Gecombineerd Immunofluorescentie en DNA FISH op 3D-bewaarde interfase kernen aan veranderingen in 3D Nuclear Organisatie Studie
3 februari 2013
Hier beschrijven we een protocol voor gelijktijdige detectie van histonmodificaties door immunofluorescentie en DNA-sequenties van DNA FISH gevolgd door 3D microscopie en analyses (3D-immuno DNA FISH).
Het algemene doel van deze procedure is om chromatinemodificaties en DNA-sequenties tegelijkertijd te detecteren met behulp van 3D confocale microscopie. Eerst worden specifieke DNA-sondes gegenereerd. Ondertussen worden de experimentele cellen gefixeerd, gepermeabiliseerd en immuno gekleurd. Voor de histone markers van belang.
De cellen worden vervolgens gedenatureerd en er wordt een overnachtelijke fluorescentie binnenin uitgevoerd. Hybridisatie of fish wordt uitgevoerd met behulp van een of meer DNA-sondes. Ten slotte worden de cellen gewassen en gemonteerd voor 3D-fluorescentie.
Microscopieanalyse van de resulterende beelden onthult nucleaire lokalisatie van loci van belang en associatie met specifieke histonmodificaties. Het grootste voordeel van deze techniek is dat het de visualisatie van nucleair eiwit, inclusief steen met genomische loci in 3D, behoudt en helpt bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van chromatine-epigenetische nucleaire organisatie of genexpressieregulatie. Voor deze procedure kunnen zowel plasmiden als PCR-producten worden gebruikt voor labeling.
Deze moeten worden voorbereid zoals beschreven in de bijbehorende tekst. Merk op dat voor een robuuste fish-signaal de sondes minimaal 10 kilobasepaar moeten zijn. Begin deze procedure door één microgram DNA en 0,17 microgram RNAs A te combineren in een microcentrifugebuis.
Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Na de incubatie, inactiveer de RNAs A kort op ijs en voeg de juiste hoeveelheid Nick-translatie toe. Meng en incubeer gedurende twee uur bij 16 graden Celsius in een gekoelde waterbad of een koelblok om de reactie te inactiveren.
Plaats de buizen gedurende één uur op min 80 graden Celsius of min 20 graden Celsius voor een nacht. Bepaal vervolgens de sondegrootte op een 2% agros-gel. De smeer moet tussen de 101.000 basenpaar zijn met de meerderheid ongeveer 300 tot 500 basenpaar.
Merk op dat de smeer van sci-fi sondes niet zichtbaar is. Zodra de grootte is bepaald, zuiver de sondes door dialyse op 0,02. Vijf millimeter filters in twee liter bekers gevuld met water.
Pipetteer voorzichtig 200 microgram sonde op het centrum van elk zwevend filter, en incubeer gedurende twee uur in het donker. Na de incubatie, gebruik een pipet om de sonde voorzichtig van de filters over te brengen naar een nieuwe microcentrifugebuis. Voeg vervolgens blokkeringsfactoren toe aan de sondes als volgt.
Eén microgram CO 1D NA. Eén microgram hoog blokkerings-DNA en 10 microgram zalmsperma voor één microgram DNA-sonde en mix sla de DNA-sondes op bij min 20 graden Celsius. Op de dag van de fish-procedure worden de sondes geprecipiteerd en klaargemaakt voor gebruik. Merk op dat de stappen die in deze sectie van de video worden beschreven, parallel moeten worden uitgevoerd met de stappen in de volgende sectie.
Om de sondes te precipiteren, volg ze en combineer ze met 0,1 volume van drie mola sodiumacetaat bij pH 5,2 en 2,5 volumes van 100% ethanol. Incubeer gedurende één uur bij min 80 graden Celsius. Na de incubatie, centrifugeert u de sondes bij 16.000 keer G bij vier graden Celsius gedurende 30 minuten. Na de centrifugatie, gooi de supernatant weg en laat de pelletjes in het donker aan de lucht drogen.
Afhankelijk van de hoeveelheid en kleur van de sondes, kan de pellet zichtbaar zijn of niet. Resuspendeer de pellet in 15 microliter hybridisatiebuffer per testvoorwaarde en schud met een einor thermomixer in het donker bij 37 tot 45 graden Celsius gedurende ongeveer 20 minuten. Om de sondes te denatureren, incubeer ze gedurende vijf minuten bij 75 tot 95 graden Celsius.
