Leef Imaging van de Drug antwoorden in de tumor micro-omgeving in muismodellen van Kanker van de Borst
24 maart 2013
We beschrijven een werkwijze voor beeldvorming respons op anti-kankerbehandeling In vivo En cel resolutie.
Het algemene doel van deze procedure is om de penetratie van medicijnen en de therapeutische respons op de toediening van een therapeutisch medicijn in realtime te volgen. Dit wordt bereikt door het dier eerst met het medicijn te behandelen. Vervolgens wordt de inguinale borstklier die de tumor bevat, blootgelegd door een huidflap te maken.
Daarna wordt de muis overgebracht naar het microscopische podium en worden de bloedzuurstofverzadiging en polssnelheden gemeten en wordt een permanente inbrengsluis voor vloeistof- en medicijn- of kleurstoftoediening ingebracht. Ten slotte worden time-lapse beelden verkregen voor latere analyses. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die veranderingen in celdood of tumorstroma-interacties in reactie op een medicijn laten zien door middel van live spinning disc confocale microscopie van muisborsttumoren.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de tumormicro-omgeving, zoals hoe verschillende stromacomponenten van een tumor de respons op therapie beïnvloeden. Voordat u begint, raadpleegt u het schriftelijke protocol voor typische schema's voor medicijntoediening en beeldvorming. Schakel een hete kraalsterilisator in en laat deze minstens 200 graden Celsius bereiken.
Nadat de chirurgische instrumenten in zeep en water zijn gewassen, inclusief een paar pincetten met tanden, een paar gekartelde pincetten en twee paar scharen, gebruikt u de hete kraalsterilisator om ze minimaal 30 seconden te steriliseren. Laat ze daarna afkoelen. Plaats een laboratoriumdoek op de schuimrubberen deksel die als chirurgisch platform zal worden gebruikt.
Gebruik laboratoriumtape om een neusdop met een leiding naar het anesthesiesysteem op het laboratoriumdoek te bevestigen en bepaal een 18 gauge door een en een halve inch naald door de tape in het schuimrubberen deksel aan beide zijden van de neusdop om de neusdop op zijn plaats te houden. Zet Betadine steriele gaas opzij. Twee 70%isopropanol-doekjes, een microscoopglasplaat, superlijm en vier stukken labtape van een halve inch breed.
Nadat het dier in een inductiekamer is verdoofd, wanneer het diep en langzaam ademt, brengt u de muis over naar het chirurgische platform met de buikzijde naar boven. Om hoge druk te voorkomen, opent u de anesthesieleiding naar het chirurgische platform en sluit u vervolgens de anesthesieleiding naar de inductiekamer. Verlaag de concentratie isofluraan van 4% tot 2,5%. Controleer of de diepte van de anesthesie voldoende is voor de operatie door een teenkussentjesprik uit te voeren.
Als het dier niet reageert, gebruikt u vier stukken labtape om zijn ledematen aan het chirurgische platform te bevestigen en gebruikt u een elektrisch scheerapparaat om het haar van de buikzijde te verwijderen. Gebruik 70%isopropanol-doekjes, gevolgd door Betadine aangebracht op steriele gaas om de buikzijde van het dier te desinfecteren met behulp van schaar en pincetten met tanden. Maak een subcutane ventrale midline-incisie van ongeveer drie millimeter boven de urethra tot aan het borstbeen.
Zorg ervoor dat u het peritoneum niet puncteert of snijdt met de schaar en gekartelde pincetten. Los voorzichtig de huid los van de buikholte met de inguinale borstklier die de te beeldvormen tumor bevat. Plaats een glazen microscoopglas tegen de huidflap zodat het grootste deel van de tumor plat ligt wanneer de muis op het podium wordt geplaatst en zodat het niet wordt belemmerd door de achterpoten.
Zodra het microscoopglas correct is gepositioneerd, gebruikt u superlijm om het glas aan de buitenkant van de huid te bevestigen. Verwijder de laboratoriumtape die de ledematen van het dier vasthoudt. Open de anesthesieleiding naar het microscooppodium en sluit vervolgens de anesthesieleiding naar het chirurgische platform.
