Name: Analyse van de Solvent Toegankelijkheid van cysteïneresten op Maïs rayado fino virus Virus-achtige deeltjes, geproduceerd in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking van peptiden aan VLP (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Leer hoe je de oplosmiddeltoegankelijkheid van cysteïneresten op virusachtige deeltjes analyseert en peptiden koppelt met behulp van Maïs rayado fino virus in Nicotiana benthamiana.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Virusinoculatie en VLP Zuivering van Nicotiana benthamiana Planten <ol><li> Produceren afgedekt T7-RNA transcripten van aardappelvirus X (PVX) gebaseerde vector plasmiden met MRFV wild-type (wt) en Cys-gemuteerde manteleiwit (CP) genen 12, met Ambion de T7-mMessage mMachine Kit. </li><li> Voor elke T7 transcriptie reactie inoculeren twee volgroeide bladeren van N. benthamiana met 10 ui reacties en incubeer de planten gedurende 10 dagen in de kas, bij 60% luchtvochtigheid gedurende 16 uur met licht (25.000-30.000 lux) bij 25 ° C en 8 uur donker bij 20 ° C. </li><li> Harves t N. benthamiana virus-geïnfecteerde bladeren 10 dagen na inoculatie (dpi) en weeg het plantenweefsel (50 gram) en plaats op ijs. </li><li> Homogeniseer het plantenmateriaal in een blender in aanwezigheid van 100 ml van een gekoelde oplossing van 0,5 M Na-citraat buffer, pH 5,5 (gebruik 2 ml buffer per gram plantenweefsel). </li><li> Filter homogenaat tot en met 3 lagen van cheeseclOTH en verduidelijken door centrifugeren bij 27.000 xg gedurende 30 minuten. Decanteer het supernatans in een gekoeld maatcilinder, meet het volume, en vervolgens overbrengen naar een gekoelde steriele beker. Gooi de pellet. </li><li> Verwerk de supernatant door 10% polyethyleenglycol 8000 (PEG 8000), roer 15 min bij 4 ° C en nog 45 min incuberen bij 4 ° C om het neerslaan van de virus-achtige deeltjes (VLP&#39;s) PEG-matrix. </li><li> Centrifugeer het monster bij 27.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C en verwijder het supernatant. </li><li> Verwerk de pellet door toevoegen van 8 ml 0,05 M Na-citraat buffer, pH 5,5 met 2% Triton X-100. Swirl de centrifugebuizen goed aan de pellet los te maken. Breng de pellet en buffer naar een gekoelde steriele beker. Spoel de buizen met 2 ml van dezelfde buffer en voeg toe aan het bekerglas. Roer de suspensie bij 4 ° C totdat de pellets opgelost (gewoonlijk 1 uur). </li><li> Verduidelijken door centrifugatie gedurende 5 min bij 27.000 xg, gooi de pellet en pProcess de supernatant door centrifugatie bij 140.000 g gedurende 2 uur bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer de pellet in 1 ml 0,05 M Na-citraat buffer, pH 5,5 en plaats de suspensie op een 10-40% sucrose gradiënt in 0,05 M Na-citraat buffer, pH 5,5. </li><li> Centrifugeer de gradiënt gedurende 3 uur bij 140.000 xg bij 4 ° C. </li><li> Schijnen een licht op de bovenkant van de centrifugebuis en verzamel de lichtverstrooiende bovenste band op 4 cm van de top van de buis, verdund met 0,05 M Na-citraat buffer, pH 5,5, en centrifugeer gedurende 3 uur bij 140.000 xg bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer de pellet in 0,5 ml steriel water en bewaar bij 4 ° C tot zes maanden. </li><li> Kwantificeren van de concentratie VLP uitvoeren van een Bradford-eiwittest. De opbrengst van VLP&#39;s tussen 1 en 3 ug / g plantenweefsel. </li></ol> 2. Fluoresceïne-5-maleïmide-labelingsreacties van VLP <ol><li> Bereid een 1 mM oplossing van fluoresceïne-5-maleïmide (427,37 g / mol) in 50 mM natrium Phosphate buffer, pH 7,0, 1 mM EDTA. Meng met behulp van de vortex en controleer volledig is opgelost. Bescherm de buis van licht met behulp van aluminiumfolie. </li><li> Voeg fluoresceïne-5-maleïmide te VLP geproduceerd in stap 1 en meng. Een 25-voudige molaire overmaat