Cryosectioning Gist Gemeenschappen is voor de behandeling Fluorescentie Patterns
26 december 2012
We presenteren een protocol voor het invriezen en cryosectioning gist gemeenschappen om interne patronen van fluorescerende cellen te observeren. De methode is gebaseerd op methanol-fixing en OCT-inbedding van de ruimtelijke verdeling van cellen te behouden zonder het inactiveren van fluorescerende eiwitten binnen een gemeenschap.
Het algemene doel van het volgende experiment is om doorsneden van gistgemeenschappen te produceren om de ruimtelijke verdeling van verschillende fluorescente celpopulaties binnen een gemeenschap te onderzoeken. Dit wordt bereikt door eerst de gemeenschap te bevriezen en vervolgens te fixeren met methanol om de ruimtelijke verdeling van cellen in de gemeenschap te behouden. Als tweede stap wordt het methanol verdampt om penetratie van de inbeddings-OCT-verbinding mogelijk te maken.
De ingebedde gemeenschap wordt vervolgens bevroren ter voorbereiding op cryosecteren. Vervolgens worden cryo ome-secties gemaakt. De gemeenschap en doorsneden kunnen onder een fluorescentiemicroscoop worden afgebeeld. Er worden resultaten verkregen die de ruimtelijke verdeling van fluorescente celpopulaties binnen een gemeenschap tonen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals optisch secteren, is dat het de ruimtelijke verdeling van populaties diep in deze gemeenschappen onthult. Om deze procedure te starten, kweekt u gistgemeenschappen op een membraanfilter. Dit protocol komt overeen met een typische gemeenschap van minder dan twee keer 10 tot de achtste cellen op een membraanfilter met een diameter van zes millimeter, vervolgens in een min 20 graden Celsius vriezer.
Om een grotere mate van fluorescentie te behouden, gebruikt u een stuk watman 5 4 1 filterpapier om de bodem van een diameter van een centimeter te bedekken. Dit filterpapier wordt gebruikt als drager om de gemeenschap over te brengen. In latere stadia voegt u een milliliter min 20 graden Celsius, 100% methanol toe aan de put en laat u de put op min 20 graden Celsius staan tot de temperatuur in evenwicht is. Bevriest nu de gistgemeenschap door met een pincet de membraanfilter met de gemeenschap gedurende minimaal 15 seconden in vloeibare stikstof te dompelen.
Breng vervolgens de bevroren gemeenschap over naar de put met min 20 graden Celsius. Methanol in de vriezer zorgt ervoor dat de gemeenschap horizontaal blijft. Wanneer u het onderdompelt in het methanol, wacht u 20 minuten, het membraanfilter begint in het methanol te desintegreren.
Na 20 minuten, brengt u de gemeenschap over met behulp van de drager watman-filterpapier van de methanolput naar een koude petrischaal die op min 20 graden Celsius wordt bewaard. Houd bij het overbrengen de gemeenschap bovenop de drager Watman-filter. Verwijder extra druppels methanol met behulp van een ander stuk dik watman-papier voordat u het in de koude petrischaal plaatst.
Dit zorgt ervoor dat de methanolverdampingstijd consistent is van monster tot monster. Wacht vier tot zes uur tot het methanol is verdampt. Het beëindigen van de verdamping op het juiste moment is cruciaal voor het succes van deze procedure.
Om overmatig drogen van het monster te voorkomen, controleert u de toestand van de gistgemeenschap periodiek tijdens de verdamping, terwijl het methanol verdampt. Maak een rechthoekige kubusvormige aluminiumfolie container die groot genoeg is zodat het monster minimaal ongeveer twee millimeter marges van elke kant heeft. Voeg een druppel OCT toe aan de bodem van deze container om ervoor te zorgen dat het monster van alle kanten door OCT wordt omringd.
Wanneer de verdamping voltooid is, haalt u het monster uit de min 20 graden Celsius vriezer. Snijd de delen van het filterpapier weg die niet door de gistgemeenschap worden bedekt. Het is belangrijk om deze stap snel uit te voeren.
Om overmatig drogen van het monster te voorkomen. Plaats de gemeenschap op het onderste oppervlak van de aluminiumfolie container en bedek het monster onmiddellijk met OCT tot drie tot vier millimeter boven de hoogte van de gemeenschap. Wacht 10 minuten.
Plaats tenslotte het OCT-ingebekte monster op een metalen plaat op droog ijs om de bevroren gemeenschappen bij min 20 graden Celsius of min 80 graden Celsius te bewaren. Bereid u voor op het secteren van bevroren gemeenschappen door de temperatuur van de cryosectiekamer in te stellen op min 25 graden Celsius. Laat de monsters in de kamer staan tot de temperatuur de temperatuur van de kamer bereikt.
Verwijder vervolgens het folie van het monster en snij het overtollige OCT af. Breng een druppel OCT aan op een cryo-montage en monteer het monster op de cryo-montage. Verspreid de OCT gelijkmatig op de zijkant van het monster met blootgestelde watman-filterpapier zodat de OCT-dikte twee tot drie millimeter is.
Zorg ervoor dat er een OCT-marge van twee tot drie millimeter aan alle kanten van het monster is, om de integriteit van de secties te behouden. Laat de OCT in de cryostatkamer bevriezen voordat u gaat secteren. Gebruik de zijden van de OCT-steekproefblokken om de steekproef ten opzichte van de mes te richten.
Als de steekproef niet ten opzichte van het mes is uitgelijnd, begint het secteren vanaf een hoek of zijkant van de steekproef. Pas de montage aan om ervoor te zorgen dat het mes een perfect verticale kant van de steekproefblokken snijdt. Typische secties voor gistgemeenschappen zijn ongeveer 14 micrometer dik.
