Analyse van gen-functie en visualisatie van Cilia-gegenereerde Fluid Flow in Blaasjes Kupffer's
March 31st, 2013
Cilia-gegenereerde vloeistofstroom in Blaasjes Kupffer's (KV) regelt links-rechts patroonvorming van de zebravis embryo. We beschrijven een techniek voor het moduleren genfunctie specifiek in KV cellen. Verder tonen we hoe fluorescerende kralen leveren in KV om vloeistofstroming visualiseren.
Het doel van deze procedure is om de functie van genen in de Kavas-blaasjes of de KV in de zebravis-embryo te moduleren, die verantwoordelijk is voor het patroon links-rechts, en asymmetrische vloeistofstroming te analyseren die wordt gegenereerd door motiele cilia door het leveren van fluorescerende kralen in de kv. Dit wordt bereikt door eerst fluorescerende morph-oligonucleotiden te injecteren die de expressie van een specifiek gen van belang onderdrukken in de dooiercel van een embryo in het midden van de blaasholte Dilla-stadium, zodat ze in dorsale voorlopercellen worden geladen die de kv vormen. Vervolgens worden embryo's geselecteerd die alleen fluorescente morphos in de dooiercel en de kv hebben voor verdere analyse.
Vervolgens worden de embryo's gemonteerd op depressieschuifjes en worden fluorescerende kralen geïnjecteerd in het vloeistofgevulde blaasjeslumen van de kv. Ten slotte wordt videomicroscopie gebruikt om kralen te registreren die binnen de kv stromen. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die bepalen of weefselspecifieke depletie van een kandidaatgen in de KV asymmetrische vloeistofstroming verandert door middel van kwantitatieve analyse van kralenbewegingen.
Virale demonstratie van dit semester is cruciaal, aangezien stadiumspecifieke molino-injecties en fluoresceine-kralen-injecties moeilijk te leren zijn omdat beide afhankelijk zijn van het positioneren van het embryo en het ontwikkelingstijdstip van het experiment. Om globale morph- of MO-injecties uit te voeren, verzamel embryo's direct na de bevruchting en laad ze in een injectieplaat. Gebruik een met vuur gepolijste pastour-pipet om de embryo's in de injectieplaat te plaatsen om de embryo's te immobiliseren.
Breek de punt van een injectienaald af en pas de injectie-instellingen aan om een injectiedruppel te maken met een volume van één nanoliter. Gebruik een dissectiescoop om een nanoliter MO in de yoke van ten minste 50 embryo's tussen de een- en viercellige stadia te injecteren. Voor DFC-gerichte M mo-injectie verzamel embryo's direct na de bevruchting en incubeer ze bij 28,5 graden Celsius.
Wanneer de embryo's het 256-celstadium bereiken, laad ze snel in een injectieplaat en injecteer een nanoliter fluorescerende MO in de yoke. Injecteer ten minste 100 embryo's tussen de 256 en 1000 celstadia om een yoke-gerichte injectie uit te voeren. Nadat bevruchte eieren tot de dome-fase zijn geïncubeerd, injecteer je een nanoliter fluorescerende MO in de yoke van ten minste 100 embryo's tussen de dome- en 30%are ply-stadia.
Wanneer M mo-geïnjecteerde embryo's het 75%a ply-stadium bereiken. Verwijder onbevruchte en dode embryo's onder een dissectiescoop voor globale MO-injecties. Kies levensvatbare embryo's voor gelijkmatig verdeelde fluorescentie in alle cellen.
Voor DFC-gerichte M mo-injecties, selecteer embryo's met fluorescentie verspreid door de yoke en geconcentreerd aan de dorsale geblazen dermmarge. Voor yoke-gerichte MO-injecties. Kies embryo's waarbij de fluorescentie gelijkmatig over de yoke is verdeeld en niet wordt waargenomen in enige embryonale cellen tussen de twee tot vier.
Selecteer DFC-gerichte embryo's die alleen fluorescentie vertonen in de KV-cellen en de yoke en gooi de rest weg voor yoke-gerichte injecties. Selecteer embryo's met exclusieve fluorescentie in de yoke om asymmetrische stroming in de KV van MO-geïnjecteerde embryo's te analyseren, begin door ongeveer 20 embryo's tussen de vier tot zes met scherpe pincetten zorgvuldig te coaten.
