Isometrische en Excentrische troepenmacht Beoordeling van skeletspieren Geïsoleerd van muizenmodellen van spierdystrofieën

Het algemene doel van deze procedure is om de mechanische eigenschappen van skeletspieren geïsoleerd van muizen te meten. Dit wordt bereikt door eerst de extensor digitorum longus of EDL spier, evenals de diafragmaspier van het dier te disseceren. Na het voorbereiden van een diafragmastrip prik de EDL en de diafragmastrip in een schaal met zuurstofrijke ringer-oplossing en bind vervolgens hechtlussen aan beide uiteinden van de spieren.

Vervolgens wordt de EDL of diafragmastrip bevestigd in een orgaanbad tussen twee elektroden die aan het ene uiteinde aan een krachttransducer of hefboom zijn bevestigd en aangepast op de optimale lengte op basis van de twitch-kracht. De laatste stap is om de spier te stimuleren met behulp van een aantal mechanische protocollen en krachtproductie te meten. Uiteindelijk worden berekening van krachtproductie, weerstand tegen schade, frequentierelatie en andere eigenschappen gebruikt om de sterkte en integriteit en andere eigenschappen van de spier te tonen, en indien van toepassing, de effecten van een behandeling of genetische modificatie.

Deze techniek kan worden gebruikt om potentiële therapieën voor de spierdystrofieën te testen omdat de meeste van deze therapieën gericht zijn op het herwinnen van spierkracht en het verminderen van spierfragiliteit. Hoewel we niet de eersten zijn die deze techniek gebruiken, gebruiken we deze routinematig om een aantal verschillende muismodellen te bestuderen en hun spierfunctie te beoordelen, en ook om meerdere therapieën voor de spierdystrofieën te karakteriseren en te evalueren. Naast Dr. Catherine Morewood, zullen we deze procedure demonstreren met behulp van twee leden van onze fysiologische beoordelingskern, Dr. Min Liu, een onderzoeksmedewerker, en Mr. Ian, een onderzoeksspecialist.

De muizen die in deze procedure worden gebruikt, worden verdoofd met ketamine en xylazine om ervoor te zorgen dat ze geen pijn of stress ervaren, maar de spieren blijven goed geoxygeneerd door de circulatie. Na bevestiging door een teenprik dat het dier voldoende verdoofd is, immobiliseer de hoge ledematen met medisch tape en verwijder de huid van de onderste voorste achterste ledemaat om de spieren van dit gebied bloot te leggen, houd de spieren vochtig met regelmatige toepassing van PBS. Onder een dissectoscoop maakt u een kleine incisie lateraal aan de knie om de proximale pees van de extensor digitorum longus of EDL spier bloot te leggen.

Er zijn twee pezen in dit gebied en beide moeten worden doorgesneden om de EDL bij de mediale enkel te verwijderen. Snijd de pees van de tibialis anterior of TA spier om de distale pezen van de EDL bloot te leggen, die zich uitstrekken langs de metatarsalen. Til de TA spier uit de weg.

Wees voorzichtig om de EDL eronder niet te snijden of aan te raken. Ga terug naar de distale pezen van de EDL en snijd er elk eentje af. Grijp vervolgens de pezen en trek de EDL voorzichtig weg van de rest van het ledemaat.

Het moet vrij van het proximale uiteinde loslaten. Verwijder de EDL spier en plaats deze in een dissectieschaal gevuld met gekoelde zuurstofrijke wringers. Prik de spier door de pezen op ongeveer rustlengte, wat de lengte is die in vivo wordt aangetroffen.

De lengte is te kort wanneer de spier plat in de schaal ligt en te lang als de spier aan de dissectiepennen trekt. Bind hechtingen aan de pezen zo dicht mogelijk bij de spier, maar zonder de spier aan te raken. Prik de spier op ongeveer rustlengte vast met behulp van de hechtingen.

Om met deze procedure te beginnen. Maak een incisie in de huid van het gedode dier. Om de buik- en borsthohling bloot te leggen.

Open de buikholte en snijd de lichaamswand net onder de ribben met botenscharen en begin boven de diafragma-invoeging. Snijd rond de gehele ribbenkast volgens de lijn van de ribben en snijd door de wervelkolom. Snijd de bloedvaten die door het midden van het diafragma lopen, zodat het diafragma gemakkelijk kan worden verwijderd.

Verwijder het diafragma van de muis en plaats het in een dissectieschaal gevuld met zuurstofrijke ringers. Schud het diafragma voorzichtig in de schaal om bloed weg te wassen. Ververs de ringer-oplossing indien nodig.

Snijd vervolgens een klein stukje van het diafragma van de centrale pees tot aan de ribben langs de oriëntatie van de vezels in het centrale gedeelte van de laterale hemidiafragmen. De strip moet tussen de twee en vier millimeter breed zijn. Bind hechtingen aan de centrale pees, bind hechtingen aan elk van de lateraal uitstekende ribuiteinden en bind deze vervolgens samen om een grote lus te maken met behulp van botenscharen.

Snijd de rib aan beide zijden van de strip, waardoor ongeveer een tot twee millimeter overhang van de rib aan beide zijden van het diafragma overblijft. Evaluatie van de krachtgeneratie van de strip van de geïsoleerde skeletspieren wordt uitgevoerd door een in vitro spiertestsysteem om de spieren in het werkplaatsbad te monteren, de hechtingen vast te grijpen en deze te gebruiken om de spier aan een stijve paal aan het ene uiteinde en aan een krachttransducer aan het andere uiteinde te bevestigen. Een goede benadering is de rustlengte van de spier.

Zoals eerder is aangetoond, is het bad gevuld met zuurstofrijke ringers-oplossing die op 22 graden Celsius wordt gehouden. Om de spierstabiliteit te verlengen, moeten spieren vijf minuten in dit bad rusten vóór functioneel testen, zodat de spiertemperatuur gelijk is aan 22 graden Celsius om supra-maximale stimulatiecondities vast te stellen. Nadat een spier in het bad is geplaatst, gebruikt u enkele 0,5 milliseconde stimulatiepulsen om een twitch te genereren en de krachtuitvoer te controleren.

Verhoog geleidelijk de stroom totdat de kracht een maximum maar stabiel niveau bereikt, verhoog de stroom tot 10% meer dan dit niveau voor de resterende experimenten om de optimale lengte vast te stellen, zorg er eerst voor dat de spier niet slap is, maar ook niet strak. Een goede benadering is de rustlengte van de spier zoals eerder is aangetoond. Met behulp van isometrische twitch-stimulatie past u de len