Name: Analyse van gen-functie en visualisatie van Cilia-gegenereerde Fluid Flow in Blaasjes Kupffers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Leer genfunctie-analyse en visualisatie van cilia-gemedieerde vloeistofstroming in Kupffer's Vesicle van zebrafishembryo's met fluorescerende microbolletjes. Deze methode ondersteunt onderzoek naar links-rechts patroonvorming.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Fiona Foley voor uitstekende lab ondersteuning en zebravis zorg. Dit werk werd ondersteund een AHA predoctorale beurs GW (11PRE5730027) en NHLBI subsidies aan HJY (R01HL66292) en JDA (R01HL095690).

Overzicht van Stage-specifieke zebravisembryo Injecties Antisense oligonucleotiden morfolino (MO), die binden aan een doelwit-mRNA en eiwitexpressie verstoren van die transcript, worden veel gebruikt in gen knockdown (loss-of-function) studies in zebravis 13,14. Gene Tools, LLC biedt MO&#39;s die zijn voorzien van tag met ofwel carboxyfluoresceïne (zendt groene fluorescentie) of lissamine (zendt rode fluorescentie) om MO te detecteren in geïnjecteerde embryo&#39;s met behulp van fluorescentie microscopie. Door het injecteren MO in de dooier cel in verschillende stadia van ontwikkeling van de zebravis, is het mogelijk om de MO leveren aan specifieke compartimenten van de embryo (figuren 1A-F). MO geïnjecteerd in de dooier tussen de 1-4 cel stadium (0-1 HPF) voert alle embryonale cellen (figuren 1A, D, D &#39;) via verbindingen met de dooier die blijven bestaan ​​tot aan de 32-cellig stadium 15 tot wereldwijde knockdown te vergemakkelijken. MO geïnjecteerd in de dooier tijdens midblastula stadia (2.5-3 HPF) kunt u de voorouders van de DFC (Figuren 1B, E, E &#39;) waarschijnlijk door cytoplasmatische bruggen 8 en knockdown genfunctie specifiek in de DFC / KV cellijn 12, zonder het invoeren van de meeste andere embryonale cellijnen . Als belangrijke gebruiken om te testen of genfunctie noodzakelijk is DFC / KV of ook in dooier 12,16 is het ook mogelijk om MO beperken tot de dooier cel door het injecteren van de koepel-30% epiboly fasen (~ 4,5 hpf) na alle cytoplasmatische bruggen gesloten (figuren 1C, F, F &#39;). Deze injecties werden gebruikt in combinatie met genfunctie analyse in DFC / KV cellen 17-24. Om vloeistofstroom in KV beoordelen, zijn fluorescerende microbolletjes geïnjecteerd in de KV lumen tussen het 6-10 somiet stadia (12-14 HPF) en daarna meteen afgebeeld met behulp van videomicroscopie (Figuren 1G-J). Microkorrels zijn die emitteren rode of groene fluorescentie (of beide), dus is het mogelijk om verschillendekanalen om de afbeelding fluorescerende microbolletjes en MO. 1. Stadiumspecifieke Injectie van morfolino (MO) Injectie van MO in zebravis embryo&#39;s eerder 25,26 aangetoond. Hier beschrijven we kort stadium-specifieke MO injecties. Na alle injecties worden embryo&#39;s overgebracht naar een petrischaal en geïncubeerd bij 28,5 ° C. <ol><li> Global MO injectie: Verzamel embryo&#39;s onmiddellijk na de bevruchting en ze in een injectie plaat te laden. Laad fluorescerende MO in een capillaire naald en bevestig de naald op een microinjector (bijvoorbeeld Harvard Apparatus PLI-90 Pico-injector). Breek de naaldpunt en pas injectie instellingen (druk-en / of tijd) om een injectie druppel die een volume van 1 nl zoals beschreven 25,26 te creëren. Met behulp van een dissectie stereomicroscoop, injecteren 1 nl van MO in de dooier (Figuur 1A) van ≥ 50 embryo&#39;s per experiment. Werk snel om injecties te voltooien door de 4-cels herte. </li><li> DFC-gerichte MO injectie: Verzamel embryo&#39;s onmiddellijk na de bevruchting en incuberen bij 28,5 ° C. Wanneer de embryo&#39;s hebben de 256-cellig stadium (~ 2.5 HPF) bereikt, snel laden ze in een injectie plaat en vervolgens 1 nl van TL-MO injecteren in de dooier van ≥ 100 embryo&#39;s tussen de 256-cel