Name: Staphylococcus aureus Growth met humaan hemoglobine als een ijzerbron (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Leer hoe Staphylococcus aureus menselijk hemoglobine gebruikt als ijzerbron voor groei. Deze groeiassay identificeert bacteriële factoren betrokken bij ijzeropname uit hemoglobine.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door US Public Health Service subsidies AI69233 en AI073843 van het Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten. EPS is een Burroughs Wellcome Fellow in de pathogenese van infectieziekten. KPH werd gefinancierd door de Cellulaire en Moleculaire Microbiologie Training subsidie ​​Programma 5 T32 A107611-10.

1. Zuivering van Hemoglobine van Fresh Blood <ol><li> De verwerving van nieuwe menselijk bloed aangevuld met een antistollingsmiddel. Houden bloed op ijs of bij 4 ° C gedurende de zuivering. </li><li> Centrifugeer bloed gedurende 20 min bij 1500 x g. De rode bloedcellen (RBC&#39;s) zullen op de bodem van de buis. Zorgvuldig aspireren de supernatant en resuspendeer de pellet voorzichtig in ijskoude 0,9% (w / v) NaCl-oplossing. Centrifugeer nogmaals en was 3 keer. </li><li> Resuspendeer de pellet in 1 volume ijskoude 10 mM Tris-HCl (pH 8,0). Dit zal tot lysis van de rode bloedcellen door osmotische druk. Toevoegen tolueen ~ 20% eindvolume. </li><li> Incubeer bij 4 ° C op een rotisserie nacht. </li><li> Centrifugeer het lysaat bij 20.000 xg gedurende 1 uur. Verzamel de middelste hemolysaat fractie verlaten van de tolueen (drijvend op de top) en pellet onaangeroerd. Gebruik lange hals pipet om de middenfractie verzamelen. </li><li> Ga door 0,44 micrometer spuitfilter. Als de oplossing deeltjes bevatmaterie en niet door het filter Herhaal stap 1.5. </li><li> Zuiver hemoglobine (Hb) met een high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) anionuitwisselingskolom (Varian, PL-SAX 1000 Å 8 um, 150 mm x 4,6 mm). De mobiele fase A 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) en mobiele fase B is 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 0,5 M NaCl. A 0% -100% gradiënt van solvent B wordt geleid over 2 minuten bij 2,0 ml / min debiet. De elutie wordt gecontroleerd op absorptie (λ: 410 nm en 280 nm). Verzamelen alleen de fractie gekenmerkt door een helderrode kleur en een prominente absorptiepiek (figuur 1). </li><li> Dialyseer de elutie tegen fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende een nacht en vervolgens een paar uur weer. Steriliseer door passage door een 0,22 urn spuitfilter. </li><li> Om Hb concentratie meten standaardformulieren Hb oplossingen met bekende concentraties in PBS. Bepaal de concentratie van Hb in het monster door het mengen van de standaardoplossingen (zie de tabel met reagentia onsed) of de monsteroplossing met reagens 2x Drabkin&#39;s (bereid uit poeder) in een verhouding van 1:1. Bijvoorbeeld mix 100 ul Hb oplossing reagens 100 ul 2x Drabkin&#39;s in 96-well platen. Incubeer gedurende 15 min en meet de absorptie bij 540 nm. Teken een standaardcurve en bepaal de Hb-gehalte in het monster. Vijf tot vijftien mg / ml opbrengsten kenmerkend. </li><li> Run 15-20 ug gezuiverd hemoglobine op een 15% SDS-PAGE in tweevoud. Vlek een van de gels; dragen de eiwitten van andere gel op een nitrocellulosemembraan en immunoblot voor hemoglobine (figuur 2). </li><li> Invriezen en opslaan 1 ml porties van hemoglobine in vloeibare stikstof. </li></ol> 2. Voorbereiding van Iron-afbrekende Groei Media <ol><li> Bereid Roswell Park Memorial Institute (RPMI) bouillon door oplossen van het poeder in RPMI water, voeg natriumbicarbonaat zoals aanbevolen door de fabrikant en 1% cassamino zuren (CA) (w / v). Steriliseer die door een 0,2 urn filter en opslag koelkastnereerd. </li><li> Bereid metaal verarmde RPMI (NRPMI) door toevoeging van 7% (w / v) Chelex 100 en overnacht mengen op een roerplaat. Verwijderen Chelex 100 door passage door een 0,2 um filter en gekoeld bewaren. Supplement media met essentiële niet-ijzermetalen: 25 uM ZnCl2, 25 uM MnCl2, 100 mM CaCl2 en 1 mM MgCl2 voorbereid als een steriele 1000 x oplossing. Gebruik wegwerp plastic containers voor deze stap om ijzercontaminatie van herbruikbare supplies te voorkomen. </li></ol> 3. Staphylococcus aureus met hemoglobine als enige ijzerbron <ol><li> Streak S. aureus voor isolatie op tryptische soja-agar (TSA) van een bevroren voorraad. Incubeer bij 37 ° C gedurende 20-24 uur. </li><li> Resuspendeer ethyleendiamine-N, N&#39;-bis (2-hydroxyfenylazijnzuur) (EDDHA) in watervrije ethanol tot 100 mM. EDDHA niet in oplossing gaan, maar wordt gesteriliseerd door ethanol. </li><li> Toevoegen EDDHA aan RPMI tot een eindconcentratie van 0,5 mM. ToelatenEDDHA te ontbinden gedurende ten minste 30 min alvorens de volgende stap. Door batch-to-batch variatie kan uiteindelijke concentratie EDDHA moeten worden verlaagd tot 0,25 mm om bacteriële groei mogelijk te maken. </li><li> Inoculeer enkele kolonies van S. aureus in 5 ml RPMI met EDDHA in 15 ml schroefdop conische buizen. Incubeer bij 37 ° C onder schudden bij 180 omwentelingen per minuut (rpm) gedurende 16-20 uur. </li><li> Centrifugeer het &#39;s nachts culturen gedurende 5 min bij 7500 xg en resuspendeer de pellet in NRPMI die 0,5 mM EDDHA. Normaliseren OD 600 tot ~ 3. </li><li> Bereid NRPMI die 2,5 ug per ml en 0,1-1,0 mM Hb EDDHA. Door variatie tussen de batches kan de EDDHA concentratie vereist om vrije ijzerchelaat in NRPMI variëren. </li><li> Subcultuur 10 pi bacteriesuspensie uit stap 3.5 tot 1 ml NRPMI + + EDDHA Hb in een 15 ml met schroefdop conische buis. </li><li> Incubeer de culturen bij 37 ° C gedurende 48 uur onder schudden bij 180 rpm of een rollende trommel. </li><li&gt; elke 6-12 uur nemen OD 600 metingen door verwijderen van 50 ul van de cultuur en mengen met 150 pi PBS in 96-well platen. </li></ol>