Breng het dier snel over naar het microscooppodium. Zodra het dier is overgebracht, positioneer en bevestig de anesthesieleiding en neusdop om ervoor te zorgen dat de muis verdoofd blijft en in een comfortabele positie ligt. Verlaag de concentratie isofluraan tot 1,5%. Breng de tumor bloot zodat deze zich bovenop en in het midden van een van de met glas bedekte beeldvormingspoorten op het microscooppodium bevindt. Breng de intraperitoneaal inbrengsluis in met een vleugelinfuusset bevestigd aan de één milliliter spuit met steriele PBS-zoutoplossing of zoutoplossing met propidiumjodide.
Wanneer de intraperitoneale lijn is ingebracht, injecteert u het dier met 100 microliter zoutoplossing met propidiumjodide en blijft u elk uur 50 microliter zoutoplossing met propidiumjodide injecteren tot de beeldvormingssessie is voltooid. Gebruik de oculairs om te controleren of de tumor correct is gepositioneerd en tapeer voorzichtig het microscoopglas en de intraperitoneale lijn vast. Het glas moet losjes genoeg worden vastgezet zodat de bloedstroom naar het weefsel niet wordt belemmerd.
Het vasttaperen van het microscoopglas helpt om beeldvormingsartefacten die worden veroorzaakt door de ademhaling van het dier te minimaliseren om time-lapse beelden te verkrijgen. Gebruik de open source software micromanager, compileer en analyseer de ruwe gegevens met behulp van IRIS of andere beeldanalysesoftware. Fluorescerend geconjugeerde DExT-strengen kunnen worden gebruikt als een surrogaatmarker voor medicijnafgifte in weefsels.
Hier wordt de aankomst van fitzy-geconjugeerd twee megadalton dextran IV getoond dat in een muis wordt geïnjecteerd die blauw fluorescerend eiwit in borstkankercellen tot expressie brengt. Na de aankomst van het medicijn in de tumor kunnen extravasatie en diffusie worden beeldvormd om de intravasculaire halfwaardetijd en medicijnverdeling te bepalen. Hier wordt de extravasatie en verdeling van LOR-geconjugeerd 10 kilodalton dextran IV getoond dat in een muis wordt geïnjecteerd die blauw fluorescerend eiwit in borstkankercellen en groen fluorescerend eiwit in myeloïde cellen tot expressie brengt.
Beeldvorming kan informatie verschaffen over het type celafsterven waaraan kankercellen onderhevig zijn. Hier worden structurele kernveranderingen die kenmerkend zijn voor necrose of apoptose waargenomen in een muis die groen fluorescerend eiwit geeft dat is geconjugeerd aan hison
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het in beeld brengen van de respons op een antikankerbehandeling in vivo met een resolutie op enkelcelniveau. De techniek maakt real-time tracking mogelijk van de drugpenetratie en de therapeutische respons in mamma-tumoren van muizen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Oncologie
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Het begrijpen van interacties in de tumormicro-omgeving is cruciaal voor cancertherapie.
- Real-time imaging kan inzicht bieden in de afgifte en werkzaamheid van geneesmiddelen.
- Imaging met resolutie op enkelcelniveau verbetert het begrip van cellulaire responsen.
- Live imaging-technieken zijn essentieel voor het bestuderen van dynamische biologische processen.
Doel van de studie
- Om de penetratie van geneesmiddelen in tumoren te volgen.
- Om therapeutische responsen op cellulair niveau te analyseren.
- Om de interacties tussen tumorcellen en stroma-componenten te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Muismodellen met geïmplanteerde tumoren werden gebruikt voor beeldvorming.
- Time-lapse-beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van spinning disc confocale microscopie.
- De toediening van het geneesmiddel werd gemonitord via een ingebrachte lijn.
- Fluorescente markers werden gebruikt om de distributie van het geneesmiddel en de cellulaire responsen te visualiseren.
Belangrijkste resultaten
- Real-time imaging onthulde veranderingen in celsterfte en interacties met het tumorstroma.
