Name: Isometrische en Excentrische troepenmacht Beoordeling van skeletspieren Geïsoleerd van muizenmodellen van spierdystrofieën (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: Leer isometrische en excentrische krachtmeting van skeletspieren geïsoleerd uit muizenmodellen van spierdystrofie. Deze methode helpt onderzoekers spierfunctie en therapie-effecten evalueren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Paul D. Wellstone Cooperative Research Center (AR052646).

Alle procedures zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Universiteit van Pennsylvania IACUC. 1. EDL Dissection en voorbereiding (ongeveer 30 min) <ol><li> Verdoven muizen zodat zij geen pijn of angst tijdens de procedure ervaren, maar dat de spieren blijven en zuurstof door de circulatie. We routinematig gebruik van een ketamine / xylazine cocktail (100/10 mg / kg) geïnjecteerd via IP. Chirurgische vlak van anesthesie wordt bepaald door volledige afwezigheid van pedaal of palpedral terugtrekking reflexen, of het ontbreken van het oor spierrespons. </li><li> Immobiliseren de achterpoten vast met tape en verwijder de huid van de onderste voorste achterbeen naar de spieren van dit gebied bloot te leggen. Om de spieren vochtig met de toepassing van PBS regelmatig. </li><li> Onder een ontleedmicroscoop scope, een kleine incisie dwars op de knie om de proximale pees van de EDL spier bloot. Er zijn twee pezen in dit gebied, en beide worden gesneden re toestaatUitbouwen van de EDL. </li><li> Op de mediale enkel, snijd de pees van de TA spier aan de distale pezen van de EDL, die zich langs de meta tarsals bloot te leggen. Til de TA spier uit de weg, en let niet te snijden of raken de EDL eronder. Terug naar de distale pezen van de EDL, snip elk en trek ze door de enkel, dan grijpen de pezen, zachtjes weg te trekken van de EDL van de rest van de ledemaat. Het dient vrij te geven vanaf het proximale uiteinde, zo niet terug naar de laterale incisie dat de pees wordt gesneden. Verwijder de spieren en doe dit in een dissectie schotel gevuld met gekoeld zuurstofrijk Ringers. Pin de spier de pezen ongeveer resting lengte, de lengte in vivo. De lengte is te kort wanneer de spier slap is in de schaal, en te lang als de spier trekt aan de ontleden pinnen. </li><li> Onmiddellijk euthanaseren de muis na verwijdering spier door cervicale dislocatie. </li><li> Bind hechtingen de tienDons, zo dicht mogelijk bij de spier, maar niet tegen de spier. Speld de spier op ongeveer rustplaats lengte met behulp van de hechtingen. </li></ol> 2. Membraan Dissection en voorbereiding (ongeveer 30 min) <ol><li> Euthanaseren de muizen voorafgaand aan deze procedure door cervicale dislocatie onder verdoving als dezelfde muis wordt onderworpen aan beide secties, of CO 2 gevolgd door een bevestiging met cervicale dislocatie. </li><li> Een insnijding in de huid van de buik-en borstholte bloot. Open de buikholte, en snijd het lichaam muur net onder de ribben. Met bot schaar en beginnen boven het membraan inbrengen snede rondom het gehele ribbenkast de lijn van de ribben, en hakte rug. Snij bloedvaten die door het midden van het membraan, zodat het membraan kan eenvoudig worden verwijderd. </li><li> Verwijder het membraan van de muis, en plaats in een dissectie schotel gevuld met zuurstofrijk Ringers. Schud voorzichtig de DIAPhragm in de schaal weg te wassen bloed. Refresh Ringers oplossing nodig. </li><li> Snijd een smalle strook van het membraan van de centrale pees aan de ribben langs de oriëntatie van de vezels in het centrale deel van de laterale hemidiaphragms. De strip moet tussen 2-4 mm breed. Met bot knippen als de rib ter weerszijden van de strook, waardoor ongeveer 1-2 mm overhang van rib aan weerszijden van het membraan strip. </li><li> Bind