van fluoresceïne-5-maleïmide voor molaire hoeveelheid sulfhydryls. Algemeen met 30 pi van VLP&#39;s in een concentratie van 1 pg / pl en 60 ul van de fluoresceïne-5-maleïmide oplossing acceptabele resultaten. </li><li> Incubeer het reactiemengsel gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. </li><li> Beëindig de reactie door toevoeging van dithiothreitol (DTT) tot een eindconcentratie van 50 mM. </li><li> Verwijder niet-gereageerde fluoresceine met een ontzouten spin kolom (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) en centrifugatie gedurende 2 minuten bij 1500 xg bij kamertemperatuur. </li><li> Voor SDS-PAGE-analyse, voeg 10 ui 2 x SDS-PAGE Laemmli monsterbuffer van 10 pi van elke reactie. Sla de gelabelde eiwit beschermd tegen licht bij 4 ° C gedurende maximaal een maand ofeenmalig gebruik in aliquots bij -20 ° C maximaal 3 maanden. </li></ol> 3. Labeling reactie en bepaling van biotine Incorporation <ol><li> Gebruik ontzouten spin kolommen (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) om een ​​bufferuitwisseling voeren van water van fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7.0 van de VLP&#39;s geproduceerd in stap 1. </li><li> Bereid een 20 mM voorraadoplossing van maleimide-PEG2-biotine door toevoeging 190 pi PBS in maleïmide PEG2-biotine en mix No-wegen door en neer te pipetteren. </li><li> Voeg maleimide-PEG2-biotine om de VLP&#39;s en meng. Een 10-voudige molaire overmaat reagens voor VLP oplossingen ≤ 2 mg / ml. </li><li> Incubeer het reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 4 uur. </li><li> Verwijderen van niet-omgezet maleimide-PEG2-biotine met een ontzoutingskolom spinkolom (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) en centrifugatie gedurende 2 minuten bij 1500 xg bij kamertemperatuur. </li><li> Bepaal de mol biotine per mol VLP&#39;s met behulp van de Pierce Biotine Kwantificering Kit (Thermo Scientific) en following instructies van de fabrikant. </li></ol> 4. Verknoping van Cys 2-VLP&#39;s en F Peptide <ol><li> VLP waardoor beschikbaar cysteïneresten voor verknoping in stap 2 (Cys 2-VLP&#39;s) worden in de volgende stap. Bereid een nieuwe verknoping stock oplossing (28,63 mM) door 10 mg van NHS-PEG4-maleïmide vernetter in 680 pl dimethylsulfoxide. </li><li> Los een 17 (F)-aminozuur lang peptide (LLPNMOKDKEACAKAPL) in 50 ul van conjugatie buffer (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) bij een concentratie van 0,1 mM. </li><li> Voeg 4 pi vernettingsmiddel tot 50 pi van de opgeloste peptide (eiwit-NH2) bij 1 mM eindconcentratie (een 10-voudige molaire overmaat van 0,1 mM peptide oplossing). </li><li> Incubeer het reactiemengsel gedurende 2 uur bij 4 ° C. </li><li> Zuiveren verknoopte peptide met een ontzoutingskolom (Thermo Scientific Inc, Rockford IL) geëquilibreerd met buffer conjugatie (1 x PBS, pH 7,2, 1 mM EDTA) door centrifugeren bij 1500 xggedurende 1 min bij kamertemperatuur. </li><li> Stel een reactiemengsel combineren VLPs (eiwit-SH) en verknoopte peptide (eiwit-NH2) in een molaire verhouding bepaald door het aantal thiolen en geactiveerde amines bij de reactie betrokken en het verschil in molecuulgewicht tussen VLP&#39;s en peptide. </li><li> Incubeer het reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 2 uur bij 4 ° C. </li><li> Voor Western blot analyse mengen verkregen conjugatieproduct 1:1 met Laemmli buffer, koken gedurende 10 min, en doorgaan met SDS-PAGE op een prefab 10-20% Tris-Glycine gel (Invitrogen), gevolgd door elektroblotten op een nitrocellulosemembraan (Invitrogen). Blokkeer de membranen met 1 x PBS, pH 7,2 die 0,05% Tween-20 (PBS-Tween) en 5% magere melkpoeder en probe met peptide-specifieke antilichamen gevolgd door de juiste fosfatase gemerkt secundair antilichaam. </li></ol>

