Staphylococcus aureus Growth met humaan hemoglobine als een ijzerbron

Dit experiment test de mogelijkheid van staphylococcus aureus om menselijk hemoglobine te gebruiken als enige ijzerbron. Eerst isoleer rode bloedcellen uit vers menselijk bloed. Zuiver het hemoglobine door middel van hoogwaardige vloeistofchromatografie om de integriteit van hemoglobine te waarborgen.

Voeg nu hemoglobine toe aan ijzergedepleteerd medium om het ijzer in de vorm van hemoglobine in het volgende medium te leveren. S reus. In de aanwezigheid van hemoglobine en meet zijn vermogen om hemoglobine als ijzerbron te gebruiken.

De resultaten tonen aan dat as reus zich vermenigvuldigt in de aanwezigheid van hemoglobine als enige ijzerbron. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van microbiologie, zoals of een pathogeen gastheereiseiwitten kan gebruiken als ijzerbronnen, en welke mechanismen vereist zijn om ijzer via dit proces te gebruiken. Dus deze methode kan inzicht geven in de ijzeropname van staph reus uit hemoglobine.

Het kan ook worden toegepast op de studies van andere bacteriën en hoe ze ijzerhoudende eiwitten uit de gastheer gebruiken. Het demonstreren van deze techniek zal worden uitgevoerd door GLA Ani en Catherine Haley uit mijn laboratorium. Eerst, verkrijg vers geïsoleerd menselijk bloed, aangevuld met een anticoagulans en bewaar het bij vier graden Celsius gedurende de hele zuivering. Pel de rode bloedcellen door centrifugatie gedurende 20 minuten bij 15.000 Gs. Aspireer voorzichtig de snat en resuspendeer voorzichtig de pellet in ijskoud 0,9% natriumchlorideoplossing Na drie wasbeurten, resuspendeer de pellet in één volume ijskoud 10 millimolair triss, HCL om de RBC's te lytiseren door osmotische druk.

Voeg vervolgens tolueen toe tot 20% eindvolume en incubeer gedurende een nacht op vier graden Celsius op een rotator. Centrifugeer vervolgens het lysaat bij 20.000 Gs gedurende één uur.

Verzamel de middelste hemolysaatfractie, laat de bovenste tolueenlaag en de pellet ongestoord. Laat het hemolysaat door een 0,44 micrometer spuitfilter lopen. Als de oplossing deeltjes bevat en niet door het filter kan worden gehaald, herhaal de hogesnelheidscentrifugering.

Zuiver vervolgens het hemoglobine met een hoogwaardige vloeistofchromatografie anionenuitwisselingskolom. Gebruik een mobiele fase A van 10 millimolair tris, HCL en een mobiele fase B van 10 millimolair tris, HCL plus 0,5 molair natriumchloride. Voer een 0% tot 100% gradiënt van oplosmiddel B uit over twee minuten bij een stroomsnelheid van twee milliliter per minuut.

Bewaak de elutie op basis van absorptie bij 410 nanometer en 280 nanometer. Verzamel de fractie die wordt gekenmerkt door een heldere rode kleur en een prominent absorptiepiek. Dialyseer de elutie gedurende ongeveer 16 uur tegen fosfaatgebufferde zoutoplossing.

Om het monster te steriliseren, laat het door een 0,22 micrometer spuitfilter lopen voor het bepalen van de hemoglobineconcentratie. Bereid HP-standaardoplosingen in PBS. Meng nu de standaardoplosingen of monsters oplossingen met twee xra kins-reagens in een verhouding van één op één in 96-wellplaten. Na een incubatie van 15 minuten meet de absorptie bij 540 nanometer.

Plot een standaardcurve en bepaal de HP-concentratie van de monsters vijf tot 15 milligram per milliliter. Opbrengsten zijn typische uitloopaliquots van 15 tot 20 microgram gezuiverd hemoglobinemonster op twee 15%STS-paginagels. Kleur een van de gels en breng de eiwitten van een andere gel over op een nitrocellulosemembraan voor immunoblot voor hemoglobine. Vries en bewaar een milliliter aliquots van het geïsoleerde hemoglobine in vloeibare stikstof van een bevroren voorraad. Streek S aureus op triptych, soja-agar en incubeer gedurende 20 tot 24 uur bij 37 graden Celsius.

Inoculeer enkele kolonies in vijf milliliter RPMI met E-D-D-H-A en kweek bij 37 graden Celsius met schommelen bij 180 RP M gedurende een nacht. Pel de bacteriën door centrifugatie gedurende vijf minuten bij 7.500 Gs. Resuspendeer vervolgens de bacteriën in RPMI met 0,5 millimolair E-D-D-H-A en normaliseer tot een OD 600 van ongeveer drie. Bereid vervolgens N-R-P-M-I met 2,5 microgram per milliliter HB en 0,1 tot één millimolair E-D-D-H-A om het vrije ijzer te cheleren.

Subcultiveer nu 10 microliter bacteriesuspensie in één milliliter N-R-P-M-I plus E-D-D-H-A plus HP. Incubeer de culturen gedurende maximaal 48 uur bij 37 graden Celsius met schommelen bij 180 RRP M om de zes tot 12 uur. Verwijder 50 microliter van de cultuurmix met 150 microliter PBS in 96-wellplaten en neem OD 600-metingen. In deze HPLC-zuivering van humaan hemoglobine uit hemolysaat wordt de absorptie van eluaat bij 280 en 410 nanometer golflengten gemeten met fractie vijf die het hemoglobine bevat.

Typisch worden opbrengsten van vijf tot 15 milligram hemoglobine per milliliter verkregen per bereiding. Het gezuiverde hemoglobine werd geanalyseerd door SDS-pagina in duplicaat en de gels werden ofwel gekleurd voor eiwitten of overgebracht naar nitrocellulose en geïmmunoblot. Vervolgens werd het gezuiverde menselijke hemoglobine getest op het vermogen om de groei van wild type asus en ASUS te ondersteunen, die het hemoglobinereceptor mist die vereist is voor hemoglobine-afgeleide ijzeropname.

De toename in optische dichtheid van de culturen in de loop van de tijd geeft aan dat in N-R-P-M-I plus E-D-D-H-A plus hb de wild type ASUS zich vermenigvuldigt, maar de mutant dat niet doet. In tegenstelling, het vermogen om aangevuld vrij ijzer te gebruiken is identiek in zowel wild type als mutante stammen, geen van beide vermenigvuldigt zich in de afwezigheid van een bron. In deze vergelijking van media aangevuld met hemoglobine gezuiverd uit vers bloed of gelyofiliseerd hemoglobine, vereist het gezuiverde hemoglobine uit bloed ISDB voor groei.

Terwijl gelyofiliseerd hemoglobine proliferatie van de ISDB-mutant mogelijk maakt, kan een goede