hechtingen aan de centrale pees. Hechtdraad binden aan elk van de zijdelings uitstekende rib uiteinden en knoop die een grote lus. </li><li> Twee stroken kan worden verkregen bij elk membraan (een per kant). </li></ol> 3. Montage Spieren in Mechanics Bath <ol><li> Pak de hechtingen en deze gebruiken om de spieren hechten aan een vaste plaats aan het ene uiteinde en een krachtopnemer aan de andere kant. </li><li> Pas de lengte te zorgen dat de spier is strak, maar is niet strak. Een goede benadering is de rustplaats muscle lengte als in 1.4 - 1.5. </li><li> Bad moet worden gevuld met zuurstof Ringers oplossing gehandhaafd op 22 ° C om spieren stabiliteit verlengen testen. Spieren moeten rusten gedurende 5 min in dit bad voor functionele tests, zodat spiertemperatuur is geëquilibreerd tot 22 ° C. </li></ol> 4. Isometrische contracties <ol><li> Bepaal supramaximale Stimulatie Voorwaarden. Na een spier wordt in een bad geplaatst en gebruik van eenmalig 0,5 msec stimulatie pulsen naar een twitch genereren en bewaken kracht output. Verhoog geleidelijk stroom totdat de kracht bereikt een maximum, maar stabiel niveau. Verhoging leiden tot 10% meer dan dit niveau voor de overige experimenten. </li><li> Bepaal optimale lengte. Met isometrische twitch prikkelingen, geleidelijk de lengte van de spier tot een maximale kracht wordt verkregen. Plaats de spier ~ 10 sec tussen elke contractie. Optimale spierlengte (L o) wordt bereikt wanneer twitch kracht maximaal is. Record spierlengte (de lengtetussen de knooppunten voor myotendinous EDL, en tussen de centrale pees myotendinous junctie en de spier insertie van de rib) met schuifmaten. </li><li> Maximale Isometrische Tetanische Force. Stimuleren spier ingesteld op L o gedurende 500 msec, met een reeks van 0,5 msec pulsen bij supramaximale stimulatie en fusion frequentie (het plateau van de frequentie-force relatie (bv. Ref:. 8) Het plateau voor EDL spieren meestal bereikt met 120 Hz, en voor diafragma spieren met 100 Hz. Stimuleer 3 keer op de respectievelijke frequentie rusttijden van 5 min tussen stimulatie gevechten voor elke spier. </li></ol> 5. Excentrische contracties <ol><li> Laat spier tot 5 min tussen het uitvoeren van isometrische en excentrische contracties rusten. </li><li> Stimuleren spieren bij 80 Hz isometrisch voor de eerste 500 msec, waarna 10% L o rek in de laatste 200 msec stimulatie (een stuk van 0,5 L o/ Sec). </li><li> Herhaal stimulatie patroon met 5 min rust tussen het gewenste aantal excentrische contracties. </li><li> Meet kracht voor elke contractie in de periode voorafgaand aan de rekken. Bereken de daling in kracht tussen de eerste en laatste contractie. </li></ol> 6. Muscle verwijderen uit het apparaat <ol><li> Verkort de spierlengte te zorgen voor zachte verwijdering van de spier van de transducer en de plaatsen en terug te sturen naar een dissectie schotel met Ringers. </li><li> Verwijder hechtingen van de spieren. </li><li> Voor de EDL spier, twee keer vlek de spier, weeg, voordat verdere verwerking (bijv. bevriezing, bevestiging, enz.). Dit zal belangrijk zijn voor de berekening van de doorsnede en specifieke werking. </li><li> Voor het middenrif spier, genieten in 0,1% Procion oranje, een membraan impermeant kleurstof voor 15-20 minuten. Dit zal een index van dissectie schade. </li><li> Ontleden de spieren buiten het benige insertie, evenals de central pees. Dit is noodzakelijk om een ​​nauwkeurige gewicht van de spier verschaffen. Dep zoals hierboven voorafgaand aan het wegen en latere uitwerking. </li><li> Bereken doorsnede (CSA): CSA (mm2) = massa (mg) / [(L o mm) * (L / L o) * (1,06 mg / mm 3)] waarbij L / L o de vezel spierlengte ratio (0,45 EDL, 1,0 voor het membraan) 5 1,06 en de dichtheid van spier. </li></ol>