en 1.000-cel stadia (figuur 1B). </li><li> Dooier-gerichte MO injectie: Verzamel embryo&#39;s onmiddellijk na de bevruchting en incubeer bij 28,5 ° C. Op dome stadium (~ 4 HPF) en laadt de embryo&#39;s in een injectie plaat en injecteer 1 nl van fluorescerende MO in de dooier van ≥ 100 embryo tussen de koepel en 30% epiboly fasen (Figuur 1C). </li></ol> 2. Selecteren van geïnjecteerde embryo&#39;s voor Analyse <ol><li> Wanneer MO geïnjecteerde embryo&#39;s bij de 75%-epiboly stadium (8 HPF), verwijder onbevruchte en dode embryo&#39;s en vervolgens het scherm levende embryo&#39;s onder een tl-dissectiemicroscoop voor de distributie van de fluorescerende MO. Dan allow geselecteerd embryo te ontwikkelen op 28,5 ° C. <ol><li> Voor wereldwijde MO injecties, selecteert embryo die gelijkmatig verdeeld fluorescentie in alle embryonale cellen (figuur 1D, Figuur 2A). </li><li> Voor DFC doelgericht MO injecties, selecteert embryo&#39;s die fluorescent MO heeft verspreid in de dooier en geconcentreerd verschijnt aan de dorsale blastoderm marge (DFC) (Figuur 1E; Figuur 2B). In dit stadium kan het moeilijk zijn om fluorescerende DFC door heldere fluorescentie in de onderliggende dooier visualiseren. Zorg ervoor dat embryo&#39;s waarbij de fluorescerende MO is opgenomen in embryonale cellen anders dan DFC&#39;s of blijft geaggregeerd op de injectieplaats (figuur 2D) uit te sluiten. </li><li> Voor dooier doelgericht MO injecties, selecteert embryo waarin MO fluorescentie gelijkmatig verdeeld over de dooier en niet waargenomen in embryonale cellen (Figuur 1F; Figuur 2C). Nogmaals, verwijder embryo&#39;s waarbij de fluorescerende MO blijftgeaggregeerd op de injectieplaats. </li></ol></li><li> Tussen de 2-4-somiet stadia (~ 11 HPF), scherm embryo&#39;s een tweede keer onder een fluorescentiemicroscoop met een sterkere vergroting. Dan kunnen geselecteerde embryo&#39;s te ontwikkelen op 28,5 ° C. <ol><li> Voor wereldwijde MO injecties, ervoor gekozen embryo&#39;s MO fluorescentie gelijkmatig verdeeld in KV en alle embryonale cellen (figuur 1D; figuur 2E). </li><li> Voor DFC-gerichte MO injecties, zorgvuldige selectie van embryo&#39;s die MO fluorescentie alleen in KV cellen en de dooier (figuur 1E &#39;) hebben. Transgene embryo express GFP in KV cellen, zoals Tg (Dusp6: d2EGFP) 27, kan helpen bij de identificatie van embryo&#39;s waarin MO succesvol afgeleverd aan KV cellen (figuur 2F). Gooi embryo&#39;s met MO fluorescentie in embryonale cellen andere dat KV cellen. </li><li> Voor dooier-gerichte MO injecties, selecteert embryo&#39;s die MO fluorescentie hebben uitsluitend in de dooier (Figuur 1F &#39;: Afbeelding2G). </li></ol></li></ol> 3. Montage Embryo&#39;s te Fluid Flow Analyze in KV <ol><li> Om asymmetrische stroming analyseren KV van de wereldwijde MO, DFC-gerichte MO of dooier-gerichte MO geïnjecteerde embryo&#39;s, zorgvuldig dechorionate ~ 20 embryo&#39;s tussen 4-6 somiet stadia (~ 11 tot 12 HPF) met scherpe tang. </li><li> Bereid 50 ml van 1% laag smeltpunt agarose en aliquot in 5 ml buizen worden gehouden als een vloeistof in een droge bad bij 42 ° C. </li><li> Overdracht een embryo aan een glas depressie dia (United Scientific Supplies, Inc) en verwijder zo veel van het water mogelijk te maken. Immobiliseren de embryo door toevoegen van voldoende warm 1% laag-smeltpunt agarose juist bedekt de embryo (teveel agarose kan interfereren met verdere imaging). Zoals de agarose stolt, een tang om het embryo zodanig te positioneren dat KV naar boven (dorsaal aanzicht) (figuur 1H). Monteer 10 embryo&#39;s met een embryo per dia. Werken snel zodat alle injecties in de volgende stap zijn completed door de 10 somiet fase (14 hpf). </li></ol> 4. Injectie van TL Microbeads in KV <ol><li> Verdun Fluoresbrite Multifuorescent 0,5 micron diameter Microspheres (Polysciences, Inc) om 1:50 in steriel water