<ol><li>Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turnip+yellow+mosaic+virus+as+a+chemoaddressable+bionanoparticle%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconj.+Chem%22%5BJournal%5D)">Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle.</a> Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).</li>
<li>Chapman, S., Kavanagh, T., Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potato+virus+X+as+a+vector+for+gene+expression+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Potato virus X as a vector for gene expression in plants.</a> Plant J. 2, 549-557 (1992).</li>
<li>Chen, C., Kwak, E. S., Stein, B., Kao, C. C., Dragnea, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Packaging+of+gold+particles+in+viral+capsids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanosci.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Packaging of gold particles in viral capsids.</a> J. Nanosci. Nanotechnol. 5, 2029-2033 (2005).</li>
<li>Fowler, C. E., Shenton, W., Stubbs, G., Mann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+mosaic+virus+liquid+crystals+as+templates+for+the+interior+design+of+silica+mesophases+and+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Tobacco mosaic virus liquid crystals as templates for the interior design of silica mesophases and nanoparticles.</a> Advanced Materials. 13, 1266-1269 (2001).</li>
<li>Gazit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+biomolecular+templates+for+the+fabrication+of+metal+nanowires%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS.+J%22%5BJournal%5D)">Use of biomolecular templates for the fabrication of metal nanowires.</a> FEBS. J. 274, 317-322 (2007).</li>
<li>Gillitzer, E., Wilts, D., Young, M., Douglas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+modification+of+a+viral+cage+for+multivalent+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation.</a> Chem. Commun. , 2390-2391 (2002).</li>
<li>Hammond, R. W., Hammond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+rayado+fino+virus+capsid+proteins+assemble+into+virus-like+particles+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Maize rayado fino virus capsid proteins assemble into virus-like particles in Escherichia coli.</a> Virus Res. 147, 208-215 (2010).</li>
<li>Hermamson, G. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHermamson%2C+GT+%22Bioconjugate+techniques%22">Bioconjugate techniques</a>. , Academic Press. San Diego. (1991).</li>
<li>Kaiser, C. R., Flenniken, M. L., Gillitzer, E., Harmsen, A. L., Harmsen, A. G., Jutila, M. A., Douglas, T., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+studies+of+protein+cage+nanoparticles+demonstrate+broad+tissue+distribution+and+rapid+clearance+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Nanomed%22%5BJournal%5D)">Biodistribution studies of protein cage nanoparticles demonstrate broad tissue distribution and rapid clearance in vivo.</a> Int. J. Nanomed. 2, 715-733 (2007).</li>
<li>Knez, M., Bittner, A. M., Boes, F., Wege, C., Jeske, H., Maisse, E., Kern, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotemplate+synthesis+of+3-nm+nickel+and+cobalt+nanowires%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Biotemplate synthesis of 3-nm nickel and cobalt nanowires.</a> Nano Lett. 3, 1079-1082 (2003).</li>
<li>Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+CuCl2+concentration+on+the+aggregation+and+mineralization+of+Tobacco+mosaic+virus+biotemplate%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Colloid.+Interface.+Sci%22%5BJournal%5D)">Effect of CuCl2 concentration on the aggregation and mineralization of Tobacco mosaic virus biotemplate.</a> J. Colloid. Interface. Sci. 297, 554-560 (2006).</li>
<li>Lvov, Y., Haas, H., Decher, G., Mohwald, H., Mikhailov, A., Mtchedlishvily, B., Morgunova, E., Vainshtein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successive+deposition+of+alternate+layers+of+polyelectrolytes+and+a+charged+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Successive deposition of alternate layers of polyelectrolytes and a charged virus.</a> Langmuir. 10, 4232-4236 (1994).</li>
<li>Natilla, A., Hammond, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+rayado+fino+virus+virus-like+particles+expressed+in+tobacco+plants%3A+a+new+platform+for+cysteine+selective+bioconjugation+peptide+display%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Maize rayado fino virus virus-like particles expressed in tobacco plants: a new platform for cysteine selective bioconjugation peptide display.</a> J. Virol. Methods. 178, 209-215 (2011).</li>
<li>Rae, C. S., Khor, I. W., Wang, Q., Destito, G., Gonzalez, M. J., Singh, P., Thomas, D. M., Estrada, M. N., Powell, E., Finn, M. G., Manchester, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+trafficking+of+plant+virus+nanoparticles+in+mice+via+the+oral+route%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Systemic trafficking of plant virus nanoparticles in mice via the oral route.</a> Virology. 343, 2224-2235 (2005).</li>
<li>Raja, K. S., Wang, Q., Gonzalez, M. J., Manchester, M., Johnson, J. E., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+virus-polymer+materials.+Synthesis+and+properties+of+PEG-decorated+Cowpea+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Hybrid virus-polymer materials. Synthesis and properties of PEG-decorated Cowpea mosaic virus.</a> Biomacromolecules. 4, 472-476 (2003).</li>
<li>Royston, E., Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+silica-coated+Tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Colloid+Interface+Sci%22%5BJournal%5D)">Characterization of silica-coated Tobacco mosaic virus.</a> J. Colloid Interface Sci. 298, 706-712 (2006).</li>
<li>Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-surface+modification+in+the+Tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Dual-surface modification in the Tobacco mosaic virus.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).</li>
<li>Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+viruses+as+biotemplates+for+materials+and+their+use+in+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).</li>
</ol>