<ol><li>Barton, E. R., Khurana, T. S., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+isometric+force+of+isolated+mouse+muscles+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22TREAT-NMD%22%5BJournal%5D)">Measuring isometric force of isolated mouse muscles in vitro.</a> TREAT-NMD. , (2008).</li>
<li>Barton, E. R., Morris, L., Musaro, A., Rosenthal, N., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+expression+of+insulin-like+growth+factor+I+counters+muscle+decline+in+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific expression of insulin-like growth factor I counters muscle decline in mdx mice.</a> J. Cell Biol. 157, 137-148 (2002).</li>
<li>Barton, E. R., Morris, L., Kawana, M., Bish, L. T., Toursel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+L-arginine+benefits+mdx+skeletal+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of L-arginine benefits mdx skeletal muscle function.</a> Muscle Nerve. 32, 751-760 (2005).</li>
<li>Barton, E. R., Wang, B. J., Brisson, B. K., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diaphragm+displays+early+and+progressive+functional+deficits+in+dysferlin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Diaphragm displays early and progressive functional deficits in dysferlin-deficient mice.</a> Muscle Nerve. 42 (1), 22-229 (2010).</li>
<li>Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+skeletal+muscles+from+young%2C+adult+and+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice.</a> J. Physiol. 404, 71-82 (1988).</li>
<li>Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+dose+formoterol+administration+improves+muscle+function+in+dystrophic+mdx+mice+without+increasing+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul.+Disord%22%5BJournal%5D)">Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue.</a> Neuromuscul. Disord. 17 (1), 47-55 (2007).</li>
<li>Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+power+output+of+fast+and+slow+skeletal+muscles+from+mdx+mice+6-28+months+old%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old.</a> J. Physiol. 535 (Pt. 2), 591-600 (2001).</li>
<li>Oishi, P. E., Cholsiripunlert, S., Gong, W., Baker, A. J., Bernstein, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myo-mechanical+Analysis+of+Isolated+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle.</a> J. Vis. Exp. (48), e2582(2011).</li>
<li>Petrof, B. J., Shrager, J. B., Stedman, H. H., Kelly, A. M., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+protects+the+sarcolemma+from+stresses+developed+during+muscle+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 3710-3714 (1993).</li>
<li>Salomonsson, S., Grundtman, C., Zhang, S. J., Lanner, J. T., Li, C., Katz, A., Wedderburn, L. R., Nagaraju, K., Lundberg, I. E., Westerblad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+MHC+class+I+in+transgenic+mice+results+in+reduced+force-generating+capacity+in+slow-twitch+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Upregulation of MHC class I in transgenic mice results in reduced force-generating capacity in slow-twitch muscle.</a> Muscle Nerve. 39 (5), 674-6782 (2009).</li>
<li>Stedman, H. H., Sweeney, H. L., Shrager, J. B., Maguire, H. C., Panettieri, R. A., Petrof, B., Narusawa, M., Leferovich, J. M., Sladky, J. T., Kelly, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mdx+mouse+diaphragm+reproduces+the+degenerative+changes+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mdx mouse diaphragm reproduces the degenerative changes of Duchenne muscular dystrophy.</a> Nature. 352, 536-539 (1991).</li>
<li>Welch, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTC124+targets+genetic+disorders+caused+by+nonsense+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PTC124 targets genetic disorders caused by nonsense mutations.</a> Nature. 447 (7140), 87-91 (2007).</li>
</ol>