in een 1,5 ml Eppendorf buis. </li><li> Meng de 1:50 verdunning van microbolletjes door te tikken op de buis en plaats 3 ui in een capillaire naald. Met dezelfde microinjector voor MO injecties (bijv. Harvard Apparatus PLI-90 Pico-injector), breken de naaldpunt met een tang en pas de injectie instellingen om de kleinst mogelijke (&lt;0,5 nl) injectie drop te bepalen. </li><li> Onder een dissectiemicroscoop, lijnt u de naald met de KV lumen van de eerste gemonteerde embryo. Steek de naald in de lumen en injecteer een klein volume (&lt;0,5 nl) kralen (figuur 1G). Een kleine naald en kleine injectievolume zijn van cruciaal belang om schade aan KV voorkomen. </li><li> Injecteer alle gemonteerde embryo&#39;s. Zodra een embryo is injected een druppel steriel water kan worden toegevoegd bovenop de agarose te uitdroogt. Tijdens de injecties zullen de korrels blokkeren, de naald opening. Dit vereist de naald opnieuw breken en het aanpassen van de injectie volume door het moduleren van de druk of tijdinstelling van de micro-injectie apparaat. Vervang de naald als het bot wordt genoeg om aanzienlijke schade tijdens de injectie veroorzaken. </li><li> Het scherm van de geïnjecteerde embryo&#39;s voor succesvolle oplevering van kralen in een rechtopstaande tl samengestelde microscoop (bv. Zeiss AxioImager M1) met een 20X objectief. Bepaal eerst of KV structuur is intact met helderveld verlichting (Figuur 1J), en gebruik vervolgens de fluorescentie om de kralen te observeren. Selecteer embryo&#39;s waarin kralen aanwezig zijn en bewegen in de KV lumen. Gooi embryo&#39;s met KV schade of geen zwevende kralen in KV. Het is gemakkelijk om KV missen en kralen leveren nabijgelegen weefsel of de onderliggende dooier. Lukt dit niet, mount anopoort aansluiten op 10 embryo&#39;s en herhaal de injectie procedure. </li></ol> 5. Visualisatie en analyse van KV Fluid Flow <ol><li> Voor elke geselecteerde embryo met kralen in KV, voeg een druppel steriel water om de agarose te dekken en vervolgens KV observeren onder de rechtopstaande tl samengestelde microscoop met een 63X water dompelen doelstelling (figuur 1I). Als alternatief kan een dekglaasje worden toegepast voor gebruik met niet-water dompelen doelstellingen en / of omgekeerde microscoop. </li><li> Een high-speed camera geplaatst op de microscoop (Zeiss bijv. AxioCamHSm) een 10 sec film opneemt. Noteer zowel de kralen met de fluorescerende kanaal (ongeveer 70 frames / sec) en KV lumen met een helderveld of differentiële interferentie contrast (DIC) kanaal. </li><li> Als u alle kraal bewegingen te visualiseren na verloop van tijd, importeert u de film van fluorescerende kralen in ImageJ software (gratis te downloaden op <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ) eennd een maximum projectie van fluorescente signalen in de film. Om de maximale projectie in ImageJ uit te voeren, klikt u op &quot;Afbeelding → Stapels → Z project.&quot; In de &quot;Z-project&quot; venster, projecteren alle segmenten met projectie type &quot;Max intensiteit&quot;. Dit beeld kan worden gesuperponeerd op een afbeelding van de DIC KV waarin de korrels werden afgebeeld (Figuren 3A-B). </li><li> De bewegingen van de afzonderlijke kralen kunnen worden bijgehouden met ImageJ. Een plugin (&quot;Handmatige sporing&quot;) kan worden gedownload op <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a> . Open de fluorescerende kralen film in ImageJ en voer de handmatige Tracking functie. In het venster van de Handmatige sporing, check &quot;show parameters&quot; en input parameters voor &quot;tijdsintervallen&quot; en &quot;x / y kalibratie&quot;. Selecteer handmatig kralen die blijven in het brandvlak van de film voor ≥ 50 frames en dan volgen ≥ 5 kralen per embryo. Het pad en de snelheid van elke korrel wordt gegenereerd door the software (figuren 3 CD). </li></ol>

