Name: Een In vivo Assay naar Blood Vessel Permeabiliteit Test (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Leer een in vivo assay voor bloedvatdoorlaatbaarheid met blauwe kleurstof die aan albumine bindt in muizen. Deze methode helpt onderzoekers endotheliale integriteit en vasculaire ziekten bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van de National Institutes of Health, R01CA142928.

1. Intraveneuze injectie van Evans Blue in de muis laterale staartader <ol><li> Bereid een 0,5% steriele oplossing van Evans blauw in PBS. Indien nodig, filter-steriliseren de oplossing voor alle deeltjes die niet is opgelost te verwijderen. </li><li> Verstuif 200 pi Evans Blue oplossing in een spuit. Vermijd alle luchtbellen die kunnen zijn ontsnapt in de spuit. </li><li> Plaats muizen die 8-12 weken oud zijn in een terughoudendheid apparaat, zodat het dier niet vrij mobiel, maar zijn staart kan worden behandeld. </li><li> Plaats de muis terughoudendheid apparaat op zijn kant, zodat de laterale staartader goed zichtbaar is en naar boven gericht zijn. </li><li> Houd u vast aan de staart met de niet-dominante hand tussen duim en wijsvinger. </li><li> Steek de naald (gauge kleine, 27-30) op een 10-15 graden, bevel up, vooraf in de laterale staartader in de richting van het hoofd. Houd de naald en spuit parallel aan de staart. </li><li> Do niet van toepassing tegendruk om de juiste plaatsing te bevestigen, omdat dit zou kunnen de ader instorten. </li><li> Injecteer langzaam 200 ui Evans Blue oplossing in de staartader van de muis. </li><li> Neem het gemak waarmee de plunjer vooruitgang, aangezien dit het bewijs van juiste plaatsing van de naald in de ader. </li><li> Plaats de muis in zijn kooi en observeren gedurende 30 minuten. </li></ol> 2. Orgel en extractie van Evans Blue van de organen <ol><li> Offer de muizen door middel van cervicale dislocatie. Voor Miles test doeleinden cervicale dislocatie wordt aanbevolen als het beperkt significante interferentie met vasculaire permeabiliteit. Offeren alle muizen op hetzelfde moment, zo snel mogelijk. Werken met cohorten van 6 muizen of minder, want kort na de dood van de bloedvaten meer doorlaatbaar. </li><li> Plaats de muizen op hun rug en pin hun voeten op een wit bord. </li><li> Open de buik-en borstholte te thor blootACIC en buikorganen. </li><li> Representatieve foto&#39;s om verschillen in Evans Blue extravasatie te tonen. Alle muizen op hetzelfde gebied om dezelfde lichtomstandigheden hebben voor alle muizen. </li><li> Verzamel organen van belang en leg ze in 1,5 ml buizen </li><li> Weeg een lege buis en breng het saldo op nul. </li><li> Breng het weefselmonster en wegen het. Herhaal dit voor alle weefselmonsters. Weefsel kan lucht gedroogd om het watergehalte variabiliteit tussen verschillende organen elimineren. </li><li> . Voeg 500 ul formamide aan elk weefselmonster buis. </li><li> Breng alle buizen tot 55 ° C waterbad of warmteblok. Incubeer gedurende 24-48 uur aan Evans Blue onttrekken weefsel. </li></ol> 3. Kwantificering van Evans Blue geëxtravaseerd in bindweefsel <ol><li> Centrifugeer de Formamide / Evans Blue mengsel resterende pellet weefselfragmenten. </li><li> Meet absorptie bij 610nm. Gebruik 500 ul Formamide als blanco. </li><li> Bereken ng Evans Blue extravasatie per mg weefsel. </li><li> Teken alle gegevens in een grafiek. </li><li> Uitvoeren van statistische analyse om significante verschillen vast te stellen. </li></ol>

