Name: Cryosectioning Gist Gemeenschappen is voor de behandeling Fluorescentie Patterns (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Leer een cryosectioning-protocol voor gistgemeenschappen om fluorescente celpopulaties te visualiseren met behoud van ruimtelijke verdeling. Deze methode ondersteunt onderzoek naar celbiologie en microbiele interacties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij willen Jonathan Cooper Lab bij Fred Hutchinson Cancer Research Center bedanken voor de toestemming om hun cryostaat te gebruiken. Dit werk werd ondersteund door NIH en de WM Keck Foundation. BM is een Gordon en Betty Moore fellow van Life Science Research Foundation. We zijn dankbaar voor Daniel Gottschling voor het delen van zijn bevestiging protocol met ons op.

1. Bevestiging Gist Gemeenschappen <ol><li> Gist gemeenschappen groeien op een membraanfilter (bijvoorbeeld Millipore MF membraanfilter; Figuur 2A). Dit komt overeen met een typische gemeenschap van minder dan 2x10 8 cellen op een 6 mm diameter membraanfilter. </li><li> Gebruik een stuk Whatman 541 filtreerpapier op de bodem van een 1 cm diameter en (Figuur 2B) omvat. Dit Whatman papier gebruikt als drager om de gemeenschap dragen in latere stadia. Voeg 1 ml 100% methanol naar de put, en laat de put -20 ° C voor de temperatuur in evenwicht. </li><li> Zet vloeibare N2 in een Dewar. Bevriezen in vloeibare stikstof door door dompelen de gemeenschap minstens 15 sec in vloeibare N2 met een pincet (Figuur 2C). </li><li> Overdracht bevroren gemeenschap om de put van -20 ° C methanol (figuur 2D). Zorg ervoor dat de gemeenschap horizontaal gehouden wordt wanneer het onder te dompelen in de methanol.Wacht 20 minuten. De MF membraanfilter begint te desintegreren in methanol. </li><li> Overdragen door op de drager 541 Whatman filtreerpapier van methanol en een koude petrischaal bewaard bij -20 ° C methanol verdamping (figuur 2E). Bij het overbrengen van, houden de gemeenschap op de top van drager Whatman filter en weg te trekken extra druppels methanol met behulp van een ander stuk van dik Whatman papier voordat u in de kou petrischaal. Dit zal ervoor zorgen dat de verdamping is consistent van monster tot monster. </li><li> Wacht 4 tot 6 uur voor verdamping, voordat de drager Whatman filter ziet er droog. Onvoldoende verdamping laat resterende methanol die interfereert met het snijden. Over-drogen oorzaken scheuren en vervorming in gemeenschappen. </li><li> Neem het monster uit van -20 ° C vriezer. Knip Whatman 541 filtreerpapier niet onder gemeenschap. </li><li> Een rechthoekige kubieke aluminium folie container die groot genoeg zodat het monster ten minste 2 mm ~ marge van heeftweerskanten (figuur 2F). Plaats de gemeenschap op de bodem van de aluminium-folie verpakking en onmiddellijk wordt het monster bedekt met OCT tot 3 ~ 4 mm boven de gemeenschap hoogte. Als belangrijk kan de oriëntatie van het monster worden ingesteld in deze stap met betrekking tot de zijkanten van de container. Wacht 10 minuten. </li><li> Plaats de LGO-embedded monster op een metalen plaat op droog ijs te bevriezen. Bewaar de ingevroren gemeenschappen bij -20 ° C of -80 ° C vriezer. </li></ol> 2. Snijden Bevroren Gemeenschappen voor Fluorescence Imaging <ol><li> De temperatuur van cryosection kamer tot -25 ° C en laat de monsters in de kamer totdat de temperatuur de temperatuur van de kamer. </li><li> Monteer het monster op een cryo-mount na het aanbrengen van een druppel van de LGO op de berg. Uniform verdeeld oktober aan de kant van het monster met blootgestelde Whatman filtreerpapier (bodem van de container) zodat oktober dikte 2-3 mm. Laat oktober bevriezen in de cryostaatkamer voordat sectioning. Zorgen voor een LGO marge van 2-3 mm aan alle zijden van het monster bijdraagt ​​tot het behoud van de integriteit van secties. </li><li> De zijkanten van de LGO monsterblok kan worden gebruikt om het monster te lijnen. Als het monster niet uitgelijnd ten opzichte van het mes zal snijden starten vanuit een hoek of zijkant van het monster. Stel de constructie te verzekeren dat het blad een perfect verticale (of horizontale) vlak van het monsterblok snijdt. </li><li> Typische profielen voor gist gemeenschappen ~ 14 micrometer dikke. Na het snijden een gedeelte met een microscoop bij kamertemperatuur bewaard het gedeelte verzamelen door langzaam naderen de schuif de doorsnede. De sectie zal smelten en over te dragen aan de microscoop dia. Er kunnen maximaal 18 secties kunnen overgedragen worden op een dia. </li><li> Sla de slides bij lage temperaturen, bij voorkeur -20 ° C, voor imaging. Signaalverlies minimaal wanneer gedurende een week bij 4 ° C. Voor een maximale fluorescentie-signaal, wordt beeldvorming bij voorkeur direct gedaan na het snijden. </li></ol>