Vermelding van de handelsnamen van commerciële producten in de publicatie is uitsluitend bestemd voor het verstrekken van specifieke informatie en houdt geen aanbeveling of goedkeuring door het Amerikaanse ministerie van Landbouw.

De werkwijze die hier maakt een zeer gevoelige en snelle analyse van reactieve cysteïnen aanwezig op het oppervlak van VLP van plantaardige en op andere eiwitcomplexen. Maleïmiden zijn thiol-specifieke reagentia die reageren met vrije sulfhydryl-bevattende moleculen stabiele thioether bindingen. Deze methode is gebaseerd op de specificiteit van de maleïmides te reageren met sulfhydrylgroepen niet betrokken bij interacties met andere aminozuren. Behoud van de natieve structuur van de VLP erg belangrijk het gehele proces....

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Dunwandige, Ultra-Clear Tubes </td><td> Beckman </td><td> 344059 </td><td></td></tr><tr><td> mMESSAGE mMACHINE T7 Kit </td><td> Life Tecnologies </td><td> AM1344M </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresceïne-5-maleïmide </td><td> Thermo Scientific Life Technologies </td><td> 46130 F150 </td><td> 46130 is defect vervangen met F150 </td></tr><tr><td> Pierce Biotin Kwantificeringskit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 28005 </td><td></td></tr><tr><td> EZ-Link maleïmide-PEG2-biotine, No-Weigh Format </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21901 </td><td></td></tr><tr><td> SM (PEG) n Vernetters </td><td> Thermo Scientific </td><td> 22107 </td><td></td></tr><tr><td> 10-20% Tris-Glycine gel </td><td> Invitrogen </td><td> EC61352 </td><td></td></tr><tr><td> Laemmli buffer </td><td> Bio-Rad </td><td> 1610737 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Glycine SDS Running Buffer </td><td> Invitrogen </td><td> LC2675 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Glycine Transfer Buffer </td><td> Invitrogen </td><td> LC3675 </td><td></td></tr><tr><td> Nitrocellulosemembraan Filterpapier Sandwich </td><td> Invitrogen </td><td> LC2001 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfatase gemerkt affiniteitsgezuiverd Antilichamen tegen konijnen-IgG </td><td> Kirkegaard en Perry Laboratories </td><td> 0751516 </td><td></td></tr><tr><td> NBT / BCIP fosfatasesubstraatoplossing </td><td> Kirkegaard en Perry Laboratories </td><td> 508107 </td><td></td></tr></tbody></table>

analyse van de solvent toegankelijkheid van cysteïneresten op<em&gt; maïs rayado fino virus</em&gt; virus-achtige deeltjes, geproduceerd in<em&gt; nicotiana benthamiana</em&gt; plants and cross-linking van peptiden aan vlp