Productie en gratis toegang tot dit artikel wordt gesponsord door Aurora Scientific.

Het doel van dit artikel is om een ​​leidraad voor het uitvoeren van geïsoleerde spierfunctie op twee spieren van muizen - de EDL en het middenrif. Evaluatie van deze spieren kan inzicht geven in het al dan niet therapeutische kandidaten voor spierziekte nuttig zijn. Voor beide spieren, de belangrijkste factor bij het verkrijgen van betrouwbare gegevens is een schone dissectie. Daarom oefenen en perfectioneren van de oorspronkelijke isolatie stap is essentieel alvorens op functionele testen. Bovendien, tot oprichting van functionele maatstaven voor normale spier is van cruciaal belang voor het maken van vergelijkingen met dystrofische spieren, of tussen de behandelingen. Dit zorgt ervoor dat de onderzoeksresultaten niet onder hoge variabiliteit verleend door het vermogen van de persoon die de experimenten. Het gebruik van een membraan impermeant kleurstof kan helpen bij het optimaliseren van de dissectie preparaat, incubatie van elke spier in een oplossing die een dergelijke kleurstof meest beschadigde vezels markeren, en kan dienen als een index van dissection succes. Minimaliseren van het aantal vezels in de spier beschadigd zal helpen om de meting te optimaliseren. De vezels beschadigd door dissectie fluoresceren veel feller dan beschadigd door excentrische contractie en dus als de kleurstof wordt eveneens gebruikt voor de mechanische proces, kan de intensiteit van kleurstof gebruikt om onderscheid te maken tussen de twee soorten schade. Dissectie van membraan strips zullen bijna altijd vezelbeschadiging, omdat door te snijden langs de lengte van de vezels, wat onvermijdelijk kapot gaat. Dye opname sterk in de beschadigde vezels en deze zijn normaal beperkt tot de buitenranden van het preparaat. Gemiddeld zien we een band van beschadigde vezels die ~ 3 vezels in breedte (~ 120 um) aan weerszijden van de spier strip. Als de beschadigde band omvat meer dan 15% van de spier, worden de gegevens verwijderd. Het membraan voorbereiding heeft ook beperkingen op de optimale grootte voor functionele maatregelen. We hebben gevonden dat stukken diaphragm breder dan 5 mm beginnen te vouwen op zichzelf, omdat de centrale pees tie slechts in een punt. Dit resulteert in een verminderde specifieke kracht in het preparaat. We hebben ook ontdekt dat smallere stroken ook lager specifieke kracht, waarvan wij geloven dat hebben, omdat het aantal vezels beschadigd tijdens dissectie bestaan ​​uit een groter deel van de totale vezelmassa nummer. Als bijvoorbeeld 0,1 mm aan elke kant is beschadigd, dat 5% (2x0.1 mm / 4 mm strip) van de spier preparaat dat niet bijdraagt ​​aan dwingen, terwijl indien de strip slechts 1 mm, vervolgens 20 % van de spiervoorbereiding beschadigd. Dus zowel de breedte van het beschadigde gebied en de breedte van het gehele preparaat belangrijke factoren te controleren. Metingen van maximale isometrische spanning vereisen dat alle spiervezels in een spier worden gestimuleerd. Omdat er een enorme variabiliteit in de componenten van een functie inrichting, moet dit worden bepaald voor elke afzonderlijke setup. Zo kan bad grootte of het type stimulator invloed op de intensiteit van de stimulatie. Twitch stimulatie is een redelijke manier om supramaximale stimulatie voorwaarden te bepalen. Zodra dit is vastgesteld voor een specifieke situatie en spieren, kan het worden gebruikt voor verdere studies. In tegenstelling tot de optimale lengte van een gegeven spier moet worden gemeten voor elk preparaat met de iteratieve proces hierboven beschreven. Dit zorgt ervoor dat dikke en dunne filamenten overlap is optimaal en de maximale potentiële kracht genererende capaciteit wordt gemeten. Alternatieve procedures kunnen rekenen op de diffractie patronen die door de spier strepen, maar dit vereist extra apparatuur hier niet beschreven. We routinematig gebruik 500 msec stimulatie lengtes, dat valt in het middengebied van deze parameter worden gebruikt door andere onderzoekers op dit gebied. Hoewel dit enkele vermoeidheid van de spier veroorzaken tijdens de contractie, zoals blijktdoor een &quot;sag&quot; in de maximale kracht productie kan dit op zichzelf informatief. Zo zou een verschil in vermoeidheid worden bereikt door verschillende therapieën, waaronder die welke beogen calcium behandeling, vandaar de doorbuiging die tijdens actieve contractie kan dienen als een index voor verbetering. Alternatief kan het verlies van kracht dan dat de hechtingen op de pezen niet stevig genoeg, en dat zij glijden tijdens de contractie. De spier wordt verwijderd uit het bad en de hechtingen opnieuw worden verbonden als dit gebeurt. We gebruiken ook een reeks van 3 tetanische contracties, waardoor evaluatie van de stabiliteit van het preparaat. Nogmaals, zou hechtdraad slips leiden tot verlies van kracht tussen de weeën, die hechting opnieuw koppelverkoop. Grote spieren kan ook leiden tot anoxische kernen, die leiden tot verlies van geweld tijdens het protocol. Spiermassa is een beperkende factor voor het uitvoeren van geïsoleerde spierfunctie testen, waar EDL spieren met massa&#39;s van meer dan 20 mg te verliezen kracht bij elke contractueletie, en kan niet worden ondersteund door superfusie in een bad. Membraan strips hebben geen last van dezelfde complicaties, omdat ze dun genoeg om langdurige levensvatbaarheid hebben in het bad. Andere spieren kan worden gebruikt voor geïsoleerde spier functie, met inbegrip soleus, die gewoonlijk wordt gebruikt, maar hier niet beschreven. Veel van dezelfde procedures kunnen worden vastgesteld voor de soleus in termen van het preparaat en de functionele testen. De belangrijkste verschillen zijn in de stimulatie frequentie en de parameters voor excentrische contracties. Gebruik van de soleus voor functie vult die van de andere twee spieren, en daarom moet worden beschouwd als onderdeel van een &quot;standaard pakket&quot; gaan dystrofe muizen 4, 7. Excentrische contractie geeft een index van contractiele breekbaarheid en het is belangrijk om een ​​protocol dat resulteert in verlies van bescheiden werking in spieren van wildtype dieren een aanzienlijk verlies van kracht inonbehandelde dystrofische spieren zodat er een groot dynamisch bereik voor vergelijkingen. Een gebrek aan kracht verliezen in normale spieren suggereert dat de excentrische contractie te mild en niet toereikend te onderscheiden therapieën die niet effectief en die echt gunstig. Echter, een dramatisch verlies van kracht in de normale spieren onderworpen aan excentrische contractie te groot om te plagen uit verschillen die verband houden met de ziekte. Onze protocol voor de EDL en het middenrif maakt gebruik van een 0,5 Lo / sec stretch tarief voor de productie van een 10% lengteverandering. We voeren gewoonlijk 5 excentrische contracties, die resulteren in een klein verlies van kracht in normale spieren en een significant verlies van werking in dystrofische spieren. Uiteraard kunnen al deze parameters worden gevarieerd om de lengte veranderen, de mate van rek, of het aantal excentrische contracties verhogen om verschillen tussen zieke en gezonde spier, alsmede de effecten van een bepaald type mutatie onderscheiden of tEHANDELING men studeert. Zolang er een duidelijk verschil tussen normale en aangetaste spieren, dan is er een gouden standaard te bereiken in termen van behandelingen. Kortom, dit protocol worden richtsnoeren vastgesteld voor het uitvoeren van isometrische en excentrische contracties, en hopelijk identificeert de mogelijke valkuilen te vermijden bij het instellen van deze techniek in uw lab.