<ol><li>Tolker-Nielsen, T., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Organization+of+Microbial+Biofilm+Communities%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Spatial Organization of Microbial Biofilm Communities.</a> Microbial Ecology. 40 (2), 75-84 (2000).</li>
<li>Moller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+In+Situ+Gene+Expression+in+Mixed-Culture+Biofilms%3A+Evidence+of+Metabolic+Interactions+between+Community+Members%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)"> In Situ Gene Expression in Mixed-Culture Biofilms: Evidence of Metabolic Interactions between Community Members.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64 (2), 721-732 (1998).</li>
<li>Lepp, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanogenic+Archaea+and+human+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Methanogenic Archaea and human periodontal disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6176-6181 (2004).</li>
<li>Váchová, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+developing+multicellular+yeast+colony%3A+spatio-temporal+expression+of+Ato1p+ammonium+exporter%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter.</a> Environmental Microbiology. 11 (7), 1866-1877 (2009).</li>
<li>Mináriková, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+Gene+Expression+in+Cells+within+Yeast+Colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiated Gene Expression in Cells within Yeast Colonies.</a> Experimental Cell Research. 271 (2), 296-304 (2001).</li>
<li>Shou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+cooperation+in+engineered+yeast+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synthetic cooperation in engineered yeast populations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1877-1882 (2007).</li>
<li>Momeni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+generates+a+unique+spatial+signature+in+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cooperation generates a unique spatial signature in microbial communities.</a> , Submitted (2012).</li>
<li>Kiernan, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKiernan%2C+J+%22Histological+and+Histochemical+Methods%3A+Theory+and+Practice%22">Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice</a>. ed, , 4th, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 4(2008).</li>
<li>Piccirillo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rim101p%2FPacC+Pathway+and+Alkaline+pH+Regulate+Pattern+Formation+in+Yeast+Colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Rim101p/PacC Pathway and Alkaline pH Regulate Pattern Formation in Yeast Colonies.</a> Genetics. 184 (3), 707-716 (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De procedure hier gepresenteerde biedt een manier om de interne structuur van gist gemeenschappen te inspecteren. De methanol fixeerstap maakt de gistkolonie starre 8 en bewaart de integriteit van de kolonie, maar veroorzaakt ook krimp 8 die moet worden gehouden bij het ​​interpreteren van de resultaten. We meestal zien rond de 30% krimp in de hoogte van gist kolonies, in vergelijking met kolonies rechtstreeks ingebed in OCT zonder bevestiging 9. Om te voorko...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> 100% Methanol </td><td> JT Baker </td><td> 9070-01 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue-Tek oktober Compound </td><td> Andwin Wetenschappelijke </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Whatman Grade nr. 541 Kwantitatieve Filterpapier </td><td> Whatman papier </td><td> 1541-047 </td><td></td></tr><tr><td> Millipore-MF Membraan Filter </td><td> Millipore </td><td> HAWP04700 </td><td></td></tr><tr><td> Cryostaat </td><td> Leica </td><td> CM 1510 S </td><td></td></tr></tbody></table>