<ol><li>Mazmanian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+of+heme-iron+across+the+envelope+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus.</a> Science. 299, 906-909 (2003).</li>
<li>Pishchany, G., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+for+blood%3A+hemoglobin+as+a+nutrient+source+for+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Taste for blood: hemoglobin as a nutrient source for pathogens.</a> PLOS Pathogens. 8, e1002535(2012).</li>
<li>Haley, K. P., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+battle+for+iron%3A+host+sequestration+and+Staphylococcus+aureus+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+infection.+Institut+Pasteur%22%5BJournal%5D)">A battle for iron: host sequestration and Staphylococcus aureus acquisition.</a> Microbes and infection. Institut Pasteur. 14, 217-227 (2012).</li>
<li>Krishna Kumar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+hemoglobin+capture+by+Staphylococcus+aureus+cell-surface+protein%5BTitle%5D)+AND+%22IsdH.+The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Structural basis for hemoglobin capture by Staphylococcus aureus cell-surface protein.</a> IsdH. The Journal of biological chemistry. 286, 38439-38447 (2011).</li>
<li>Grigg, J. C., Mao, C. X., Murphy, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron-coordinating+tyrosine+is+a+key+determinant+of+NEAT+domain+heme+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Iron-coordinating tyrosine is a key determinant of NEAT domain heme transfer.</a> Journal of Molecular Biology. 413, 684-698 (2011).</li>
<li>Villareal, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+weak+protein-protein+complexes+transfer+heme+across+the+cell+wall+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Transient weak protein-protein complexes transfer heme across the cell wall of Staphylococcus aureus.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 14176-14179 (2011).</li>
<li>Muryoi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+the+iron-regulated+surface+determinant+%28Isd%29+heme+transfer+pathway+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Demonstration of the iron-regulated surface determinant (Isd) heme transfer pathway in Staphylococcus aureus.</a> J. Biol. Chem. 283, 28125-28136 (2008).</li>
<li>Reniere, M. L., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+haem+oxygenases+are+differentially+regulated+by+iron+and+haem%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus haem oxygenases are differentially regulated by iron and haem.</a> Mol. Microbiol. 69, 1304-1315 (2008).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+hemin+transfer+from+IsdA+to+IsdC+in+the+iron-regulated+surface+determinant+%28Isd%29+heme+acquisition+system+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct hemin transfer from IsdA to IsdC in the iron-regulated surface determinant (Isd) heme acquisition system of Staphylococcus aureus.</a> J. Biol. Chem. 283, 6668-6676 (2008).</li>
<li>Pishchany, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+for+human+hemoglobin+enhances+Staphylococcus+aureus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection.</a> Cell Host Microbe. 8, 544-550 (2010).</li>
<li>Pishchany, G., Dickey, S. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+the+Staphylococcus+aureus+heme+iron+transport+components+IsdA+and+IsdB%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of the Staphylococcus aureus heme iron transport components IsdA and IsdB.</a> Infect. Immun. 77, 2624-2634 (2009).</li>
<li>Torres, V. J., Pishchany, G., Humayun, M., Schneewind, O., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+IsdB+is+a+hemoglobin+receptor+required+for+heme+iron+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization.</a> J. Bacteriol. 188, 8421-8429 (2006).</li>
<li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IsdA+and+IsdB+antibodies+protect+mice+against+Staphylococcus+aureus+abscess+formation+and+lethal+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">IsdA and IsdB antibodies protect mice against Staphylococcus aureus abscess formation and lethal challenge.</a> Vaccine. 28, 6382-6392 (2010).</li>
<li>Cheng, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+requirements+for+Staphylococcus+aureus+abscess+formation+and+persistence+in+host+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Genetic requirements for Staphylococcus aureus abscess formation and persistence in host tissues.</a> Faseb J. 23, 3393-3404 (2009).</li>
<li>Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G. L., Thornton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+ions+in+biological+catalysis%3A+from+enzyme+databases+to+general+principles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Inorg.+Chem%22%5BJournal%5D)">Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles.</a> J. Biol. Inorg. Chem. 13, 1205-1218 (2008).</li>
<li>Weinberg, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+availability+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Iron availability and infection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790, 600-605 (2009).</li>
<li>Drabkin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+the+Hemin+Chromoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Metabolism of the Hemin Chromoproteins.</a> Physiological Reviews. 31, 345-431 (1951).</li>
<li>Graversen, J. H., Madsen, M., Moestrup, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD163%3A+a+signal+receptor+scavenging+haptoglobin-hemoglobin+complexes+from+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">CD163: a signal receptor scavenging haptoglobin-hemoglobin complexes from plasma.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 34, 309-314 (2002).</li>
<li>Torres, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+Fur+regulates+the+expression+of+virulence+factors+that+contribute+to+the+pathogenesis+of+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus Fur regulates the expression of virulence factors that contribute to the pathogenesis of pneumonia.</a> Infect. Immun. 78, 1618-1628 (2010).</li>
<li>Hammer, N. D., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+of+Staphylococcus+aureus+Iron+Acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms of Staphylococcus aureus Iron Acquisition.</a> Annu. Rev. Microbiol. , (2011).</li>
<li>Hurd, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iron-regulated+surface+proteins+IsdA%2C+IsdB%2C+and+IsdH+are+not+required+for+heme+iron+utilization+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Fems.+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">The iron-regulated surface proteins IsdA, IsdB, and IsdH are not required for heme iron utilization in Staphylococcus aureus.</a> Fems. Microbiology Letters. 329, 93-100 (2012).</li>
<li>Boys, B. L., Kuprowski, M. C., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetric+behavior+of+hemoglobin+alpha-+and+beta-+subunits+during+acid-induced+denaturation+observed+by+electrospray+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Symmetric behavior of hemoglobin alpha- and beta- subunits during acid-induced denaturation observed by electrospray mass spectrometry.</a> Biochemistry. 46, 10675-10684 (2007).</li>
<li>Williams, R. C. Jr, Tsay, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+convenient+chromatographic+method+for+the+preparation+of+human+hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A convenient chromatographic method for the preparation of human hemoglobin.</a> Analytical Biochemistry. 54, 137-145 (1973).</li>
<li>Shen, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+unmodified+human+adult+hemoglobin+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Production of unmodified human adult hemoglobin in Escherichia coli.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 8108-8112 (1993).</li>
<li>Manjula, B. N., Acharya, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+molecular+analysis+of+hemoglobin+by+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Purification and molecular analysis of hemoglobin by high-performance liquid chromatography.</a> Methods Mol. Med. 82, 31-47 (2003).</li>
<li>Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+envelope+proteins+related+to+iron%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbial envelope proteins related to iron.</a> Annual review of microbiology. 36, 285-309 (1982).</li>
<li>Chart, H., Buck, M., Stevenson, P., Griffiths, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+regulated+outer+membrane+proteins+of+Escherichia+coli%3A+variations+in+expression+due+to+the+chelator+used+to+restrict+the+availability+of+iron%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Iron regulated outer membrane proteins of Escherichia coli: variations in expression due to the chelator used to restrict the availability of iron.</a> Journal of General Microbiology. 132, 1373-1378 (1986).</li>
<li>Rogers, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron-Binding+Catechols+and+Virulence+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Iron-Binding Catechols and Virulence in Escherichia coli.</a> Infection and Immunity. 7, 445-456 (1973).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