Transfereer één embryo naar een glazen depressieschuifje en verwijder zoveel mogelijk water. Immobiliseer het embryo door voldoende warme 1% lage smeltpunt aero toe te voegen om het net te bedekken terwijl de aero stolt. Gebruik pincetten om het zo te positioneren dat de KV omhoog wijst, monteer 10 embryo's en werk snel om ervoor te zorgen dat alle injecties zijn voltooid bij de 10.
Na het verdunnen van fluorescerende microkralen met een diameter van 0,5 micron tot één op 50 in steriel water. Meng de kralen grondig en laad drie microliters in een capillaire naald met behulp van dezelfde micro-injector die voor MO-injecties is gebruikt.
Gebruik pincetten om de naaldpunt te breken en pas de injectie-instellingen aan om de kleinst mogelijke injectiedruppel te genereren. Uitlijn vervolgens de naald onder een dissectiescoop met de KV-lumen van het eerste gemonteerde embryo. Steek vervolgens de naald in het lumen en injecteer minder dan 0,5 nanoliters kralen.
Voeg een druppel steriele water toe op de aros om te voorkomen dat het embryo uitdroogt onder een rechtopstaande fluorescentiemicroscoop. Gebruik een 20 x objectief om de geïnjecteerde embryo's te screenen op succesvolle bezorging van kralen voor elk geselecteerd embryo met kralen binnen de KV bij een druppel steriele water om de aros te bedekken. Observeer vervolgens met behulp van een fluorescente compoundmicroscoop met een 63 x water-dipobjectief.
Gebruik een hogesnelheidscamera gemonteerd op de microscoop om een film van tien seconden op te nemen. Gebruik het fluorescente kanaal om de kralen op ongeveer 70 frames per seconde op te nemen en ofwel brightfield of differentiële interferentie contrast om het KV-lumen op te nemen. Importeer de films in Image J. Maak maximale projecties en gebruik de software om de bewegingen van de individuele kralen bij te houden.
Deze figuur toont de verdeling van fluorescerende MO in succesvolle stadiumspecifieke levend geïnjecteerde embryo's. Een onsuccesvolle MO-injectie waarbij de oplossing geaggregeerd blijft in de dooiercel wordt hier getoond. Vloeistofstroming in succesvol geïnjecteerde embryo's kan kwalitatief of kwantitatief worden gemeten in een controle-embryo met normale stromingskralen.
Volg tegen de klok in gerichte paden die kunnen worden gevisualiseerd door een maximale projectie van fluorescente kralenposities in de loop van de tijd te maken of door individuele kralen in de loop van de tijd te volgen. Om het verlies van gecoördineerde stroming te demonstreren, werden embryo's geïnjecteerd met MO om row kinase twee B of rock twee B te breken, wat de stroming verstoort, en als gevolg hiervan bewegen de kralen willekeurig in kv, de gemiddelde snelheid van vijf
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie richt zich op de modulatie van genfunctie in de Vesicle van Kupffer (KV) van zebravisembryo's, wat cruciaal is voor het linker-rechter patroon. De auteurs beschrijven een methode voor het visualiseren van vloeistofstroming in KV door het aanbrengen van fluorescerende kralen.
Belangrijkste Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Embryologie
Achtergrond
- De Vesicle van Kupffer speelt een belangrijke rol bij het vestigen van linker-rechter asymmetrie in zebravissen.
- Cilia in KV genereren vloeistofstroming die de embryonale ontwikkeling beïnvloedt.
- Het begrijpen van genfunctie in KV kan inzichten verschaffen in ontwikkelingsprocessen.
- Fluorescerende kralen kunnen worden gebruikt om vloeistofdynamica in KV te visualiseren en te analyseren.
Doel van Studie
- Om genfunctie specifiek te moduleren in KV-cellen van zebravisembryo's.
- Om het effect van genmodulatie op asymmetrische vloeistofstroming in KV te analyseren.
- Om een techniek te ontwikkelen voor het visualiseren van vloeistofstroming met behulp van fluorescerende kralen.