Gebruik na het snijden van een sectie een microscoopglaasje dat op kamertemperatuur wordt bewaard om de sectie te verzamelen. Door het glaasje langzaam naar de gesneden sectie te bewegen, zal de sectie smelten en naar de microscoop overgaan. Tot 18 secties kunnen op één glaasje worden overgebracht.
Bewaar de glazen op koude temperaturen, bij voorkeur min 20 graden Celsius voordat u gaat beeldvormen. Signaalverlies is minimaal wanneer het gedurende één week op vier graden Celsius wordt bewaard voor maximaal fluorescent signaal. Beeldvorming moet onmiddellijk na het secteren worden uitgevoerd.
Representatieve fluorescentiebeelden van verticale dwarsdoorsneden van gistgemeenschappen die onder identieke omstandigheden zijn gekweekt, worden hier getoond. De gemeenschap bestaat uit twee fototrofe stammen van visier gelabeld met de fluorescente eiwitten. M cherry gevisualiseerd als rood en Y-E-G-F-P gevisualiseerd als groen concurrentie voor gedeelde bronnen, inclusief ruimte, leidt tot kolomvormige patronen zoals weergegeven in hun verticale dwarsdoorsneden.
Resoluties tot een enkele cel kunnen worden opgelost in dwar
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het bevriezen en cryoseceren van gistgemeenschappen om de interne patronen van fluorescente cellen te observeren. De methode maakt gebruik van methanol-fixatie en OCT-inbedding om de ruimtelijke verdeling van cellen te behouden terwijl fluorescente eiwitten behouden blijven.
Belangrijke onderdeel van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Fluorescentiemicroscopie
- Gistgemeenschappen
Achtergrond
- Het begrijpen van de ruimtelijke verdeling van cellen in gemeenschappen is cruciaal voor verschillende biologische studies.
- Fluorescente eiwitten worden vaak gebruikt om specifieke celpopulaties te labelen.
- Traditionele methoden kunnen de ruimtelijke rangschikking van cellen verstoren.
- Deze studie heeft tot doel een betrouwbare methode te bieden voor het behoud van celverdeling.
Doel van het onderzoek
- Om een protocol te ontwikkelen voor het observeren van fluorescente celpopulaties in gistgemeenschappen.
- Om de behoud van ruimtelijke verdeling tijdens het bevriezingsproces te garanderen.
- Om beeldvorming van dwarsdoorsneden met behulp van fluorescentiemicroscopie te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Bevriezing van gistgemeenschappen ter voorbereiding op cryoseceren.
- Gebruik van methanol-fixatie om de celverdeling te behouden.
- Verdamping van methanol om OCT-inbedding mogelijk te maken.
- Uitvoeren van cryoseceren en beeldvorming met een fluorescentiemicroscoop.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle behoud van fluorescente celpopulaties in dwarsdoorsneden.
- Duidelijke visualisatie van ruimtelijke verdeling binnen de gistgemeenschap.
- Demonstratie van de effectiviteit van de voorgestelde methode.
- Resultaten ondersteunen verdere studies over gistgemeenschapsdynamica.
Conclusies
- Het protocol behoudt effectief de ruimtelijke rangschikking van fluorescente cellen.
- Deze methode kan worden toegepast op verschillende studies met gist en andere microbiële gemeenschappen.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op deze bevindingen om celinteracties te verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding spatial organization in microbial communities is critical for de-risking target validation in antimicrobial and microbiome therapeutics. Cryosectioning yeast communities enables high-resolution fluorescence mapping of gene expression and cell distribution, supporting mechanistic insights into community function and stability. This approach enhances predictive confidence in preclinical models by preserving native spatial architecture without disrupting fluorescent reporters.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of spatial hypotheses in microbial communities by preserving fluorescent reporter patterns for target validation studies.
- Operational Value: Provides a reproducible method to assess gene expression localization without disrupting community integrity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively imageable sections for screening fluorescent reporters in spatially resolved microbial assays.
- Operational Value: Supports assay standardization through consistent cryosection thickness and fluorescence preservation across replicates.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates translational biomarker analysis by linking spatial gene expression patterns to community-level phenotypes in yeast models.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical evaluation by preserving spatial context in frozen, sectioned samples.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by enabling spatially resolved fluorescence readouts that inform target engagement and pathway modulation in microbial systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of spatial organization in microbial communities through preserved fluorescence imaging.
- Screening: Delivers assay-ready sections with quantitative fluorescence outputs for evaluating modulator effects on community structure.
- Analytics: Provides spatial fluorescence measurements that allow comparison of conditions based on internal organization patterns.
- Translational Research: Connects spatial gene expression to community function, supporting biomarker alignment in preclinical yeast models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for spatial profiling applicable across microbial strain panels and culture conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by revealing true spatial distribution of fluorescent populations, reducing artifacts from optical scattering.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fixation, embedding, and sectioning parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing spatially resolved data on target engagement in community contexts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated spatial mechanisms in microbial systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and cryostat operation for sectioning and imaging.
- Depends on cryostat, microtome, and fluorescence microscope infrastructure for section preparation and visualization.
- Necessitates standardization of fixation duration, OCT infiltration, and section thickness across teams.
- Involves adaptation considerations for different microbial community sizes and extracellular matrix compositions.
- Limited by tissue integrity during methanol evaporation and OCT embedding, requiring precise timing to avoid over-drying or poor infiltration.