Spierfunctie metingen bijdragen tot de evaluatie van mogelijke behandelingen van spier pathologie, evenals de bepaling van mechanismen fysiologie van dit weefsel. Voor spierziekte, hebben het gebruik van muismodellen uitgegroeid tot een centraal onderdeel voor het begrijpen van de relatie tussen genotype en fenotype, en voor de uitbreiding van die kennis in het ontwerpen en testen van mogelijke therapeutica. De spierdystrofieën, in het bijzonder, hebben vertrouwd op muizen om deze middelen te evalueren en pre-klinische gegevens die nodig zijn om verder te gaan naar onderzoeken bij patiënten vast te stellen. Een frequent gebruikt uitkomstmaat geïsoleerde spier functie kracht, die van toepassing is op een groot aantal studies bepalen. Een andere maatregel is het gebruik van excentrische of verlenging, contracties bepalen veranderingen in spier membraan integriteit, die deficiënt is in Duchenne spierdystrofie en het muismodel voor deze ziekte (mdx). Daarom is het voor dit soort Metingents gevoelig en reproduceerbaar. De muis extensor digitorum longus (EDL) spier is veelvuldig gebruikt voor geïsoleerde spierfunctie vanwege de ideale geometrie en afmetingen, waaronder uniforme vezeloriëntatie en definitieve pezen 2, 5, 6, 10, 12. Werkwijzen voor EDL spieren isometrisch functionele metingen zijn beschreven in een eerdere publicatie Jupiter 8, en in de behande-NMD SOP 1. We hebben uitgebreid de beschrijving van deze methoden om zowel isometrische en excentrische contracties op te nemen. Kenmerken van de ziekte zijn duidelijk in de EDL, met inbegrip van heighted cycli van degeneratie / regeneratie en verminderde kracht output. De muis membraan vertoont de snelste pathologische progressie van spierdystrofie vergelijking met andere spieren in de muis 11. Door leeftijd van 6 maanden, cumulatief fibrose omvat ongeveer 50% van de spier. Dit resulteert in aanzienlijk slechtziendend kracht uitgang 11. Daarom kunnen geneesmiddelen met fibrotische infiltratie voorkomen efficiënt worden geëvalueerd in het membraan. Het verlies van dystrofine in de spieren leidt tot een verhoogde kwetsbaarheid en verhoogde contractiele schade in alle spieren 9. Daarom zijn er veel therapieën voor de ziekte van Duchenne zijn afgestemd op dystrofine vervanging. Als zodanig een assay die essentieel is geworden voor het evalueren van deze strategieën is excentrische contractie, die onderscheid kunnen maken tussen normale en dystrofische spier, en bepalen welk voordeel een bepaalde strategie voor het beschermen van dystrofe spierweefsel contractiele schade 2, 3, 4, 12. Deze procedure vereist een dual-mode servo-motor die moduleren / recordlengte en kracht, of een werkwijze voor het aanpassen lengte snel los van een krachtopnemer.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Materiaal </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> in vitro Muscle Test System </td><td> Aurora Wetenschappelijke </td><td> 1200A </td><td></td></tr><tr><td> Dissectiemicroscoop </td><td> Leica </td><td> MZ6 </td><td></td></tr><tr><td> ACE lichtbron </td><td> Schott-Fostec </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td> Schaar </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14.060-11 </td><td></td></tr><tr><td> Angled ontleden schaar </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15.006-09 </td><td></td></tr><tr><td> Scalpelhouder </td><td> Fine Science Tools </td><td> 10.003-12 </td><td> alternatieve dissectie-instrument </td></tr><tr><td> Gebogen scalpelmesjes # 12 </td><td> Fine ScienceGereedschap </td><td> 10.012-00 </td><td> alternatieve dissectie-instrument </td></tr><tr><td> Bone schaar </td><td> Fine Science Tools </td><td> 16.044-10 </td><td></td></tr><tr><td> W &amp; T-hechtdraad koppelverkoop tang </td><td> Fine Science Tools </td><td> 00.272-13 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont SS pincet - hoek </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.203-25 </td><td></td></tr><tr><td> Gevlochten zijden hechtdraad grootte 6-0 </td><td> Teleflex Medical </td><td> 07-30-10 </td><td></td></tr><tr><td> Medische tape </td><td> Transpore </td><td> 3M </td><td></td></tr><tr><td> Ketamine hydrochloride 100 mg / ml </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-2051-05 </td><td> Laatste dosis is 80 mg / kg </td></tr><tr><td> TranquiVed Injection (xylazine 100 mg / ml) </td><td> Vedco </td><td> NDC 50989-234-11 </td><td> Uiteindelijke dosis is 10 mg / kg </td></tr><tr><td> Reactieve oranje 14 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R-8254 </td><td></td></tr><tr><td> Ringers oplossing Components </td><td></td><td></td><td> Oplossing gas geëquilibreerd met 95% O2 en 5% CO2 uiteindelijke pH 7,4 </td></tr><tr><td> Natriumchloride </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7653 </td><td> Eindconcentratie: 118 mM </td></tr><tr><td> Kaliumchloride </td><td> Fisher Scientific </td><td> P217-3 </td><td> Eindconcentratie: 4,7 mM </td></tr><tr><td> Calciumchloridedihydraat </td><td> Fisher Scientific </td><td> C79-500 </td><td> Eindconcentratie: 2,5 mM </td></tr><tr><td> Kaliumfosfaat monobasisch </td><td> Fisher Scientific </td><td> P-285 </td><td> Eindconcentratie: 1,2 mM </td></tr><tr><td> Magnesiumsulfaat </td><td> JT Baker </td><td> 2500 tot 01 </td><td> Eindconcentratie: 0,57 mm </td></tr><tr><td> 4 - (2-Hydroxyethyl) pipeRazine-1-ethaansulfonzuur (HEPES) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310-500 </td><td> Eindconcentratie: 5,95 g / L </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8270 </td><td> Eindconcentratie: 5,5 mM </td></tr></tbody></table>