<ol><li>Sutherland, M. J., Ware, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorders+of+left-right+asymmetry%3A+heterotaxy+and+situsinversus%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet.+C+Semin.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Disorders of left-right asymmetry: heterotaxy and situsinversus.</a> Am. J. Med. Genet. C Semin. Med. Genet. 151C (4), 307-317 (2009).</li>
<li>Essner, J. J., Amack, J. D., Nyholm, M. K., Harris, E. B., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kupffer%27s+vesicle+is+a+ciliated+organ+of+asymmetry+in+the+zebrafish+embryo+that+initiates+left-right+development+of+the+brain%2C+heart+and+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Kupffer's vesicle is a ciliated organ of asymmetry in the zebrafish embryo that initiates left-right development of the brain, heart and gut.</a> Development. 132 (6), 1247-1260 (2005).</li>
<li>Nonaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomization+of+left-right+asymmetry+due+to+loss+of+nodal+cilia+generating+leftward+flow+of+extraembryonic+fluid+in+mice+lacking+KIF3B+motor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking KIF3B motor protein.</a> Cell. 95 (6), 829-837 (1998).</li>
<li>Essner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+function+for+embryonic+nodal+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conserved function for embryonic nodal cilia.</a> Nature. 418 (6893), 37-38 (2002).</li>
<li>Kramer-Zucker, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia-driven+fluid+flow+in+the+zebrafish+pronephros%2C+brain+and+Kupffer%27s+vesicle+is+required+for+normal+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis.</a> Development. 132 (8), 1907-1921 (2005).</li>
<li>Schweickert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia-driven+leftward+flow+determines+laterality+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cilia-driven leftward flow determines laterality in Xenopus.</a> Curr. Biol. 17 (1), 60-66 (2007).</li>
<li>Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+key+to+left-right+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The key to left-right asymmetry.</a> Cell. 127 (1), 27-32 (2006).</li>
<li>Cooper, M. S., D'Amico, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cluster+of+noninvolutingendocytic+cells+at+the+margin+of+the+zebrafish+blastoderm+marks+the+site+of+embryonic+shield+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A cluster of noninvolutingendocytic cells at the margin of the zebrafish blastoderm marks the site of embryonic shield formation.</a> Dev. Biol. 180 (1), 184-198 (1996).</li>
<li>Melby, A. E., Warga, R. M., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+cell+fates+at+the+dorsal+margin+of+the+zebrafish+gastrula%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Specification of cell fates at the dorsal margin of the zebrafish gastrula.</a> Development. 122 (7), 2225-2237 (1996).</li>
<li>Amack, J. D., Wang, X., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+T-box+genes+play+independent+and+cooperative+roles+to+regulate+morphogenesis+of+ciliated+Kupffer%27s+vesicle+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Two T-box genes play independent and cooperative roles to regulate morphogenesis of ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish.</a> Dev. Biol. 310 (2), 196-210 (2007).</li>
<li>Oteiza, P., Koppen, M., Concha, M. L., Heisenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+shaping+of+the+laterality+organ+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin and shaping of the laterality organ in zebrafish.</a> Development. 135 (16), 2807-2813 (2008).</li>
<li>Amack, J. D., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T+box+transcription+factor+no+tail+in+ciliated+cells+controls+zebrafish+left-right+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The T box transcription factor no tail in ciliated cells controls zebrafish left-right asymmetry.</a> Curr. Biol. 14 (8), 685-690 (2004).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26 (2), 216-220 (2000).</li>
<li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).</li>
<li>Kimmel, C. B., Law, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+of+zebrafish+blastomeres.+I.+Cleavage+pattern+and+cytoplasmic+bridges+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell lineage of zebrafish blastomeres. I. Cleavage pattern and cytoplasmic bridges between cells.</a> Dev. Biol. 108 (1), 78-85 (1985).</li>
<li>Arrington, C. B., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extra-embryonic+syndecan+2+regulates+organ+primordia+migration+and+fibrillogenesis+throughout+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Extra-embryonic syndecan 2 regulates organ primordia migration and fibrillogenesis throughout the zebrafish embryo.</a> Development. 136 (18), 3143-3152 (2009).</li>