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Het nabootsen van en het benutten van virus eigenschappen en fysisch-chemische en fysische eigenschappen houdt belofte om oplossingen te bieden om een ​​aantal van de meest urgente in de wereld uitdagingen. De enorme bereik en de soorten virussen gekoppeld aan hun intrigerende eigenschappen potentieel geven eindeloze mogelijkheden voor toepassingen in virus-gebaseerde technologieën. Virussen hebben de mogelijkheid om zelf te monteren in deeltjes met discrete vorm en grootte specificiteit van symmetrie, veelzijdigheid en stabiele eigenschappen onder een breed temperatuurbereik en pH-omstandigheden. Niet verrassend, met zo&#39;n opmerkelijke scala van eigenschappen, zijn virussen voorgesteld voor gebruik in biomaterialen 9, vaccins 14, 15, elektronische materialen, chemische middelen, en moleculaire elektronische containers 4, 5, 10, 11, 16, 18, ​​12. Om virussen in nanotechnologie gebruiken, moeten zij worden gewijzigd in hun natuurlijke vorm om nieuwe functies geven. Deze uitdagende process kan worden uitgevoerd via verschillende mechanismen waaronder genetische modificatie van het virale genoom en chemisch verbonden buitenlandse of gewenste moleculen voor het virusdeeltje reactieve groepen 8. De mogelijkheid om een ​​virus te passen vooral afhangt van de fysisch-chemische en fysische eigenschappen van het virus. Bovendien de genetische of fysisch aanpassingen moeten worden uitgevoerd zonder dat de virus natieve structuur en functie virus. Maize rayado fino virus (MRFV) manteleiwitten zelf-assembleren in Escherichia coli produceren stal en lege VLP die gestabiliseerd door eiwit-eiwit interacties en die gebruikt kunnen worden in virus-gebaseerde technologieën toepassingen 8. VLP&#39;s geproduceerd in tabaksplanten onderzocht als een steiger waarop verschillende peptiden covalent worden weergegeven 13. Hier beschrijven we de stappen 1) bepalen welke van de oplosmiddel-toegankelijke cysteines in een viruscapside beschikbaar voor wijzikation en 2) Bioconjugate peptiden om de gewijzigde capsiden. Met natieve of mutationally ingestoken aminozuurresten en standaard koppeling technologieën hebben vele verschillende materialen zijn op het oppervlak van plantenvirussen zoals Brome mosaic virus 3, Carnation mottle virus 12 Cowpea chlorotic mottle virus 6, tabaksmozaïekvirus virus 17, Turnip geel mozaïek virus 1 en MRFV 13.

Tijdelijke expressie van mutant MRFV manteleiwit (CP) genen in N. benthamiana planten in een PVX-vector based producerende VLP wordt beschreven in figuur 1. De gewijzigde MRFV manteleiwitgen wordt geamplificeerd door PCR en vervolgens onder de transcriptionele controle van de dubbele subgenomische CP promoter in een PVX-vector based, pP2C2S 2 (een gift van D. Baulcombe, Sainsbury Laboratories, Norwich, Engeland). In vitro RNA transcriptie produceert RNA transcripten die daar...

Werkwijze voor het oplosmiddel toegankelijkheid van de thiolgroep van cysteine ​​residuen van analyseren<em&gt; Maïs rayado fino virus</em&gt; (MRFV)-virus-achtige deeltjes (VLP&#39;s) gevolgd door een peptide vernettingsreactie beschreven. De methode maakt gebruik van de beschikbaarheid van verschillende chemische groepen op het oppervlak van de VLP&#39;s die het doelwit zijn van specifieke reacties.