<ol><li>Beck, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+NO+synthase%3A+role+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Inducible NO synthase: role in cellular signaling.</a> J. Exp. Biol. 202, 645-653 (1999).</li>
<li>Bertglia, S., Giusti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+nitric+oxide+in+capillary+perfusion+and+oxygen+delivery+regulation+during+systemic+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of nitric oxide in capillary perfusion and oxygen delivery regulation during systemic hypoxia.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, H525-H531 (2005).</li>
<li>Miles, A. A., Miles, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+reactions+to+histamine%2C+histamine-liberator+and+leutaxine+in+the+skin+of+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Vascular reactions to histamine, histamine-liberator and leutaxine in the skin of guinea pigs.</a> J. Physiol. (London). 118, 228-257 (1952).</li>
<li>Weis, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability+in+cardiovascular+disease+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability in cardiovascular disease and cancer.</a> Curr. Opin. Hematol. 15, 243-249 (2008).</li>
<li>Kumar, P., Shen, Q., Pivetii, C. D., Lee, E. S., We, M. H., Yuan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+endothelial+hyperpermeability%3A+implications+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of endothelial hyperpermeability: implications in inflammation.</a> Expert Rev. Mol. Med. 30, 11-19 (2009).</li>
<li>Viazzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability%2C+blood+pressure%2C+and+organ+damage+in+primary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertens.+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension.</a> Hypertens. Res. 31, 873-879 (2008).</li>
<li>Scheppke,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+vascular+permeability+suppression+by+topical+application+of+a+novel+VEGFR2%2FSrc+kinase+inhibitor+in+mice+and+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits.</a> J. Clin. Invest. 118, 2337-2346 (2008).</li>
<li>Blanchet, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+CD34+Leads+To+Exacerbated+Autoimmune+Arthritis+through+Increased+Vascular+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Loss of CD34 Leads To Exacerbated Autoimmune Arthritis through Increased Vascular Permeability.</a> J. Immunol. 184, 1292-1299 (2010).</li>
<li>Dvorak, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell-derived+mediators+of+enhanced+microvascular+permeability%2C+vascular+permeability+factor%2Fvascular+endothelial+growth+factor%2C+histamine%2C+and+serotonin%2C+cause+leakage+of+macromolecules+through+a+new+endothelial+cell+permeability+organelle%2C+the+vesiculo-vacuolar+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Immunol.+Allergy%22%5BJournal%5D)">Mast cell-derived mediators of enhanced microvascular permeability, vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, histamine, and serotonin, cause leakage of macromolecules through a new endothelial cell permeability organelle, the vesiculo-vacuolar organelle.</a> Chem. Immunol. Allergy. 85, 185-204 (2005).</li>
<li>Le Guelte, A., Gavard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelial+cell-cell+junctions+in+endothelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of endothelial cell-cell junctions in endothelial permeability.</a> Methods Mol. Biol. 763, 265-279 (2011).</li>
<li>Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assay+system+for+in+vitro+detection+of+permeability+in+human+%22endothelium%22%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium".</a> Methods Enzymol. 443, 137-153 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen conflict of concurrerende financiële belangen.

Vasculaire permeabiliteit is een kritische marker voor bloedvat status. Verhoogde vasculaire permeabiliteit is aangetoond aanwezig zijn in verschillende systemische ziekten, zoals diabetes, hypertensie en auto-immuunziekten 6,7,8. Verhoogde vasculaire permeabiliteit is aangetoond worden gemedieerd door schuifspanning, groeifactoren zoals vasculaire endotheliale groeifactor en fibroblastgroeifactor, ontstekingsmediatoren zoals serotonine, histamine en bradykinine 9. Extravasatie van water en kleine ...