<li>Caron, A., Xu, X., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+directly+regulates+Foxj1+expression+and+ciliogenesis+in+zebrafish+Kupffer%27s+vesicle%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling directly regulates Foxj1 expression and ciliogenesis in zebrafish Kupffer's vesicle.</a> Development. 139 (3), 514-524 (2012).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rho+kinase+Rock2b+establishes+anteroposterior+asymmetry+of+the+ciliated+Kupffer%27s+vesicle+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Rho kinase Rock2b establishes anteroposterior asymmetry of the ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish.</a> Development. 138 (1), 45-54 (2011).</li>
<li>Aamar, E., Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox17+and+chordin+are+required+for+formation+of+Kupffer%27s+vesicle+and+left-right+asymmetry+determination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Sox17 and chordin are required for formation of Kupffer's vesicle and left-right asymmetry determination in zebrafish.</a> Dev. Dyn. 239 (11), 2980-2988 (2010).</li>
<li>Neugebauer, J. M., Amack, J. D., Peterson, A. G., Bisgrove, B. W., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signalling+during+embryo+development+regulates+cilia+length+in+diverse+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">FGF signalling during embryo development regulates cilia length in diverse epithelia.</a> Nature. 458 (7238), 651-654 (2009).</li>
<li>Schneider, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Nkd1+promotes+Dvl+degradation+and+is+required+for+left-right+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Nkd1 promotes Dvl degradation and is required for left-right patterning.</a> Dev. Biol. 348 (1), 22-33 (2010).</li>
<li>Matsui, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canopy1%2C+a+positive+feedback+regulator+of+FGF+signaling%2C+controls+progenitor+cell+clustering+during+Kupffer%27s+vesicle+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Canopy1, a positive feedback regulator of FGF signaling, controls progenitor cell clustering during Kupffer's vesicle organogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), 9881-9886 (2011).</li>
<li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2CK-ATPase+alpha2+and+Ncx4a+regulate+zebrafish+left-right+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Na,K-ATPase alpha2 and Ncx4a regulate zebrafish left-right patterning.</a> Development. 134 (10), 1921-1930 (2007).</li>
<li>Esguerra, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ttrap+is+an+essential+modulator+of+Smad3-dependent+Nodal+signaling+during+zebrafish+gastrulation+and+left-right+axis+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ttrap is an essential modulator of Smad3-dependent Nodal signaling during zebrafish gastrulation and left-right axis determination.</a> Development. 134 (24), 4381-4393 (2007).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113(2009).</li>
<li>Molina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Schneider, I., Houston, D. W., Rebagliati, M. R., Slusarski, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+fluxes+in+dorsal+forerunner+cells+antagonize+beta-catenin+and+alter+left-right+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Calcium fluxes in dorsal forerunner cells antagonize beta-catenin and alter left-right patterning.</a> Development. 135 (1), 75-84 (2008).</li>
<li>Clement, A., Solnica-Krezel, L., Gould, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cdc14B+phosphatase+contributes+to+ciliogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Cdc14B phosphatase contributes to ciliogenesis in zebrafish.</a> Development. 138 (2), 291-302 (2011).</li>
<li>Matsui, T., Bessho, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-right+asymmetry+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Left-right asymmetry in zebrafish.</a> Cell Mol. Life Sci. , (2012).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Met behulp van fase-specifieke injecties om MO te richten op de DFC / KV cellijn is een bruikbare benadering van de cel-autonomie van gen-functie te bestuderen en te voorkomen dat pleiotrope fenotypes veroorzaakt door de opwarming gen knockdown. Toch kunnen deze injecties zijn technisch uitdagend. Injectie van MO tussen de 256-cel en 1.000 cellen fasen kan resulteren in drie mogelijkheden: 1) de MO blijft geaggregeerd op de injectieplaats, 2) de MO diffundeert in de dooier en gaat DFC / KV cellen of 3) de MO diffundeert...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Materiaal </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td></tr><tr><td> Standaard besturing tagged oligo-Lissamine </td><td> Gene Tools, LLC </td><td></td></tr><tr><td> Aangepaste Rock2b morfolino oligo </td><td> Gene Tools, LLC </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite Multifluorescent 0,5 micron microsferen </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 24054 </td></tr></tbody></table>