Analyse van de Solvent Toegankelijkheid van cysteïneresten op<em&gt; Maïs rayado fino virus</em&gt; Virus-achtige deeltjes, geproduceerd in<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; Plants and Cross-linking van peptiden aan VLP

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het uitvoeren van een analyse van de oplosmiddeltoegankelijkheid van cysteïneresiduen op het oppervlak van virusachtige deeltjes of VLP's, gevolgd door crosslinking van peptiden aan de cysteïnes op de virusachtige deeltjes. Dit wordt bereikt door eerst het kaphulisseiwit van het Maize rayado fino virus of MRFV te kloneren in een virusvector op basis van het aardappelvirus-X. Vervolgens worden N. benthamiana-planten geïnoculeerd met het gemodificeerde virus en worden de MRFV VLP's die uit het kaphulisseiwit zijn gevormd, gezuiverd. Ten slotte worden VLP's en peptiden gecrosslinkt met behulp van ammoniak-PEG4-maleïmide en gedetecteerd via western blot. De resultaten tonen de productie van VLP-peptidecomplexen aan via western blot-analyse. Deze techniek breidt de kennisbasis uit over hoe het oppervlak van virussen en virusachtige deeltjes chemisch kan worden gemodificeerd om nieuwe materialen voor nanotechnologie te produceren.Nadat Capped T7-RNA-transcripten zijn geproduceerd uit potato virus-X-gebaseerde vectorplasmiden die wild-type MRFV- en cys-gemuteerde coatproteïne-genen bevatten, worden twee aliquoten van elk 10 µL gebruikt om twee N. benthamiana-bladeren te inoculeren. Incubeer de planten gedurende 10 dagen in een kas bij een luchtvochtigheid van 60%, met 16 uur licht bij 25 °C en acht uur donker bij 20 °C. Oogst aan het einde van de incubatie de virusgeïnfecteerde bladeren, weeg het plantweefsel en plaats dit op ijs. Nadat de virusachtige deeltjes zijn gezuiverd volgens het tekstprotocol, wordt een 1 mM oplossing van Fluoresceïne-5-maleïmide bereid in 50 mM natriumfosfaatbuffer, pH 7.0, 1 mM EDTA. Vortex tot volledige oplossing en gebruik aluminiumfolie om de oplossing tegen licht te beschermen. Meng ongeveer 30 µL van 1 µg/µL VLP's met 60 µL Fluoresceïne-5-maleïmide en incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur of overnight bij 4 °C. Beëindig de reactie door DTT toe te voegen tot een eindconcentratie van 50 mM. Verwijder het niet-reactieve fluoresceïne met een desalting spincolumn. Om de VLP's met beschikbare cysteïneresten voor cross-linking te visualiseren, wordt een SDS-PAGE-analyse uitgevoerd door 10 µL 2x samplebuffer toe te voegen aan 10 µL van elke reactie. Bewaar het gelabelde eiwit, beschermd tegen licht, bij 4 °C gedurende maximaal één maand of in eenmalige aliquoten bij -20 °C gedurende maximaal drie maanden.Bereid een verse crosslinking-stockoplossing door 10 milligram NHS-PEG4-maleimide-crosslinker op te lossen in 680 microliters dimethylsulfoxide. Los een 17 (F)-aminozuurlang peptide op in 50 microliters conjugatiebuffer tot een concentratie van 0,1 millimolar. Voeg vier microliters crosslinker toe aan 50 microliters van het opgeloste peptide voor een eindconcentratie van één millimolar. Incubeer de reactie gedurende twee uur bij vier graden Celsius. Gebruik vervolgens een ontziltingkolom om de reactie te zuiveren. Stel, met gebruik van VLPs met beschikbare cysteïneresten voor cross-linking en het gecrosslinkte peptide, een