- Fluorescentgeconjugeerde markers toonden een effectieve drugdelivery aan.
- Imaging bood inzicht in het type celsterfte dat in tumoren optreedt.
- Stromale reacties op chemotherapie werden waargenomen, waarbij de rekrutering van immuuncellen werd benadrukt.
Conclusies
- De methode maakt een gedetailleerde analyse van therapeutische responsen in tumoren mogelijk.
- Real-time imaging kan het begrip van de drugseffectiviteit verbeteren.
- Deze aanpak kan toekomstige strategieën voor kankerbehandeling informeren.
Veelgestelde Vragen
Relevantie voor de industrie
Real-time visualisatie van geneesmiddeldistributie en interacties tussen tumor en stroma in levende muismodellen maakt mechanische risicovermindering van oncologische therapieën mogelijk door farmacokinetische blootstelling te koppelen aan de farmacodynamische respons. Deze benadering ondersteunt targetvalidatie en het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen door dynamische biologische processen vast te leggen die de effectiviteit van geneesmiddelen beïnvloeden. De methode informeert de portfoliotriage door stroma-gemedieerde resistentiemechanismen vroegtijdig in de ontdekkingsfase te identificeren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door drugpenetratie en kankerceldood in real-time te visualiseren.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk door directe observatie van stromale celmigratie en immuunrekrutering na behandeling.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfoliobeslissingen door te onthullen hoe interacties in de tumoromgeving de respons op het geneesmiddel moduleren.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream workflows door kwantitatieve benchmarks vast te stellen voor geneesmiddelverdeling en stromale reactiviteit.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays via time-lapse imaging van consistente tumor-stroma-interfaces.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt het hergebruik van het platform voor meerdere geneesmiddelkandidaten en stromale configuraties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele Continuïteit: Behoudt de relevantie voor ziektebeelden door stromale responsen vast te leggen die klinische observaties van immuunrekrutering na chemotherapie weerspiegelen.
- Preklinische Afstemming: Verbindt bevindingen uit het discovery-onderzoek aan preklinische validatie via meetbare eindpunten zoals kankerceldood en stromale migratie.
- Risicogestuurde Vooruitgang: Onderbouwt go/no-go-beslissingen door stroma-gemedieerde barrières voor drugsefficiëntie te kwantificeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische evaluatie, door dynamische read-outs van geneesmiddelexpositie en biologische respons te bieden.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en de verduidelijking van signaalpaden door geneesmiddelentoediening te koppelen aan cellulaire uitkomsten in intacte tumormicro-omgevingen.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via gestandaardiseerde beeldvormingspoorten en reproduceerbare time-lapse acquisitie.
- Analytics: Maakt kwantitatieve vergelijking van geneesmiddeldistributie, celsterftekinetiek en migratie van stromale cellen mogelijk met behulp van beeldanalyse-software.
- Translational Research: Sluit aan bij preklinische continuïteit door stromale responsen te modelleren die immuun-gemedieerde effecten van geneesmiddelen voorspellen.
- Enterprise Reuse: Fungeert als een herbruikbaar beeldvormingsplatform voor het evalueren van diverse therapeutica in verschillende borstkankermodellen.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellende zekerheid door mechanistische ambiguïteit in interacties tussen geneesmiddel, tumor en stroma te verminderen.
- Operationele waarde: Garandeert standaardisatie en reproduceerbaarheid via chirurgische preparatie- en beeldvormingsprotocollen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door biologische resistentiemechanismen in een vroeg stadium te identificeren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk op basis van stromale interactieprofielen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in muischirurgie, anesthesiebeheer en intravitale beeldvormingstechnieken.
- Is afhankelijk van spinning disk confocale microscopie, temperatuurgecontroleerde objecttafels en fluorescentie-labelingsinfrastructuur.
- Necessiteert standaardisatie tussen teams voor een consistente tumorpreparatie, toediening van geneesmiddelen en beeldverwerving.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen bij verschillende tumormodellen, stromale composities en therapeutische middelen.
- Beperkt door de duur van de beeldvorming (tot 40 uur) en potentiële artefacten door beweging of ademhaling van het dier.