IJzer is een essentiële voedingsstof die door organismen van alle koninkrijken van het leven 15. In gewervelde dieren, is ijzer afgezonderd om toxiciteit veroorzaakt door dit element te voorkomen. Deze opslag verbergt ook ijzer van microben in een proces dat bekend staat als nutritionele immuniteit 16. In reactie hierop hebben ziekteverwekkers geëvolueerd strategieën die voedingswaarde immuniteit te omzeilen. Een dergelijk mechanisme is gebaseerd op hemoglobine, de meest voorkomende bron van ijzer ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Materiaal </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> HPLC-anionenwisselaar </td><td> Varian </td><td> PL1551-3802 </td><td></td></tr><tr><td> Drabkin&#39;s reagens </td><td> Sigma </td><td> D5941-6VL </td><td></td></tr><tr><td> Hemoglobine standaard </td><td> Pointe Scientific </td><td> H7506-STD </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> HyClone </td><td> SH30011.02 </td><td></td></tr><tr><td> Chelex 100 natriumvorm </td><td> Sigma </td><td> C7901 </td><td></td></tr><tr><td> EDDHA </td><td> LGC Standards GmbH </td><td> ANC 001 </td><td></td></tr><tr><td> Hemoglobine een antilichaam </td><td> Santa Cruz Biotechnology, Inc </td><td> SC-21005 </td><td> &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Tryptisch soja agar </td><td> BD </td><td> 236920 </td><td></td></tr></tbody></table>