cryosectioning gist gemeenschappen is voor de behandeling fluorescentie patterns

Cryosectioning Yeast Communities for Examining Fluorescence Patterns

Microben typisch leven in gemeenschappen. De ruimtelijke organisatie van cellen in een gemeenschap wordt verondersteld om de overleving en functie van de gemeenschap 1 beïnvloeden. Optische sectie technieken, met inbegrip van confocale en twee-foton microscopie, nuttig zijn gebleken voor het observeren van ruimtelijke organisatie van bacterien en archaea gemeenschappen 2,3. Een combinatie van confocale beeldvorming en fysische snijden van gistkolonies blijkt interne organisatie van cellen 4. Heeft echter directe optische sectie met behulp van confocale of twee-foton microscopie geweest alleen in staat om een ​​paar cellagen diep in gist kolonies te bereiken. Deze beperking is waarschijnlijk vanwege sterke lichtverstrooiing uit gistcellen 4. Hier presenteren we een methode op basis van de vaststelling en cryosectioning tot ruimtelijke verdeling van fluorescerende cellen te verkrijgen in Saccharomyces cerevisiae gemeenschappen. We gebruiken methanol als fixeermiddel agensde ruimtelijke verdeling van cellen behouden. Vaste gemeenschappen worden geïnfiltreerd met OCT verbinding, bevroren, en cryosectioned in een cryostaat. Fluorescentie beeldvorming van de secties onthult de interne organisatie van fluorescerende cellen binnen de gemeenschap. Voorbeelden van gist gemeenschappen bestaande uit stammen die rood en groen fluorescerende eiwitten vertonen de potentialen van de cryosectioning methode om de ruimtelijke verdeling van fluorescerende cellen onthullen evenals die van genexpressie in gistkolonies 2,3. Hoewel onze nadruk lag op Saccharomyces cerevisiae Gemeenschappen kan dezelfde werkwijze mogelijk worden toegepast op andere microbiële onderzoeken.

Fluorescentiebeelden verticale dwarsdoorsneden van gist gemeenschappen die rood en groen gelabeld concurrerende populaties 6 worden weergegeven in figuur 3. Deze gemeenschappen bestaan ​​uit twee prototrofe stammen van gist en hun concurrentie voor gedeelde bronnen, waaronder ruimte tot zuilvormige patronen 7, zoals weergegeven in de verticale doorsneden. Resoluties tot een cel kunnen worden opgelost in dwarsdoorsneden. Figuur 3 vergelijkt dwarsdoorsneden van herha...

We presenteren een protocol voor het invriezen en cryosectioning gist gemeenschappen om interne patronen van fluorescerende cellen te observeren. De methode is gebaseerd op methanol-fixing en OCT-inbedding van de ruimtelijke verdeling van cellen te behouden zonder het inactiveren van fluorescerende eiwitten binnen een gemeenschap.

Cryosectioning Gist Gemeenschappen is voor de behandeling Fluorescentie Patterns

Microbes typically live  in communities. The spatial organization  of cells within a community is believed to impact the survival and function of the  ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om doorsneden van gistgemeenschappen te produceren om de ruimtelijke verdeling van verschillende fluorescente celpopulaties binnen een gemeenschap te onderzoeken. Dit wordt bereikt door eerst de gemeenschap te bevriezen en vervolgens te fixeren met methanol om de ruimtelijke verdeling van cellen in de gemeenschap te behouden. Als tweede stap wordt het methanol verdampt om penetratie van de inbeddings-OCT-verbinding mogelijk te maken.De ingebedde gemeenschap wordt vervolgens bevroren ter voorbereiding op cryosecteren. Vervolgens worden cryo ome-secties gemaakt. De gemeenschap en doorsneden kunnen onder een fluorescentiemicroscoop worden afgebeeld. Er worden resultaten verkregen die de ruimtelijke verdeling van fluorescente celpopulaties binnen een gemeenschap tonen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals optisch secteren, is dat het de ruimtelijke verdeling van populaties diep in deze gemeenschappen onthult. Om deze procedure te starten, kweekt u gistgemeenschappen op een membraanfilter. Dit protocol komt overeen met een typische gemeenschap van minder dan twee keer 10 tot de achtste cell

cryosectioning-yeast-communities-for-examining-fluorescence-patterns

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een robuuste benadering van de levering van organellen monitor aan op de zure lumen van de gist vacuole voor afbraak en recycling wordt beschreven. De methode is gebaseerd op de specifieke etikettering van target organellen met een genetisch gecodeerd dual-emissie fluorescentie pH-biosensor, en visualisatie van individuele cellen met behulp van fluorescentie microscopie.