Vervolgens om de sondes voor te bereiden, incubeer ze gedurende 30 tot 60 minuten bij 37 graden Celsius op de thermomixer. Direct na de incubatie worden de sondes op cellen op dekglasjes aangebracht zoals beschreven in de volgende sectie van de video. Merk op dat voor de volgende stappen de incubatietijden moeten worden aangepast indien nodig voor de gebruikte antilichamen en cellen.
De stappen die in deze sectie van de video worden beschreven, moeten parallel worden uitgevoerd met de stappen in de vorige sectie, zoals beschreven in de bijbehorende tekst. Laat niet-adhesieven cellen op polylysine gecoate dekglasjes vallen in putjes van zes-putjesplaten en laat ze vijf minuten aanhechten. Voeg vervolgens voorzichtig twee milliliter 2% paraformaldehyde in PBS toe en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur na de incubatie.
Spoel elk putje drie keer met PBS, en om de cellen doorlaatbaar te maken, voeg twee milliliter ijskoud 0,4% Triton X 100 in PBS toe en incubeer gedurende vijf minuten op ijs. Na het aspireren van de doorlaatbare oplossing als DNA fish wordt gecombineerd met immunofluorescentie, gaat u als volgt te werk. Pipetteer eerst 100 microliter blokkeringsoplossing op param in een bevochtigde kamer.
Plaats het dekglas met de cellaag naar beneden op de blokkeringsoplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens brengt u de dekglasjes over naar 100 microliter druppels van het primaire antilichaam, verdund in blokkeringsoplossing.
Het antilichaam dat hier wordt gebruikt herkent gefosforyleerd Syrisch 1 39 van H twee A x of gamma H twee A x. Incubeer de glijbanen in een bevochtigde kamer gedurende één uur bij kamertemperatuur. Na de incubatie, verwijder de dekglasjes voorzichtig met een pincet.
Als de dekglasjes moeilijk te pakken zijn, overspoel met PBS en probeer het opnieuw. Breng elk dia over naar een putje van een zes-putjesplaat met twee milliliter 0,2% BSA 0,1% tween 20 in PBS. Was de dekglasjes in deze oplossing drie keer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur met schudden, en incubeer vervolgens de cellen met het geschikte, geconjugeerde fluorescente secundaire antilichaam, verdund in blokkeringsoplossing, gedurende één uur bij kamertemperatuur in een donkere en bevochtigde kamer op param.
Zoals eerd
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor de gelijktijdige detectie van histonmodificaties en DNA-sequenties met behulp van 3D-confocale microscopie. De methode integreert immunofluorescentie- en DNA-FISH-technieken om chromatinemodificaties effectief te analyseren.
Belangrijke onderdelen van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Genetica
Achtergrond
- Histonmodificaties spelen een cruciale rol bij genregulatie.
- DNA-FISH maakt de visualisatie van specifieke DNA-sequenties mogelijk.
- 3D-microscopie verbetert de ruimtelijke resolutie van cellulaire structuren.
- De combinatie van deze technieken kan inzicht bieden in chromatinedynamiek.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een protocol voor de gelijktijdige detectie van chromatine-modificaties en DNA-sequenties.
- Het verbeteren van het begrip van de relatie tussen histonmodificaties en DNA-organisatie.
- Het faciliteren van geavanceerde beeldvormingstechnieken in cellulaire studies.
Gebruikte methoden
- Genereren van specifieke DNA-probes voor hybridisatie.
- Fixatie en permeabilisatie van experimentele cellen.
- Immunokleuring voor relevante histonmarkers.
- 3D-fluorescentiemicroscopie voor het afbeelden van de monsters.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle gelijktijdige detectie van histonmodificaties en DNA-sequenties.
- Verbeterde visualisatie van de chromatinstructuur in drie dimensies.
- De effectiviteit van de gecombineerde immuno-DNA FISH-benadering is aangetoond.
- Voorzien in een betrouwbare methode voor het bestuderen van chromatine-dynamiek.
Conclusies
- Het protocol biedt een krachtig instrument voor onderzoekers in de celbiologie en genetica.
- Het opent nieuwe wegen voor het begrijpen van de wisselwerking tussen DNA en histonmodificaties.