staphylococcus aureus growth met humaan hemoglobine als een ijzerbron

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

S. aureus is een pathogene bacterie die vereist ijzer uitvoeren vitale metabole functies en ziekte veroorzaken. De meest voorkomende reservoir van ijzer in de menselijke gastheer is heem, de cofactor van hemoglobine. Om ijzer te nemen van hemoglobine, S. aureus maakt gebruik van een uitgebreid systeem dat bekend staat als het ijzer-gereguleerde oppervlak determinant (ISD)-systeem 1. Onderdelen van de Isd systeem eerst binden gastheer hemoglobine, dan halen en importeren heem, en tenslotte ijzer te bevrijden van heem in het bacteriële cytoplasma 2,3. Deze route is ontleed door tal van in vitro studies 4-9. Verder is de bijdrage van de ISD-systeem om infecties al herhaaldelijk aangetoond in muismodellen 8,10-14. Tot vaststelling van de bijdrage van de ISD-systeem aan hemoglobine-afgeleide ijzer acquisitie en de groei heeft bewezen meer uitdagend. Groei assays met hemoglobine als enige ijzerbron ingewikkeld by de instabiliteit van commercieel beschikbare hemoglobine, verontreinigende vrij ijzer in het groeimedium en toxiciteit van ijzerchelatoren. Hier wordt een methode die deze beperkingen overwinnen. Hoogwaardige hemoglobine wordt bereid uit vers bloed en opgeslagen in vloeibare stikstof. Gezuiverd hemoglobine wordt aangevuld in ijzer-afbrekende medium nabootsen van de ijzer-arme omgeving waarmee ziekteverwekkers in de gewervelde gastheer. Door honger S. aureus vrij ijzer en aangevuld met een minimaal gemanipuleerde vorm van hemoglobine we groei te induceren op een wijze die volledig afhankelijk is van het vermogen om hemoglobine binden, extract heem passeren heem door de bacteriële cel envelop en afgebroken heem in het cytoplasma. Deze test zal nuttig zijn voor onderzoekers die aan de mechanismen van hemoglobin-/heme-derived ijzer acquisitie toe te lichten in S. aureus en eventueel andere bacteriële pathogenen.