Een fluorescentie microscopie Assay voor de bewaking Mitophagy in de Gist Saccharomyces cerevisiae

Kwantitatieve Live Cell Fluorescentie-microscopie analyse van Fission Yeast

Dit protocol beschrijft een experimentele procedure voor het uitvoeren...

Visualisatie en analyse van mRNA moleculen met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Dit handschrift beschrijft een gemakkelijk te gebruiken en goedkope Cryofixatie werkwijze voor het zichtbaar suspensiecellen door transmissie- elektronenmicroscopie.

Plunge Invriezen: een instrument voor de Ultrastructureel en immunolokalisatiestudies van Suspension Cellen in Transmission Electron Microscopy

Hier presenteren we live-celbeeldvorming die een niet-toxische microscopie methode is die onderzoekers in staat stelt om eiwit gedrag en nucleaire dynamiek in levende splijting gistcellen te bestuderen tijdens mitose en meiosis.

Onderzoek van de kern dynamiek van de mitotische en Meiotische splijtstof gist door fluorescentie-Live-cel microscopie

We presenteren een protocol voor lamellenpreparaat van diepgevroren biologische monsters door cryo-gerichte ionenbundelmicromachining voor structurele studies met hoge resolutie van macromoleculen in situ met cryo-elektronentomografie. Het gepresenteerde protocol biedt richtlijnen voor de bereiding van hoogwaardige lamellen met een hoge reproduceerbaarheid voor structurele karakterisering van macromoleculen in de Saccharomyces cerevisiae.

Bereiding en Cryo-FIB microbewerking van Saccharomyces cerevisiae voor Cryo-Elektronen Tomografie

Dit protocol is een effectieve, snelle methode om gisten en de schimmel Aspergillus fumigatus uit grote sets bodemmonsters te kweken in slechts 7 dagen. De methoden kunnen eenvoudig worden aangepast om een reeks incubatiemedia en temperaturen te accommoderen als dat nodig is voor experimenten.

Isolatie van kweekbare gisten en schimmels uit bodems om de structuur van schimmelpopulaties te onderzoeken

Splijtingsgist wordt hier gebruikt als een heterologe gastheer om bacteriële cytoskeletale eiwitten zoals FtsZ en MreB tot expressie te brengen als translationele fusie-eiwitten met GFP om hun polymerisatie te visualiseren. Ook worden verbindingen die de polymerisatie beïnvloeden geïdentificeerd door beeldvorming met behulp van een fluorescentiemicroscoop.

Splijtingsgist als platform voor antibacteriële geneesmiddelenschermen gericht op bacteriële cytoskeleteiwitten

Dit protocol biedt een uitgebreide richtlijn voor het opzetten en kwantitatief monitoren van co-culturen, inclusief fotoautotrofe suikerafscheidende cyanobacteriën en heterotrofe gisten.

Assemblage en kwantificering van co-culturen die heterotrofe gist combineren met fototrofe suikerafscheidende cyanobacteriën

Dit protocol beschrijft twee methoden voor het stoppen van de gistcelcyclus en optionele afgifte, en gaat dieper in op het gebruik van fluorescentiemicroscopie om celcyclusafhankelijke processen in S. cerevisiae te bestuderen.

Manipulatie en analyse van celcyclusafhankelijke processen in ontluikende gist

Leer een cryosectioning-protocol voor gistgemeenschappen om fluorescente celpopulaties te visualiseren met behoud van ruimtelijke verdeling. Deze methode ondersteunt onderzoek naar celbiologie en microbiele interacties.

Cryosectioning Gist Gemeenschappen is voor de behandeling Fluorescentie Patterns

Meer video's verkennen