reactiemengsel samen bij een molaire ratio die is bepaald door het aantal thiolen en geactiveerde amines die betrokken zijn bij de reactie en het verschil in molecuulgewicht tussen de VLPs en het peptide. Na het incuberen van de reactie gedurende twee uur bij kamertemperatuur, kan deze worden gebruikt voor SDS page en western blotting volgens het tekstprotocol.Een voorbeeld van reactieve aminozuren van het MRFV-capside-eiwit wordt hier getoond. Elk geselecteerd aminozuur kan worden gebruikt voor het koppelen van groepen, mits het aan het oppervlak is blootgesteld. De chemische technieken omvatten traditionele bio-conjugatiestrategieën, zoals de acylering van de aminogroep van lysine, alkylering van de sulfhydrylgroep van cysteïne, en activatie van carbonzuurresiduen gevolgd door koppeling met toegevoegde amines.Daarnaast kunnen de aromatische groepen van tyrosine en tryptofaan aantrekkelijke doelwitten zijn voor bioconjugatie via diazotering en alkylering. Hier wordt de oplosmiddeltoegankelijkheid van Cys-residuen van VLPs voor thiol-specifieke reagentia geïllustreerd. Gezuiverde wild-type VLPs en cys-VLP-mutanten met cysteïneresiduen op posities 107 tot 111 en 192 tot 194 van het CP-gen zijn onder natieve condities niet reactief met een thiol-specifiek reagens. Fluoresceïne-5-maleïmide geeft alleen oranje fluorescentie bij de Cys-VLP-mutant met cysteïneresiduen op posities 125 tot 129 van het CP-gen. Het resultaat laat zien dat de VLPs in baan twee een geometrische rangschikking van cysteïneresiduen hebben die resulteert in oplosmiddel-blootgestelde vrije thiolgroepen, terwijl de cysteïneresiduen in de monsters in banen één en drie mogelijk betrokken zijn bij disulfidebruggen in de vouwing van het mantelprotein. Labelingsreacties met maleïmide-PEG2-biotine gevolgd door een biotinyleringsassay vormen een ander voorbeeld van de analyse van de oplosmiddeltoegankelijkheid van cys-residuen. Omdat biotine een relatief klein molecuul is, kan het in meerdere kopieën worden geconjugeerd aan de VLPs, waarbij elk molecuul één molecuul avidine bindt, zoals hier wordt getoond. Het niveau van biotinylering, 84,74 mol biotine per mol proteïne, geeft het aantal biotine-moleculen aan dat aan de VLPs is gebonden, en bijgevolg het aantal liganden dat op het buitenste oppervlak kan worden gepresenteerd. Vanwege de beschikbaarheid van verschillende thiolgroepen op de VLPs kunnen peptiden worden bevestigd door crosslinking-reacties met NHS-PEG4-maleïmide.Dit reagens is een heterobifunctionele crosslinker die reactieve uiteinden bevat, zoals N-hydroxysuccinimide of NHS-ester en maleïmidegroepen, wat de covalente conjugatie van amine- en sulfhydrylbevattende moleculen mogelijk maakt. In dit voorbeeld reageert de NHS-ester met primaire amines waarbij amidebindingen worden gevormd, terwijl maleïmide reageert met sulfhydrylgroepen waarbij stabiele thioesterbindingen ontstaan. Zoals hier te zien is, produceren crosslinking-reacties VLP-peptidecomplexen die immunoreactief zijn met de specifieke antilichamen in een western blot.Deze ontwikkeling laat onderzoekers in het veld van de virologie zien hoe het gebruik van viruspartikels kan worden verkend als steiger voor de bevestiging van een grote verscheidenheid aan liganden in een regelmatige geometrische opstelling voor talrijke toepassingen.