We hebben gezuiverd humaan hemoglobine uit hemolysaat met HPLC (Protocol stap 1.7). Figuur 1 toont opgenomen absorptie van het eluaat bij 280 en 410 nm golflengte. Fractie 5 werd verzameld en andere fracties werden weggegooid. Opbrengsten van vijf tot vijftien milligram per milliliter hemoglobine eluaat worden meestal verkregen. Gezuiverd hemoglobine werd geanalyseerd door SDS-PAGE in tweevoud werden de gelen ofwel gekleurd eiwitten of overgebracht op nitrocellulose en immunoblotting (Protocol stap 1,10...

Hier beschrijven we een test voor groei<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Met hemoglobine als de enige bron van beschikbare voedingsstoffen ijzer. Deze test wordt de rol van bacteriële factoren betrokken bij hemoglobine-afgeleide ijzer aankoop.

Staphylococcus aureus Growth met humaan hemoglobine als een ijzerbron

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Dit experiment test de mogelijkheid van staphylococcus aureus om menselijk hemoglobine te gebruiken als enige ijzerbron. Eerst isoleer rode bloedcellen uit vers menselijk bloed. Zuiver het hemoglobine door middel van hoogwaardige vloeistofchromatografie om de integriteit van hemoglobine te waarborgen.Voeg nu hemoglobine toe aan ijzergedepleteerd medium om het ijzer in de vorm van hemoglobine in het volgende medium te leveren. S reus. In de aanwezigheid van hemoglobine en meet zijn vermogen om hemoglobine als ijzerbron te gebruiken.De resultaten tonen aan dat as reus zich vermenigvuldigt in de aanwezigheid van hemoglobine als enige ijzerbron. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van microbiologie, zoals of een pathogeen gastheereiseiwitten kan gebruiken als ijzerbronnen, en welke mechanismen vereist zijn om ijzer via dit proces te gebruiken. Dus deze methode kan inzicht geven in de ijzeropname van staph reus uit hemoglobine.Het kan ook worden toegepast op de studies van andere bacteriën en hoe ze ijzerhoudende eiwitten uit de gastheer gebruiken. Het demonstreren van deze techniek zal worden uitgevoerd door GLA Ani en Catherine Haley uit mijn laboratorium. Eerst, verkrijg vers geïsoleerd menselijk bloed, aangevuld met een anticoagulans en bewaar het bij vier graden Celsius gedurende de hele zuivering. Pel de rode bloedcellen door centrifugatie gedurende 20 minuten bij 15.000 Gs. Aspireer voorzichtig de snat en resuspendeer voorzichtig de pellet in ijskoud 0,9% natriumchlorideoplossing Na drie wasbeurten, resuspendeer de pellet in één volume ijskoud 10 millimolair triss, HCL om de RBC's te lytiseren door osmotische druk.Voeg vervolgens tolueen toe tot 20% eindvolume en incubeer gedurende een nacht op vier graden Celsius op een rotator. Centrifugeer vervolgens het lysaat bij 20.000 Gs gedurende één uur.Verzamel de middelste hemolysaatfractie, laat de bovenste tolueenlaag en de pellet ongestoord. Laat het hemolysaat door een 0,44 micrometer spuitfilter lopen. Als de oplossing deeltjes bevat en niet door het filter kan worden gehaald, herhaal de hogesnelheidscentrifugering.Zuiver vervolgens het hemoglobine met een hoogwaardige vloeistofchromatografie anionenuitwisselingskolom. Gebruik een mobiele fase A van 10 millimolair tris, HCL en een mobiele fase B van 10 millimolair tris, HCL plus 0,5 molair natriumchloride. Voer een 0% tot 100% gradiënt van oplosmiddel B uit over twee minuten bij een stroomsnelheid van twee milliliter per minuut.Bewaak de elutie op basis van absorptie bij 410 nanometer en 280 nanometer. Verzamel de fractie