- Toekomstige studies kunnen deze methode gebruiken om chromatine-gerelateerde fenomenen te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Deze methode maakt directe visualisatie van chromatinemodificaties en genomische loci in 3D-geconserveerde kernen mogelijk, wat mechanische risicoreductie bij doelwitvalidatie ondersteunt door epigenetische toestanden te koppelen aan de ruimtelijke genoomorganisatie. Het biedt voorspellende zekerheid in de vroege ontdekkingsfase door allelspecifieke veranderingen in de nucleaire architectuur te onthullen die geassocieerd zijn met genregulatieprocessen, zoals VDJ-recombinatie. De benadering verbetert de translationele continuïteit van ontdekking naar preklinische modellen door een ziekterelateerd systeem te bieden om nucleaire eiwit-DNA-interacties in individuele cellen te beoordelen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door histonmodificatiepatronen te correleren met de positionering van genomische loci in individuele cellen.
- Operationele waarde: Maakt functionele doelwitvalidatie mogelijk door directe observatie van nucleaire eiwit-DNA-associaties in de 3D-ruimte.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door inter-allelische afstanden en paringsfrequenties te kwantificeren als biomarkers voor de chromatinestatus.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door het vaststellen van reproduceerbare workflows voor 3D-beeldvorming van de nucleus.
- Kwantitatieve output: Genereert meetbare ruimtelijke read-outs (bijv. inter-alleliche afstanden) die het mogelijk maken om het effect van verbindingen op de nucleaire organisatie te beoordelen.
- Herbruikbaarheid van het platform: Gestandaardiseerde stappen voor sondevoorbereiding en hybridisatie maken schaalbaarheid mogelijk over meerdere genomische targets en celtypen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Toepasbaar op modellen voor lymfocytenontwikkeling waarbij veranderingen in de nucleaire architectuur de regulatie van VDJ-recombinatie weerspiegelen.
- Translationele biomarker: Gebruikt een drempelwaarde voor de inter-allelische afstand (1 micron) als kwantitatieve grens voor het beoordelen van de paringsstatus in wild-type versus mutante condities.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Maakt mechanistische risicoreductie mogelijk door specifieke proteindeficiënties (bijv. RAG1) te koppelen aan een veranderde nucleaire organisatie en een beperkte allelparing.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetoetsing in de vroege ontdekkingsfase tot leadidentificatie en preklinische validatie, met name voor targets die betrekking hebben op epigenetische regulatie en nucleaire organisatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door te visualiseren hoe chromatine-modificaties de positionering van genomische loci beïnvloeden in 3D-geconserveerde kernen.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via gestandaardiseerde protocollen voor de generatie en hybridisatie van DNA-probes die compatibel zijn met 3D-confocale microscopie.
- Analytiek: Biedt kwantitatieve metingen (bijv. cumulatieve frequentieverdelingen van inter-allelische afstanden) en statistische output (KS-toets, exacte toets van Fisher) om experimentele condities te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Legt een verband met preklinische continuïteit door de ontwikkeling van lymfocyten in wild-type en mutante cellen te modelleren om de mechanistische impact van recombinase-deficiëntie te beoordelen.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbare capaciteit voor het bestuderen van chromatinedynamiek in diverse ziektemodellen die ruimtelijke epigenomische analyse vereisen.
Operationele en organisatorische impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door mechanistische ambiguïteit in epigenetische regulatie te verminderen via directe co-lokalisatie van histonmerkers en DNA-sequenties.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid via vaste protocollen voor sonde-preparatie, hybridisatie en wasbeurten.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door ruimtelijk opgeloste, kwantitatieve gegevens te verschaffen over veranderingen in de nucleaire architectuur die gekoppeld zijn aan genregulatie.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk door verbindingen of genetische perturbaties te identificeren die normale allelkoppeling en nucleaire organisatie herstellen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in moleculaire biologie, immunofluorescentie en 3D-confocale microscopie.
- Afhankelijk van instrumentatie voor de generatie van probes (nick-translatie, dialyse, precipitatie) en 3D-beeldacquisitie met optische sectiering.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor antilichaamvalidatie, kwaliteitscontrole van probes en pijplijnen voor beeldanalyse.
- Omvat overwegingen voor aanpassing aan verschillende celtypen, fixatiecondities en doelgenomische regio's op basis van de grootte en toegankelijkheid van de probe.
- Praktische beperkingen omvatten de penetratie-efficiëntie van probes in dichtgepakte chromatine en mogelijke epitopenmaskering tijdens sequentiële kleuringsstappen.