Vorming en instandhouding van selectieve permeabele barrières essentieel zijn voor het orgaanontwikkeling en prestaties 1,2. Endotheelcellen lijn het bloedvatlumen en vormen een semi-permeabele barrière die essentieel in het selectieve transport tussen bloed en de interstitiële ruimte van alle organen. Een adequate barrière wordt gehandhaafd door nauwe cel-cel verbindingen die streng worden gecontroleerd door groeifactoren, cytokines en andere stress gerelateerde moleculen 3. Verstoring van de endotheliale barrière kan resulteren in verhoogde permeabiliteit en vasculair lekken. Deze effecten worden gezien bij diverse ziektebeelden en het begrip van de onderstreping moleculaire signalering vereist multidisciplinaire methoden 4,5. In dit artikel beschrijven we een in vivo methode om vat permeabiliteit met behulp van een muis-model te meten. De assay we beschrijven, ook bekend als Miles assay is een goed establchine methode vasculaire permeabiliteit in vivo te testen. De assay is gebaseerd op het feit dat, onder basale fysiologische omstandigheden albumine niet de endotheliale barrière. Evans Blue, een azokleurstof met hoge affiniteit voor albumine, geïnjecteerd in de bloedstroom van een proefdier, onder fysiologische omstandigheden wordt verwacht te worden beperkt binnen bloedvaten. Wanneer een vasculaire permeabiliteit stimulus wordt toegevoegd, lokaal of systemisch, bloedvaten gaan lekken eiwit en dus ook de Evans blauwe die is gebonden aan albumine. Dit resulteert in een snelle blauwe kleuring van weefsels die doorlatend schepen. Succesvolle injectie van de kleurstof in de muis laterale staartader is essentieel voor de goede afloop van het experiment. Staartader injectie techniek vereist veel oefening en moeten voor worden beheerst het starten van het experiment. Vaartuig permeabiliteit is sterk afhankelijk van de leeftijd en het gewicht van de eeniMAL, dus bij het vergelijken van verschillende muizenstammen is het noodzakelijk dat de muizen of andere proefpersonen hebben bijna identieke geboortedata en gewicht. Andere factoren die de doorlaatbaarheid van de endotheliale barrière beïnvloeden zijn omgevingsomstandigheden zoals temperatuur, vochtigheid, en zeer belangrijk, de behandeling stress van de muis. Vanwege het grote aantal factoren die de uitkomst van het experiment kunnen beïnvloeden is het altijd wenselijk dat de experiment wordt herhaald ten minste driemaal en statistische analyse uitgevoerd. Deze test kan worden gebruikt of vaartuig permeabiliteit van muizen die genetisch gemodificeerd zijn, en muizen met verschillende genetische achtergronden vergelijken. Permeabiliteit kan worden beoordeeld in de aanwezigheid of afwezigheid van een stimulus, afhankelijk van de functie van het gen dat is gemoduleerd. Deze test kan ook worden gebruikt of om het effect van verschillende verbindingen op vaartuig permeabiliteit testen.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> REAGENS </td></tr><tr><td> Evans Blue </td><td> SIGMA </td><td> E2129 </td><td></td></tr><tr><td> FORMAMIDE </td><td> INVITROGEN </td><td> 15515-026 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td></td><td></td><td> 0,2 M fosfaat 1,5 M NaCl pH 7,4 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> APPARATUUR </td></tr><tr><td> SPECTROFOTOMETER </td><td> EPPENDORF </td><td> 952000006 </td><td></td></tr><tr><td> MUIS veiligheidstuig </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 340012 </td><td></td></tr><tr><td> SPUIT </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> NEEDLES </td><td> BD </td><td> 305106 </td><td> De dikte van de naald afhankelijk van de grootte van het dier. </td></tr><tr><td> BALANCE </td><td> DENVER INSTRUMENT </td><td> TP-64 </td><td></td></tr></tbody></table>