die wordt gekenmerkt door een heldere rode kleur en een prominent absorptiepiek. Dialyseer de elutie gedurende ongeveer 16 uur tegen fosfaatgebufferde zoutoplossing.Om het monster te steriliseren, laat het door een 0,22 micrometer spuitfilter lopen voor het bepalen van de hemoglobineconcentratie. Bereid HP-standaardoplosingen in PBS. Meng nu de standaardoplosingen of monsters oplossingen met twee xra kins-reagens in een verhouding van één op één in 96-wellplaten. Na een incubatie van 15 minuten meet de absorptie bij 540 nanometer.Plot een standaardcurve en bepaal de HP-concentratie van de monsters vijf tot 15 milligram per milliliter. Opbrengsten zijn typische uitloopaliquots van 15 tot 20 microgram gezuiverd hemoglobinemonster op twee 15%STS-paginagels. Kleur een van de gels en breng de eiwitten van een andere gel over op een nitrocellulosemembraan voor immunoblot voor hemoglobine. Vries en bewaar een milliliter aliquots van het geïsoleerde hemoglobine in vloeibare stikstof van een bevroren voorraad. Streek S aureus op triptych, soja-agar en incubeer gedurende 20 tot 24 uur bij 37 graden Celsius.Inoculeer enkele kolonies in vijf milliliter RPMI met E-D-D-H-A en kweek bij 37 graden Celsius met schommelen bij 180 RP M gedurende een nacht. Pel de bacteriën door centrifugatie gedurende vijf minuten bij 7.500 Gs. Resuspendeer vervolgens de bacteriën in RPMI met 0,5 millimolair E-D-D-H-A en normaliseer tot een OD 600 van ongeveer drie. Bereid vervolgens N-R-P-M-I met 2,5 microgram per milliliter HB en 0,1 tot één millimolair E-D-D-H-A om het vrije ijzer te cheleren.Subcultiveer nu 10 microliter bacteriesuspensie in één milliliter N-R-P-M-I plus E-D-D-H-A plus HP. Incubeer de culturen gedurende maximaal 48 uur bij 37 graden Celsius met schommelen bij 180 RRP M om de zes tot 12 uur. Verwijder 50 microliter van de cultuurmix met 150 microliter PBS in 96-wellplaten en neem OD 600-metingen. In deze HPLC-zuivering van humaan hemoglobine uit hemolysaat wordt de absorptie van eluaat bij 280 en 410 nanometer golflengten gemeten met fractie vijf die het hemoglobine bevat.Typisch worden opbrengsten van vijf tot 15 milligram hemoglobine per milliliter verkregen per bereiding. Het gezuiverde hemoglobine werd geanalyseerd door SDS-pagina in duplicaat en de gels werden ofwel gekleurd voor eiwitten of overgebracht naar nitrocellulose en geïmmunoblot. Vervolgens werd het gezuiverde menselijke hemoglobine getest op het vermogen om de groei van wild type asus en ASUS te ondersteunen, die het hemoglobinereceptor mist die vereist is voor hemoglobine-afgeleide ijzeropname.De toename in optische dichtheid van de culturen in de loop van de tijd geeft aan dat in N-R-P-M-I plus E-D-D-H-A plus hb de wild type ASUS zich vermenigvuldigt, maar de mutant dat niet doet. In tegenstelling, het vermogen om aangevuld vrij ijzer te gebruiken is identiek in zowel wild type als mutante stammen, geen van beide vermenigvuldigt zich in de afwezigheid van een bron. In deze vergelijking van media aangevuld met hemoglobine gezuiverd uit vers bloed of gelyofiliseerd hemoglobine, vereist het gezuiverde hemoglobine uit bloed ISDB voor groei.Terwijl gelyofiliseerd hemoglobine proliferatie van de ISDB-mutant mogelijk maakt, kan een goede

staphylococcus-aureus-growth-using-human-hemoglobin-as-an-iron-source

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een algemeen protocol voor de studie van de invasie van gastheercellen door een bacteriële ziekteverwekker, gericht...