Gebruikte Methoden
- Injectie van fluorescerende morpholino-oligonucleotiden in dooiercellen van embryo's in het midden-blastula-stadium.
- Selectie van embryo's met fluorescerende morpholino's in KV voor verdere analyse.
- Injectie van fluorescerende kralen in het lumen van KV.
- Videomicroscopie om kralenbeweging op te nemen en vloeistofstroming te analyseren.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle modulatie van genexpressie in KV-cellen.
- Visualisatie van vloeistofstroming in KV met behulp van fluorescerende kralen.
- Kwantitatieve analyse van kralenbewegingen om de impact van genfunctie op vloeistofdynamica te beoordelen.
- Bevindingen suggereren dat specifieke gendepletie de asymmetrische vloeistofstroming in KV verandert.
Conclusies
- De ontwikkelde techniek maakt gerichte genmodulatie in KV-cellen mogelijk.
- Injectie van fluorescerende kralen is effectief voor het bestuderen van vloeistofdynamica in zebravisembryo's.
- Resultaten dragen bij aan het begrip van de rol van KV bij linker-rechter patroon.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Understanding left-right asymmetry establishment in vertebrate embryos provides mechanistic insights into developmental signaling pathways relevant to congenital disorder modeling. The zebrafish Kupffer's vesicle model enables high-resolution visualization of cilia-driven fluid flow, supporting target validation in early developmental biology. This approach aids in de-risking hypotheses about genes regulating asymmetric signaling cascades before mammalian translation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in dorsal forerunner cells to assess impact on cilia-mediated left-right patterning.
- Operational Value: Uses stage-specific morpholino knockdown to create chimeric embryos for lineage-restricted functional analysis.
- Predictive Value: Links gene depletion to alterations in asymmetric fluid flow, providing functional readouts for target validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Fluorescent bead injection into Kupffer's vesicle lumen allows direct visualization and quantification of motility-driven flow.
- Operational Value: Enables high-speed video capture and bead tracking for objective measurement of flow dynamics.
- Assay Readiness: Generates quantitative displacement data that can be correlated with genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models conserved Nodal signaling pathway initiation, relevant to laterality defect studies.
- Translational Continuity: Connects cilia function in zebrafish KV to asymmetric signaling in lateral plate mesoderm.
- Mechanistic De-risking: Supports evaluation of whether candidate genes affect flow symmetry before mammalian model testing.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery workflows by linking genetic modulation to functional phenotypic readouts in a living embryo system.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about gene roles in cilia organization and motility through targeted knockdown in dorsal forerunner cells.
- Screening: Delivers fluorescent beads to quantify flow as a functional output of cilia activity.
- Analytics: Uses bead tracking to generate velocity and trajectory data for flow asymmetry assessment.
- Translational Research: Connects KV flow to downstream Nodal signaling, supporting relevance to symmetry-breaking mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for gene-function-to-phenotype mapping in vertebrate left-right patterning.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into how genes regulate cilia-dependent fluid flow and symmetry initiation.
- Operational Value: Combines lineage-specific gene knockdown with live imaging for correlated genetic and phenotypic analysis.
- Strategic Value: Enables early-stage go/no-go decisions based on functional disruption of conserved patterning mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports prioritization of targets based on their role in establishing asymmetric signaling cascades.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryo handling, microinjection, and fluorescence microscopy.
- Dependent on precise timing of injection relative to developmental stages (dome to 30% epiboly for DFC targeting).
- Needs fluorescent bead preparation and high-speed video capture capability for flow quantification.
- Requires optimization of bead concentration and injection volume to avoid lumen obstruction or embryo damage.
- Limited to non-mammalian systems; findings require validation in higher vertebrate models for translational relevance.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:49
Stage-specific Injection of Morpholinos (MO)
3:10
Selecting Injected Embryos for Analysis
4:16
Mounting Embryos and Injection of Fluorescent Beads to Analyze Fluid Flow in Kupffer's Vesicle
5:56
Visualization and Analysis of KV Fluid Flow
6:38
Representative Kupffer's Vesicle Fluid Flow Results
7:45
Conclusion