isometrische en excentrische troepenmacht beoordeling van skeletspieren geïsoleerd van muizenmodellen van spierdystrofieën

Isometric and Eccentric Force Generation Assessment of Skeletal Muscles Isolated from Murine Models of Muscular Dystrophies

Cruciaal belang voor de evaluatie van potentiële therapeutische middelen voor spierziekte gevoelig en reproduceerbaar fysiologische beoordeling van spierfunctie. Omdat veel pre-klinische studies rekenen op muismodellen voor deze ziekten, heeft geïsoleerde spierfunctie uitgegroeid tot een van de normen voor Go / NoGo beslissingen bij het verplaatsen van kandidaat-geneesmiddelen naar voren in patiënten. We demonstreren de bereiding van de extensor digitorum longus (EDL) en middenrif voor tests, die voornamelijk spieren gebruikt voor deze studies. De EDL spier geometrie is ideaal voor geïsoleerde spier preparaten met twee gemakkelijk toegankelijke pezen en een klein formaat dat kan worden ondersteund door superfusie in een bad. Het membraan vertoont diepe progressieve pathologie in dystrofische dieren, en kan dienen als een platform voor het evalueren van veel potentiële therapieën tegengaan van fibrose, en het bevorderen van myofiber stabiliteit. Protocollen voor het routinematig testen, met inbegrip van isometrische en eccentric contracties getoond. Isometrische kracht levert beoordeling van sterkte en excentrische contracties helpen sarcolemma stabiliteit, hetgeen wordt verstoord in vele soorten spierdystrofieën evalueren. Vergelijkingen van de verwachte resultaten tussen spieren van wild-type en dystrofische spieren zal ook worden verleend. Deze maatregelen kunnen aanvullen morfologische en biochemische metingen van weefsel homeostase, alsmede gehele dier beoordeling van spierfunctie.

Verwachte waarden voor de isometrische krachten van EDL spieren van 12 weken oude dieren worden getoond in Figuur 1. Omdat mdx spieren vertonen compenserende hypertrofie, kunnen de totale tetanische kracht hoger in mdx spieren vergeleken met leeftijd afgestemd wildtype controles. Echter, een passende maatregel van functionele uitgang specifieke kracht (figuur 2), waarbij kracht genormaliseerd voor dwarsdoorsnedeoppervlak deze waarde te berekenen. Specifieke werking afhankelijk van de inherente functionele capaciteit van de spier waar de zwakke dystrofische spieren duidelijker wanneer zowel absolute kracht en dwarsdoorsnede worden verwerkt. In onze handen EDL spieren mdx muizen genereren ongeveer 20 - 25% lagere specifieke krachten dan die van wildtype muizen overeenstemmende leeftijd 10 tot 26 weken. Voor het membraan alleen specifieke kracht is relevant voor vergelijkingen omdat het preparaat een stuk van de spier afhankelijk van de Dissectie. Vergelijking van de specifieke kracht tussen wildtype en mdx middenrif spieren weerspiegelt de progressieve pathologie in dit weefsel. Isometrische kracht uitgang afneemt met de leeftijd (figuur 3), zodat door leeftijd van 6 maanden, middenrif spieren van mdx muizen niet meer dan de helft van de functionele output van diafragma stroken van dezelfde leeftijd wildtype controles worden uitgeoefend. Een voorbeeld van excentrische contracties van membraan tests getoond in figuur 4. Met elke volgende excentrische contractie, kracht-uitgang vermindert in de membraan strips van zowel wildtype (C57) en mdx muizen. Het verlies van kracht dramatischer in spieren monsters van mdx muis vermoedelijk uit de afwezigheid van dystrofine en geassocieerde eiwitten. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig1.jpg" /> Figuur 1. Isometrische tetanische kracht in wildtype en mdx EDL spieren f<html> rom 12 weken oude muizen. Absolute kracht kan hoger zijn in dezelfde leeftijd mdx EDL spieren als gevolg van compenserende hypertrofie. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig2.jpg" /> Figuur 2. Isometrische tetanische kracht genormaliseerd door spier dwarsdoorsnede is specifieke kracht, en toont depressief functionele capaciteit van EDL spieren mdx muizen vergeleken met die van wildtype muizen. Sporen van dezelfde muizen als in figuur 1. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/50036/50036fig3.jpg" /> Figuur 3. De progressief verlies van kracht productiecapaciteit bepaald door specifieke kracht is het duidelijkst in het middenrif van de mdx muizen (rode balken) in vergelijking met wildtype (C57 in blauwe lijn). 36/50036fig4.jpg &quot;/&gt; Figuur 4. Het verlies van kracht als functie van excentrische contractie nummer middenrif van 12 weken oude C57 en mdx muizen. Gegevens gemiddelde ± SEM voor N = 4 spieren per genotype.

Spierfunctie metingen bijdragen tot de evaluatie van potentiële therapeutische middelen voor spier pathologie, evenals de bepaling van mechanismen fysiologie van dit weefsel. We zullen aantonen de voorbereiding van de m. extensor digitorum longus en het middenrif spieren voor functionele testen. Protocollen voor isometrische en excentrische contracties zal worden getoond, evenals de verschillen in resultaten tussen dystrofische spieren, wat neerkomt op een pathologische toestand, en wildtype spieren.

Isometrische en Excentrische troepenmacht Beoordeling van skeletspieren Geïsoleerd van muizenmodellen van spierdystrofieën

Critical to the evaluation of potential  therapeutics for muscular disease are sensitive and reproducible physiological  assessments of muscle function. ...

