet raken. 24 uur later, bij Hamburger Hamilton-stadium 16 of 17, worden de embryo's uit het ei verwijderd, gefixeerd en geanalyseerd met antilichamen, kleuring of in situ hybridisatie.GFP-positieve cellen geven het gebied van gentransfectie aan. Elektroporatie van microRNA-precursor-moleculen of een microRNA-duplex zorgt voor een onmiddellijk maar kortstondig effect; om een langere expressie van microRNA's te waarborgen, elektroporeerden we een

in-ovo-expression-of-microrna-in-ventral-chick-midbrain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Neurale inductie is de eerste stap in de vorming van de hersenen. Het is een mechanisme waarmee Hensen's node (organisator), instrueert aangrenzend weefsel aan te nemen een neurale lot, dat wil zeggen om aanleiding te geven aan het zenuwstelsel. Deze video toont een test voor neurale inductie bij kippenembryo.

Test voor Neurale Inductie in het kippenembryo

Het algemene doel van deze video is te laten zien hoe je doelgericht retinale injectie uit te voeren...

In Ovo Elektroporatie in Embryonale Chick Retina

Deze studie beschrijft de ontwikkeling van...

In vitro Elektroporatie van de Tweede Rhombic Lip van Midgestation muizenembryo&#39;s

Om de functie en de regulatie van genen tijdens de ontwikkeling van middenhersenen dopaminerge neuronen te beoordelen, beschrijven we een methode die inhoudt...

In ovo Elektroporatie in Chick middenhersenen voor het bestuderen van gen-functie in dopaminerge Neuron Ontwikkeling

Een methode waarmee genexpressie in de neurale buis downgereguleerd in een celtype-specifieke, traceerbare wijze beschreven. We laten zien...

In ovo Elektroporatie van miRNA gebaseerde Plasmiden in de ontwikkelingslanden neurale buis en Beoordeling van de fenotypes van Dil Injectie in de Open-boek Voorbereidingen

Hoe neuronale netwerken zijn in de embryonale hersenen opgericht is een fundamentele vraag in ontwikkelingsstoornissen neurobiologie. Hier combineerden we een electroporatietechniek met nieuwe genetische hulpmiddelen, zoals Cre / Lox-plasmiden en piggyBac-gemedieerde DNA omzetting systeem in de aviaire hindbrain om dorsale interneurons labelen en volgen hun axonale projecties en synaptische doelen op verschillende ontwikkelingsstadia.

Elektroporatie van de hindbrain om Axonale Trajectories en Synaptic Doelen Trace in de Chick Embryo

Slice culturen vergemakkelijken de manipulatie van embryo-ontwikkeling van gen-en farmacologische verstoringen. Wel moet kweekomstandigheden ervoor te zorgen dat de normale ontwikkeling kan gaan binnen de verminderde omgeving van de plak. We tonen een protocol dat normale ontwikkeling ruggenmerg vergemakkelijkt men gedurende ten minste 24 uur.

Chicken Embryo Spinal Cord Slice Cultuur Protocol

Auditieve hersenstam neuronen van avians en zoogdieren zijn gespecialiseerd in snelle neurale codering, een fundamenteel proces voor normale gehoorfuncties. Deze neuronen ontstaan ​​uit duidelijke precursoren van embryonale hindbrain. We presenteren technieken die elektroporatie gebruiken om genen uit te drukken in het achterhoofd van kippenembryo's om de genfunctie tijdens de auditieve ontwikkeling te bestuderen.

In Ovo Electroporation in de Kip Auditory Brainstem

We hebben een nieuwe benadering van functieverlies ontwikkeld die de introductie en genomische integratie van kunstmatige micro-RNA-sequenties in kuikenembryo's omvat door gebruik te maken van ovo-elektroporatie en het Tol2-transposonsysteem. Deze techniek biedt een robuuste en stabiele gen knockdown methodologie voor studies van de genfunctie tijdens de ontwikkeling.

Verlies-van-functie benadering in het embryonale kuiken netvlies door gebruik te maken van Tol2 transposon-gemedieerde transgene expressie van kunstmatige microRNA's

Het kuiken is een kosteneffectief, toegankelijk en algemeen beschikbaar modelorganisme voor verschillende onderzoeken. Hier wordt een reeks protocollen beschreven om de moleculaire mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en regeneratie van het aviaire binnenoor.

In Ovo en Ex Ovo methoden om aviaire binnenoorontwikkeling te bestuderen

Met  behulp van ovo-elektroporatie hebben we een methode ontwikkeld om selectief het auditieve binnenoor en de cochleaire kern in kippenembryo's te transfecteren om een celgroepspecifieke knockdown van fragiele X mentale retardatie-eiwit te bereiken tijdens discrete perioden van circuitassemblage.

Ontleedende cel-autonome functie van fragiele X mentale retardatie-eiwit in een auditief circuit door In Ovo-elektroporatie

Leer in ovo-elektroporatie van specifieke hersengebieden in kippenembryo's. Deze methode onderzoekt de rol van microRNA's in de ontwikkeling van het ventrale middenhersen.

In ovo Expressie van MicroRNA in ventrale Chick Middenhersenen

Meer video's verkennen