een<em&gt; in vivo</em&gt; assay naar blood vessel permeabiliteit test

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

Deze methode is gebaseerd op de intraveneuze injectie van Evans Blue in muizen als proefdier model. Evans blauw is een kleurstof die bindt albumine. Onder fysiologische omstandigheden het endotheel is ondoordringbaar voor albumine, zodat Evans blauw gebonden aan albumine blijft beperkt binnen de bloedvaten. Onder pathologische omstandigheden die verhoogde vasculaire permeabiliteit endotheelcellen via gedeeltelijk verliezen hun nauwe contacten en het endotheel permeabel voor kleine eiwitten zoals albumine. Deze voorwaarde maakt extravasatie van Evans Blue in weefsels. Een gezonde endotheel voorkomt uitstorting van de kleurstof in de naburige gevasculariseerde weefsels. Organen met een verhoogde permeabiliteit zal aanzienlijk toegenomen blauwe kleur ten opzichte van organen met intacte endotheel. Het niveau van vasculaire permeabiliteit kan worden vastgesteld door eenvoudige visualisatie of kwantitatieve meting van de kleurstof opgenomen per milligram weefsel van proefdieren versus controle / weefsel. Twee powerful aspecten van deze assay zijn eenvoud en kwantitatieve kenmerken. Evans Blue kleurstof kan worden geëxtraheerd uit weefsels door het incuberen van een bepaalde hoeveelheid weefsel in formamide. Evans Blue absorptiemaximum is bij 620 nm en absorptie minimum is 740 nm. Door een standaardcurve voor Evans Blue, kunnen optische densiteitsmetingen worden omgezet in milligram kleurstof per gevangen milligram weefsel. Statistische analyse worden gebruikt om significante verschillen in vasculaire permeabiliteit beoordelen.

We gebruikten een in vivo assay permeabiliteit naar vat lekken testen in muizen 8-12 weken oud. Deze test is nuttig in het relatieve vasculaire permeabiliteit tussen dieren van verschillende genetische achtergrond of in een stam van muizen blootgesteld aan behandelingen die het vaatstelsel beïnvloeden. Onze resultaten tonen aan dat een stam van genetisch gemodificeerde muizen hebben we in ons laboratorium een ​​permeabel endotheel in vergelijking met wild-type muizen. Deze veranderingen zijn duidelijk op macros...

Wij presenteren een<em&gt; In vivo</em&gt; Assay om bloedvat permeabiliteit testen. Deze assay is gebaseerd op intraveneuze injectie van een kleurstof en daaropvolgende visualisatie van de diffusie in interstitiële ruimtes.

Een<em&gt; In vivo</em&gt; Assay naar Blood Vessel Permeabiliteit Test

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Deze video presenteert een in vivo assay om de permeabiliteit van bloedvaten te testen. Bij muizen bekleden endotheelcellen de bloedvaten en vormen zij een semi-permeabele barrière. Onder fysiologische omstandigheden is het endotheel impermeabel voor de meeste eiwitten, waardoor deze beperkt blijven tot de bloedstroom.Bij pathologische aandoeningen die leiden tot een verhoogde vasculaire permeabiliteit, verliezen endotheelcellen gedeeltelijk het contact met elkaar. Het endotheel wordt hierdoor permeabel voor kleine eiwitten zoals albumine. In deze assay injecteren we intraveneus een blauwe kleurstof die bindt aan albumine onder omstandigheden van verhoogde endotheelpermeabiliteit.De D steekt door de endotheelbarrière en diffundeert in de interstitiële ruimte. Dit resulteert uiteindelijk in een blauwachtige verkleuring van het aangetaste weefsel voordat het experiment wordt gestart. Bereid alle benodigde materialen, pipetten en steriele tips voor.Evans blue, steriele spatel, steriele PBS, steriele spuit en naalden. Muizen, muizenfixeerder, dissectie-instrumenten, dissectieplank en spelden. Analytische balans, warmteblok voor waterbad op 55 Celsius degree.Weeg met een C.Vet spectrofo

an-in-vivo-assay-to-test-blood-vessel-permeability

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video describes a permeability assay to evaluate the permeability of in vitro blood-brain barrier using sodium fluorescein molecules.

Blood-Brain Barrier Mimic Permeability Assay: An In Vitro Assay to Assess the Permeability of BBB Mimic to Tracer Molecules

We presenteren een protocol voor humane endotheliale pericyte-interacties in muizen te bestuderen onder toepassing van een variatie van de matrix gel plug angiogenese assay.

In vivo studie van humane endotheliale-pericyte Interaction Met behulp van de Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Het behoud van de bloeddrukbarriere dekking is de sleutel voor de homeostase van het centrale zenuwstelsel. Dit protocol beschrijft in vitro technieken om de fundamentele en pathologische processen te definiëren die de bloeddrukbeperking moduleren.