Het algemene doel van deze procedure is om de mechanische eigenschappen van skeletspieren geïsoleerd van muizen te meten. Dit wordt bereikt door eerst de extensor digitorum longus of EDL spier, evenals de diafragmaspier van het dier te disseceren. Na het voorbereiden van een diafragmastrip prik de EDL en de diafragmastrip in een schaal met zuurstofrijke ringer-oplossing en bind vervolgens hechtlussen aan beide uiteinden van de spieren.Vervolgens wordt de EDL of diafragmastrip bevestigd in een orgaanbad tussen twee elektroden die aan het ene uiteinde aan een krachttransducer of hefboom zijn bevestigd en aangepast op de optimale lengte op basis van de twitch-kracht. De laatste stap is om de spier te stimuleren met behulp van een aantal mechanische protocollen en krachtproductie te meten. Uiteindelijk worden berekening van krachtproductie, weerstand tegen schade, frequentierelatie en andere eigenschappen gebruikt om de sterkte en integriteit en andere eigenschappen van de spier te tonen, en indien van toepassing, de effecten van een behandeling of genetische modificatie.Deze techniek kan worden gebruikt om potentiële therapieën voor de spierdystrofieën te testen omdat de meeste van deze therapieën gericht zijn op het herwinnen van spierkracht en het verminderen van spierfragiliteit. Hoewel we niet de eersten zijn die deze techniek gebruiken, gebruiken we deze routinematig om een aantal verschillende muismodellen te bestuderen en hun spierfunctie te beoordelen, en ook om meerdere therapieën voor de spierdystrofieën te karakteriseren en te evalueren. Naast Dr. Catherine Morewood, zullen we deze procedure demonstreren met behulp van twee leden van onze fysiologische beoordelingskern, Dr. Min Liu, een onderzoeksmedewerker, en Mr. Ian, een onderzoeksspecialist.De muizen die in deze procedure worden gebruikt, worden verdoofd met ketamine en xylazine om ervoor te zorgen dat ze geen pijn of stress ervaren, maar de spieren blijven goed geoxygeneerd door de circulatie. Na bevestiging door een teenprik dat het dier voldoende verdoofd is, immobiliseer de hoge ledematen met medisch tape en verwijder de huid van de onderste voorste achterste ledemaat om de spieren van dit gebied bloot te leggen, houd de spieren vochtig met regelmatige toepassing van PBS. Onder een dissectoscoop maakt u een kleine incisie lateraal aan de knie om de proximale pees van de extensor digitorum longus of EDL spier bloot te leggen.Er zijn twee pezen in dit gebied en beide moeten worden doorgesneden om de EDL bij de mediale enkel te verwijderen. Snijd de pees van de tibialis anterior of TA spier om de distale pezen van de EDL bloot te leggen, die zich uitstrekken langs de metatarsalen. Til de TA spier uit de weg.Wees voorzichtig om de EDL eronder niet te snijden of aan te raken. Ga terug naar de distale pezen van de EDL en snijd er elk eentje af. Grijp vervolgens de pezen en trek de EDL voorzichtig weg van de rest van het ledemaat.Het moet vrij van het proximale uiteinde loslaten. Verwijder de EDL spier en plaats deze in een dissectieschaal gevuld met gekoelde zuurstofrijke wringers. Prik de spier door de pezen op ongeveer rustlengte, wat de lengte is die in vivo wordt aangetroffen.De lengte is te kort wanneer de spier plat in de schaal ligt en te lang als de spier aan de dissectiepennen trekt. Bind hechtingen aan de pezen zo dicht mogelijk bij de spier, maar zonder de spier aan te raken. Prik de spier op ongeveer rustlengte vast met behulp van de hechtingen.Om met deze procedure te beginnen. Maak een incisie in de huid van het gedode dier. Om de buik- en borsthohling bloot te leggen.Open de buikholte en snijd de lichaamswand net onder de ribben met botenscharen en begin boven de diafragma-invoeging. Snijd rond de gehele ribbenkast volgens de lijn van de ribben en snijd door de wervelkolom. Snijd de bloedvaten die door het midden van het diafragma lopen, zodat het diafragma gemakkelijk kan worden verwijderd.Verwijder het diafragma van de muis en plaats het in een dissectieschaal gevuld met zuurstofrijke ringers. Schud het diafragma voorzichtig in de schaal om bloed weg te wassen. Ververs de ringer-oplossing indien nodig.Snijd vervolgens een klein stukje van het diafragma van de centrale pees tot aan de ribben langs de oriëntatie van de vezels in het centrale gedeelte van de laterale hemidiafragmen. De strip moet tussen de twee en vier millimeter breed zijn. Bind hechtingen aan de centrale pees, bind hechtingen aan elk van de lateraal uitstekende ribuiteinden en bind deze vervolgens samen om een grote lus te maken met behulp van botenscharen.Snijd de rib aan beide zijden van de strip, waardoor ongeveer een tot twee millimeter overhang van de rib aan beide zijden van het diafragma overblijft. Evaluatie van de krachtgeneratie van de strip van de geïsoleerde skeletspieren wordt uitgevoerd door een in vitro spiertestsysteem om de spieren in het werkplaatsbad te monteren, de hechtingen vast te grijpen en deze te gebruiken om de spier aan een stijve paal aan het ene uiteinde en aan een krachttransducer aan het andere uiteinde te bevestigen. Een goede benadering is de rustlengte van de spier.Zoals eerder is aangetoond, is het bad gevuld met zuurstofrijke ringers-oplossing die op 22 graden Celsius wordt gehouden. Om de spierstabiliteit te verlengen, moeten spieren vijf minuten in dit bad rusten vóór functioneel testen, zodat de spiertemperatuur gelijk is aan 22 graden Celsius om supra-maximale stimulatiecondities vast te stellen. Nadat een spier in het bad is geplaatst, gebruikt u enkele 0,5 milliseconde stimulatiepulsen om een twitch te genereren en de krachtuitvoer te controleren.Verhoog geleidelijk de stroom totdat de kracht een maximum maar stabiel niveau bereikt, verhoog de stroom tot 10% meer dan dit niveau voor de resterende experimenten om de optimale lengte vast te stellen, zorg er eerst voor dat de spier niet slap is, maar ook niet strak. Een goede benadering is de rustlengte van de spier zoals eerder is aangetoond. Met behulp van isometrische twitch-stimulatie past u de len