analyse van gen-functie en visualisatie van cilia-gegenereerde fluid flow in blaasjes kupffer&#39;s

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

Interne organen zoals het hart, hersenen, darm en ontwikkelen links-rechts (LR) asymmetrie die essentieel zijn voor hun normale functie 1. Beweeglijke cilia zijn betrokken bij het ​​vaststellen van LR asymmetrie in gewervelde embryo&#39;s, met inbegrip van de muis, kikker, en zebravis 2-6. Deze &#39;LR&#39; cilia genereren asymmetrische vloeistofstroom die nodig is om een geconserveerde asymmetrische Nodal (TGF-β superfamilie) signaalcascade in de linker laterale plaat mesoderm, waarvan men denkt dat LR patronen informatie voor ontwikkelende organen 7 activeren. Dus begrijpen mechanismen LR patroon, is het essentieel om genen te identificeren die de organisatie van LR gecilieerde cellen, de motiliteit en de lengte van LR cilia en hun vermogen om robuuste asymmetrische stromen genereren reguleren. In de zebravisembryo zijn LR cilia in vesicle Kupffer&#39;s (KV) 2,4,5. KV bestaat uit een enkele laag van epitheelcellen monociliateddat een met vloeistof gevulde lumen omsluiten. Fate mapping is gebleken dat KV is afgeleid van een groep van ~ 20-30 cellen bekend als dorsale voorloper cellen (DFC) die migreren op de dorsale blastoderm marge in epiboly fasen 8,9. Tijdens de vroege stadia somiet, om DFC&#39;s cluster en differentiëren tot trilharen epitheelcellen vormen KV in de tailbud van het embryo 10,11. De mogelijkheid om te identificeren en te volgen DFC-in combinatie met optische transparantie en de snelle ontwikkeling van de zebravis embryo-maken zebravis KV een uitstekend modelsysteem om LR trilharen cellen te bestuderen. Interessant, voorvaderen van de DFC / KV cellijn te behouden cytoplasmatische bruggen tussen de dooier cel tot 4 uur na de bevruchting (HPF), terwijl cytoplasmatische bruggen tussen de dooier cel en andere embryonale cellen dicht na 2 hpf 8. Maken van deze cytoplasmatische bruggen hebben we een stadium-specifieke injectie strategie morfolino oligonucle leverenotides (MO) uitsluitend DFC en knockdown de functie van een gerichte gen in deze cellen 12. Deze techniek zorgt voor chimerisch embryo&#39;s in welk gen functie wordt naar beneden geklopt in de DFC / KV afkomst ontwikkelen in het kader van een wild-type embryo. Om asymmetrische stroming analyseren KV, we injecteren fluorescerende microbolletjes in de KV lumen en opnemen kraal beweging met behulp van videomicroscopie 2. Fluïdumstroom gemakkelijk gevisualiseerd en kan worden gekwantificeerd door het volgen bead verplaatsing in de tijd. Hier, met het stadium-specifieke DFC-targetgen knockdown techniek en injectie van fluorescerende microbolletjes in KV stromen visualiseren we een protocol dat een effectieve benadering van de rol van een bepaald gen te karakteriseren tijdens KV ontwikkeling en functie biedt.