Invasie van menselijke cellen door een bacteriële pathogenen

Source: Gupta, S., et al. Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the procedure for culturing Mycobacterium tuberculosis under iron-limited conditions to induce iron stress and promote the secretion of siderophores that support bacterial survival.

Culturing Mycobacterium tuberculosis Under Iron-Limited Conditions

Source: Maurakis, S., et al. Metal-Limited Growth of Neisseria gonorrhoeae for Characterization of Metal-Responsive Genes and Metal Acquisition from Host Ligands. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates a metal-limited bacterial growth assay to study the role of metal-responsive genes. Wild-type and mutant bacteria grown in metal-depleted medium are incubated with metal-ligand, and their growth is monitored using a plate reader. Under metal-depleted conditions, the wild-type bacteria...

Metal-Limited Bacterial Growth Assay to Study the Role of Metal-Responsive Genes

Source: Behera, R.K. et. al., A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the preparation of hemolytic Staphylococcus aureus cultures to standardize bacterial growth and achieve metabolic synchronization for host-pathogen interaction studies.

Preparing a Hemolytic Staphylococcus aureus Culture for Host-Pathogen Interaction Studies

In this video, we demonstrate an assay to detect the cytotoxicity of virulent and less virulent Staphylococcus aureus strains against human neutrophils following phagocytosis using flow cytometry.

Cytotoxicity Assay of Staphylococcus aureus Strains on Neutrophils following Phagocytosis

Hier beschrijven we een protocol voor extractie van metabolieten van Staphylococcus aureus en de daaropvolgende analyse via vloeistofchromatografie en massaspectrometrie.

Een vloeistofchromatografie tandem-massaspectrometrie gebaseerde benadering voor metabolietanalyse van<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Hier wordt beschreven, is een methode voor het analyseren van bacteriële genexpressie in dierlijke weefsels op een cellulair niveau. Deze methode biedt een bron voor de studie van de fenotypische verscheidenheid die zich voordoen binnen een bacteriële bevolking in antwoord op het milieu weefsel tijdens een infectie.

Een fluorescentie gebaseerde methode om te studeren van bacteriële genregulatie in geïnfecteerde weefsels

We beschrijven hier een methode voor de groei van Neisseria gonorroe in metaal-beperkte vloeibare medium om de expressie van genen voor metaalopname te vergemakkelijken. We schetsen ook downstream experimenten om het fenotype van gonokokken te karakteriseren die in deze omstandigheden worden geteeld. Deze methoden kunnen worden aangepast om geschikt te zijn voor karakterisering van metaal-responsieve genen in andere bacteriën.

Metal-Limited Groei van Neisseria gonorrhoeae voor karakterisering van metal-responsive genen en metaalacquisitie van Host Ligands

Dit protocol heeft tot doel te beschrijven hoe de mate van Staphylococcus aureus internalisatie en het vermogen om te overleven in de menselijke gastheercel kan worden bestudeerd, evenals de intracellulaire werkzaamheid van antimicrobiële verbindingen.

Verbeterde enzymbeschermingstest om staphylococcus aureus internalisatie en intracellulaire werkzaamheid van antimicrobiële verbindingen te bestuderen

In dit manuscript bieden we een uitgebreid protocol voor het beoordelen van de antibioticaoverleving voor Pseudomonas aeruginosa en Staphylococcus aureus, waarbij plasmiden worden getransformeerd in P. aeruginosa en S. aureus om reporterstammen te creëren en fenotypische varianten, zoals persisters, te visualiseren door time-lapse epifluorescentiemicroscopie.

Time-Lapse Epifluorescentiemicroscopie Beeldvorming van Pseudomonas aeruginosa en Staphylococcus aureus Heterogene fenotypes

Leer hoe Staphylococcus aureus menselijk hemoglobine gebruikt als ijzerbron voor groei. Deze groeiassay identificeert bacteriële factoren betrokken bij ijzeropname uit hemoglobine.

Staphylococcus aureus Growth met humaan hemoglobine als een ijzerbron

Meer video's verkennen