isometric-eccentric-force-generation-assessment-skeletal-muscles

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Myo-mechanische analyse van geïsoleerde Skeletal Muscle

Beschrijven we een minimaal-invasieve en pijnloze methode om honden achterbeen spierkracht en spier reactie op de herhaalde excentrische contracties te meten.

In vivo Canine spierfunctie Assay

Een muizenmodel van neuromusculaire elektrostimulatie (NMES), een veilige en goedkope klinische modaliteit, aan de voorste compartiment spieren wordt beschreven. Dit model heeft het voordeel van het wijzigen van een beschikbaar klinische inrichting voor het opwekken van gerichte en specifieke spiercontracties in muizen.

Een muizenmodel van Muscle Training door Neuromusculaire elektrische stimulatie

We beschrijven een methode om direct te meten spierkracht, spierkracht, contractiele kinetiek en vermoeidheid van geïsoleerde skeletspieren in...

Ex Vivo Beoordeling van contractiliteit, vermoeidheid en alternantie in geïsoleerde skeletspieren

Isolatie en cultuur van myovezels is de gouden...

Isolatie en Cultuur van individuele myovezels en hun satelliet cellen van volwassen skeletspier

Veranderingen in de ledematen spieren contractiele en passieve mechanische eigenschappen zijn belangrijk biomarkers voor spierziekten. Dit manuscript beschrijft fysiologische tests om deze eigenschappen te meten in het muizen extensor digitorum longus en m. tibialis anterior.

Evaluatie van de spierfunctie van de m. extensor digitorum longus<em&gt; Ex vivo</em&gt; En Voorste scheenbeenspier Spier<em&gt; In situ</em&gt; In Muizen

De primaire uitkomstmaat in klinische trials voor neuromusculaire aandoeningen is over het algemeen verbeterd spierfunctie. Daarom beoordeling van het effect van mogelijke therapeutische verbindingen op spierprestaties klinisch vooraf in muismodellen van groot belang. We beschrijven hier een aantal functionele tests om dit aan te pakken.

Het beoordelen van functionele prestaties in de<em&gt; Mdx</em&gt; Muis Model

Meting van knaagdier skeletspieren contractiele functie is een nuttig instrument dat kan worden gebruikt voor het bijhouden van de progressie van de ziekte, alsmede de werkzaamheid van de therapeutische interventie. Hier beschrijven we de niet-invasieve, in vivo beoordelingvan de releveurs spieren die na verloop van tijd in de dezelfde muis kan worden herhaald.

Niet-invasieve beoordelingvan releveurs spier functie in muizen

Hier gepresenteerd is een protocol om de contractiele eigenschappen van gestreepte spier myofibrils met nano-Newton resolutie te beoordelen. Het protocol maakt gebruik van een setup met een interferometrie-gebaseerde, optische kracht sonde. Deze opstelling genereert gegevens met een hoge signaal-ruisverhouding en maakt de beoordeling van de contractiele kinetiek van myofibrils mogelijk.

Myofibrils isoleren van skeletspierbiopten en het bepalen van contractielfunctie met een Nano-Newton Resolution Force Transducer

Hier stellen we een methode voor om efficiënt te verkrijgen enkele spiervezels in de vroege postnatale ontwikkelingsstadia van homozygoot mutant Lamin Δ8-11 muis model, een zeer ernstig model voor Emery-Dreifuss spierdystrofie (EDMD).

Single Myofiber isolatie en cultuur van een Murine Model van Emery-Dreifuss Spierdystrofie in de vroege post-natale ontwikkeling

De skeletspierfunctie kan worden beoordeeld door de contractiliteit van geïsoleerde spiervezels te kwantificeren, traditioneel met behulp van bewerkelijke benaderingen met een lage doorvoer. Hier beschrijven we een op optica gebaseerde, high-throughput methode om de contractiliteit van hydrogel-ingebedde spiervezels te kwantificeren. Deze aanpak heeft toepassingen voor geneesmiddelenscreening en therapeutische ontwikkeling.

High-throughput contractiele metingen van hydrogel-ingebedde intacte muisspiervezels met behulp van een op optica gebaseerd systeem

Leer isometrische en excentrische krachtmeting van skeletspieren geïsoleerd uit muizenmodellen van spierdystrofie. Deze methode helpt onderzoekers spierfunctie en therapie-effecten evalueren.

Isometrische en Excentrische troepenmacht Beoordeling van skeletspieren Geïsoleerd van muizenmodellen van spierdystrofieën

Meer video's verkennen