Stadiumspecifieke MO injecties geven een nuttige benadering voor genfunctie analyse in specifieke compartimenten van de embryo. Figuur 1 toont een stroomschema van de injectie strategieën om genfunctie testen DFC / KV cellen en hoe fluorescerende kralen introduceren fluïdumstroming visualiseren in KV. De verdeling van fluorescentie in MO succesvolle stadium-specifieke geïnjecteerde embryo&#39;s is schematisch weergegeven in de figuren 1D-F en levende embryo&#39;s in Figuur 2.</s...

Cilia-gegenereerde vloeistofstroom in Blaasjes Kupffer&#39;s (KV) regelt links-rechts patroonvorming van de zebravis embryo. We beschrijven een techniek voor het moduleren genfunctie specifiek in KV cellen. Verder tonen we hoe fluorescerende kralen leveren in KV om vloeistofstroming visualiseren.

Analyse van gen-functie en visualisatie van Cilia-gegenereerde Fluid Flow in Blaasjes Kupffer&#39;s

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

Het doel van deze procedure is om de functie van genen in de Kavas-blaasjes of de KV in de zebravis-embryo te moduleren, die verantwoordelijk is voor het patroon links-rechts, en asymmetrische vloeistofstroming te analyseren die wordt gegenereerd door motiele cilia door het leveren van fluorescerende kralen in de kv. Dit wordt bereikt door eerst fluorescerende morph-oligonucleotiden te injecteren die de expressie van een specifiek gen van belang onderdrukken in de dooiercel van een embryo in het midden van de blaasholte Dilla-stadium, zodat ze in dorsale voorlopercellen worden geladen die de kv vormen. Vervolgens worden embryo's geselecteerd die alleen fluorescente morphos in de dooiercel en de kv hebben voor verdere analyse.Vervolgens worden de embryo's gemonteerd op depressieschuifjes en worden fluorescerende kralen geïnjecteerd in het vloeistofgevulde blaasjeslumen van de kv. Ten slotte wordt videomicroscopie gebruikt om kralen te registreren die binnen de kv stromen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die bepalen of weefselspecifieke depletie van een kandidaatgen in de KV asymmetrische vloeistofstroming verandert door middel van kwantitatieve analyse van kralenbewe

analysis-gene-function-visualization-cilia-generated-fluid-flow

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een eenvoudige en betrouwbare techniek voor het visualiseren en kwantificeren luchtwegen trilharen beweeglijkheid en trilharen gegenereerde stroom met behulp van de muis luchtpijp wordt beschreven. Deze techniek kan worden aangepast om te bepalen hoe een groot aantal factoren beïnvloeden cilia motiliteit, zoals farmacologische agentia, genetische factoren, omgevingsfactoren blootstelling en / of mechanische factoren zoals slijm belasting.

Ex vivo methode voor High Resolution Imaging van Cilia Motility in Knaagdieren luchtwegepithelen

De gigantische ciliaat Stentor coeruleus is een klassiek systeem voor het bestuderen van regeneratie en wondgenezing in enkele cellen. Door Stentor-cellen gelijktijdig bij lage en hoge vergroting te beeldhouwen, is het mogelijk om cytoplasmatische stromingen voor, tijdens en na verwonding te meten.

Cytoplasmatisch stromen visualiseren tijdens wondgenezing van één cel in Stentor coeruleus

Cilia van olfactorische sensorische neuronen bevatten eiwitten van de signaaltransductiecascade, maar een gedetailleerde ruimtelijke analyse van hun verdeling is moeilijk in cryosecties. We beschrijven hier een geoptimaliseerde aanpak voor hele montage-etikettering en en face visualisatie van ciliaire eiwitten.