analysis-solvent-accessibility-cysteine-residues-on-maize-rayado-fino

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Deze studie beschrijft een methode die de snelle en duidelijke diagnose van plantaardige virusziekten in ongeveer een halve dag maakt door gebruik te maken van een combinatie van microgolf-geassisteerde fabriek monstervoorbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie en negatieve kleuring methoden.

Magnetron Assisted snelle diagnose van Plant virusziekten bij Transmissie Elektronen Microscopie

Het testen van eiwit-eiwit interacties is onmisbaar voor dissectie van eiwitten functionaliteit. Hier introduceren we...

Eiwit Membraan Overlay Test: een protocol om interactie tussen oplosbare en onoplosbare eiwitten Test In vitro</em

Reactive oxygen species niveau wordt verhoogd wanneer de cellen tegenkomen stress. Hier laten we het voorbeeld van 3'-3 'diaminobenzidine vlekken en cysTMT etikettering en massaspectrometrie om de redox proteoom profileren...

Profilering Thiol Redox Proteome Met behulp van Isotope Tagging massaspectrometrie

Plant virale nanodeeltjes (VNPs) zijn veelbelovend platform voor toepassingen in de medische biologie. Hier beschrijven we de procedures voor plantaardige VNP vermeerdering, zuivering, karakterisering, en bioconjugatie. Ten slotte tonen we de toepassing van VNPs voor tumor homing en beeldvorming met behulp van een muis xenograft model en fluorescentie beeldvorming.

Virale nanopartikels voor<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

Gerichte afbraak van eiwitten is een belangrijke regulerende mechanisme voor de celfunctie. Het komt via een geconserveerde ubiquitineproteasoomroute, die polyubiquitine ketens hecht aan het doeleiwit dat dan als moleculaire "labels" voor het 26S proteasoom. We beschrijven hier een eenvoudige en betrouwbare celvrije assay voor proteasomale afbraak van eiwitten.

Het testen van proteasomale Afbraak in een Celvrije System in Plants

De bepaling van de oplossing structuur van een eiwit door kleine hoek röntgen verstrooiing (SAXS) vereist monodisperse monsters. Hier presenteren we twee mogelijkheden te verzekeren minimale vertragingen tussen monstervoorbereiding en data acquisitie: online size-exclusion chromatography (SEC) en online ionenuitwisselingschromatografie (IEC).

Online Grootte-uitsluiting en ionenuitwisselingschromatografie op een SAX Beamline

Biochemische en structurele analyses van geglycosyleerde eiwitten vereist relatief grote hoeveelheden van homogene monsters. Hier presenteren we een efficiënte chemische methode voor site-specifieke glycosylatie van recombinante eiwitten gezuiverd van bacteriën door zich te richten van reactieve Cys thiolen.

Cysteïne thiolen richtend voor in Vitro site-specifieke glycosylatie van recombinante eiwitten

Hier presenteren we een procedure fluorescently functionalize de disulfides op Qβ VLP met dibromomaleimide. We beschrijven Qβ meningsuiting en zuivering, de synthese van dibromomaleimide-matiemaatschappij moleculen en de vervoeging reactie tussen dibromomaleimide en Qβ. Het resulterende gele fluorescerende geconjugeerd deeltje kan worden gebruikt als een fluorescentie sonde binnen cellen.

Vervoeging-geïnduceerde fluorescerende gepegyleerde virusachtige deeltjes door Dibromomaleimide-disulfide chemie maken

We presenteren een algemeen protocol voor het identificeren van korte stukken van homologe gastheer-pathogen eiwit sequenties (SSHHP'S) ingebed in de virale poly eiwit. SSHHP'S worden herkend door virale proteasen en richten de gerichte vernietiging van specifieke gastheer proteïnen op door verschillende groep IV virussen.

Analyse van virale SSHHP'S in groep IV met gebruikmaking van in vitro en silico-methoden

Dit protocol beschrijft de selectie van optimale plasmodesmale markers voor confocale microscopie-gebaseerde analyses van eiwit gericht op plasmodesmata tijdens virus-plasmodesmata interacties of plasmodesmaal transport.

Confocale microscopieanalyse van eiwitsortering naar plasmodesmata in Nicotiana benthamiana

Leer hoe je de oplosmiddeltoegankelijkheid van cysteïneresten op virusachtige deeltjes analyseert en peptiden koppelt met behulp van Maïs rayado fino virus in Nicotiana benthamiana.

Analyse van de Solvent Toegankelijkheid van cysteïneresten op Maïs rayado fino virus Virus-achtige deeltjes, geproduceerd in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking van peptiden aan VLP (Video) | JoVE Journal

Analyse van de Solvent Toegankelijkheid van cysteïneresten op

Meer video's verkennen