In Vitro- analyses voor het beoordelen van bloed-hersenbarrière Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Twee methoden worden hier voorgesteld om te bepalen van intestinale barrièrefunctie. Een epitheliale meter (volt/ohm) wordt gebruikt voor metingen van de elektrische weerstand van de transepithelial van gekweekte epithelen rechtstreeks in weefselkweek wells. Bij muizen, wordt de FITC-dextran maagsonde methode gebruikt om te bepalen de intestinale permeabiliteit in vivo.

In Vitro en In Vivo benaderingen te bepalen van intestinale epitheliale cel permeabiliteit

Hier presenteren we een muis hersenen vasculaire permeabiliteit assay gebruik intraperitoneale injectie van fluorescerende traceurs gevolgd door perfusie die gelden voor dierlijke modellen van de bloed - hersenbarrière dysfunctie. Een hemi-hersenen wordt gebruikt voor het beoordelen van permeabiliteit kwantitatief en anderzijds voor tracer visualisatie/immunokleuring. De procedure duurt 5-6 h voor 10 muizen.

Een In Vivo bloed - hersenbarrière permeabiliteit Assay in muizen met behulp van Fluorescently label Tracers

Hier presenteren we een protocol voor het meten van de vasculaire lekkage geïnduceerd door intradermale toediening van permeabiliteit bevordering van agenten in de lymfkliertest huid. Deze techniek kan worden gebruikt om de mogelijkheid van moleculen te bevorderen of belemmeren van vasculaire lekkage of te bestuderen van de moleculaire mechanismen die vasculaire permeabiliteit regelen bepalen.

Beoordelende vasculaire Hyperpermeability-inducerende stoffen in de huid met de Miles-test

De toegang van voedingsstoffen, microbiota metabolieten en medicijnen voor het verkeer wordt geregeld door de darm-bloed-barrière (GBB). Beschrijven we een directe methode voor het meten van de GBB permeabiliteit in vivo, die, in tegenstelling tot veelgebruikte indirecte methoden, wordt vrijwel niet beïnvloed door de functies van lever en nieren.

Een In Vivo -methode voor het uitrekenen van de Gut-bloed barrière en lever metabolisme van Microbiota producten

We beschrijven twee methoden voor het beoordelen van voorbijgaande vasculaire permeabiliteit geassocieerd met tumor micro omgeving van metastasen (tmem) deuropening functie en kankercel intravasatie met behulp van intraveneuze injectie van hoog-moleculair gewicht (155 kDa) dextran bij muizen. De methoden omvatten intravital beeldvorming in levende dieren en vaste weefsel analyse met behulp van immunofluorescentie.

Beoordeling van tumor Microenvironment van metastasen doorway-gemedieerde vasculaire permeabiliteit geassocieerd met kanker cel verspreiding met behulp van Intravital beeldvorming en vaste weefsel analyse

Dit protocol illustreert een in vitro endotheelceltranscytosetest als een model om de permeabiliteit van de binnenste bloed-retinale barrière te evalueren door het vermogen van menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen te meten om mierikswortelperoxidase over cellen te transporteren in caveolae-gemedieerde transcellulaire transportprocessen.

Endotheelceltranscytosetest als een in vitro model om de permeabiliteit van de binnenste bloed-retinale barrière te evalueren

In dit protocol werd de endotheelbarrièrefunctie van de submandibulaire klier (SMG) geëvalueerd door verschillende moleculair gewogen fluorescerende tracers in vivo in de hoekaders van proefdiermodellen te injecteren onder een laserscanmicroscoop met twee fotonen.

In vivo Vasculaire permeabiliteitsdetectie bij submandibulaire klier van muizen

De hier gepresenteerde methode kan het effect van reagentia op angiogenese of vasculaire permeabiliteit in vivo evalueren zonder kleuring. De methode maakt gebruik van dextran-FITC-injectie via de staartader om neovaten of vasculaire lekkage te visualiseren.

Gemodificeerde In Vivo Matrix Gel Plug Assay voor Angiogenesestudies

Leer een in vivo assay voor bloedvatdoorlaatbaarheid met blauwe kleurstof die aan albumine bindt in muizen. Deze methode helpt onderzoekers endotheliale integriteit en vasculaire ziekten bestuderen.

Een

Meer video's verkennen