Hele Mount Labeling van Cilia in het Main Olfactorische Systeem van Muizen

In dit onderzoek werd een gedetailleerde lichtmicroscopische techniek geoptimaliseerd voor real-time observatie en analyse van de beweging van CPEC cilia ex vivo samen met een elektronenmicroscopische methode voor ultrastructurele analyse.

Observatie van de Ciliaire Beweging van Choroid Plexus epitheelcellen<em&gt; Ex Vivo</em

Hier wordt getoond hoe ontwikkelingsprocessen in C. elegans kunnen worden gevolgd en gekwantificeerd. De gepresenteerde methoden zijn gebaseerd op open-source tools die gemakkelijk kunnen worden geïmplementeerd. Het wordt gedemonstreerd hoe 3D-celvormmodellen kunnen worden gereconstrueerd, hoe subcellulaire structuren handmatig kunnen worden gevolgd en hoe corticaal contractiele stroom kan worden geanalyseerd.

Tracking en kwantificeren van ontwikkelingsprocessen in<em&gt; C. elegans</em&gt; Het gebruik van open-source tools

Onlangs we toegewezen de driedimensionale (3D) ruimtelijke locaties van transportroutes voor verschillende eiwitten translocating binnen de primaire cilia in levende cellen. Hier leven de details van dit papier de experimentele opzet, het proces van biologische monsters en de data-analyses voor de 3D super resolutie fluorescentie imaging aanpak nieuw toegepast in primaire cilia.

Toepassing van snelle super resolutie snelheid microscopie in levende primaire Cilium

Weefsel complexiteiten van multicellulaire systemen Verwar de identificatie van causaal verband tussen extracellulaire cues en individuele cellulaire gedragingen. Hier presenteren we een methode om de directe link tussen contact afhankelijke signalen en delings assen te bestuderen met behulp van C. elegans embryo blastomeres en zelfklevende polystyreen kralen.

In vitro reconstitutie van ruimtelijke Celcontactpatronen met geïsoleerde Caenorhabditis elegans embryo Blastomeres en zelfklevende polystyreen kralen

Het gebruik van kunstmatige intelligentie (Ai) om beelden te analyseren is in opkomst als een krachtige, minder bevooroordeelde en snelle aanpak in vergelijking met veelgebruikte methoden. Hier hebben we Ai getraind om een cellulair organel, primaire trilharen te herkennen en eigenschappen zoals lengte en kleurintensiteit op een rigoureuze en reproduceerbare manier te analyseren.

Kunstmatige intelligentie benaderingen voor het beoordelen van primaire trilharen

In het vroege Drosophila-embryo zijn veel organellen beweeglijk. In principe kunnen ze live worden afgebeeld via specifieke fluorescerende sondes, maar de eierschaal voorkomt directe toepassing op het embryo. Dit protocol beschrijft hoe dergelijke sondes via micro-injectie kunnen worden geïntroduceerd en vervolgens bulk organelbeweging kan worden geanalyseerd via deeltjesbeeld velocimetrie.

Visualisatie van cytoskeletafhankelijke handel in lipidenbevattende organellen in drosophila-embryo's

Deze methode beschrijft de exploitatie van het endogene signaal in een ARL13B-CENTRIN-2 transgeen muismodel om primaire cilia in situ in beeld te brengen, in drie dimensies over grote delen van gemineraliseerd weefsel, van weefselverzameling tot analyse van de organisatie van cilia's. Dit protocol kan ook worden toegepast op andere soorten weefsels.

Volumetrische beeldvorming en analyse van primaire trilharen in musculoskeletaal weefsel met behulp van het ARL13B-CENTRIN-2-muismodel

Leer genfunctie-analyse en visualisatie van cilia-gemedieerde vloeistofstroming in Kupffer's Vesicle van zebrafishembryo's met fluorescerende microbolletjes. Deze methode ondersteunt onderzoek naar links-rechts patroonvorming.

Analyse van gen-functie en visualisatie van Cilia-gegenereerde Fluid Flow in Blaasjes Kupffer's

Meer video's verkennen