Name: Isolatie en analyse van Brain-afgezonderd Leukocyten uit Plasmodium berghei ANKA-geïnfecteerde muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Leer een methode om ontstekingsleukocyten uit hersenbloedvaten van Plasmodium berghei ANKA-geïnfecteerde muizen te isoleren. Deze techniek maakt kwantificering en fenotypische karakterisering mogelijk met flowcytometrie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag Miss Liana Mackiewicz bedanken voor technische bijstand. Dit werk werd mogelijk gemaakt door Victoriaanse Overheid van de Staat Operationele Infrastructuur Support en Australische regering National Health en Medical Research Council IRIISS en Project Grant 1031212.

1. Infectie van muizen met P. berghei-ANKA <ol><li> Ontdooi een portie van gecryopreserveerde P. berghei ANKA PRBC. </li><li> Juist remmen cerebrale malaria-resistente BALB / c donor muis (8-12 weken oud) met de twee handen beperking techniek. Injecteer muis met 100-200 pi PRBC met een 1 ml insulinespuit (28G naald). Routinematig, 1-2 donormuizen geïnjecteerd. </li><li> Op de dagen 4 tot 5 na infectie (pi) te verwijderen donor muis van kooi en plaats het op een werkstation of een wegwerp werkende pad. </li><li> Voorzichtig beperken de muis aan het eind van de staart en het gebruik van een klein schaartje knippen de staartpunt (ongeveer 1 mm). Als alternatief kan een kleine staart punctie met een 25 G naald worden uitgevoerd. </li><li> Breng een druppel bloed uit de staart van de muis ader aan het einde van een matte-end microscoopglaasje. </li><li> Plaats een tweede dia (spreader) op een hoek van 45 ° en een back in de bloeddruppel. Zodra het bloed verspreidt zich langs de rand, duw de spreider-slide evelleen de overkant van de microscoop dia om het bloeduitstrijkje maken. Laat het uitstrijkje aan de lucht drogen. </li><li> Fix bloeduitstrijkjes in 100% methanol gedurende 30 seconden en vervolgens vlek slides in vers bereid Giemsa gedurende 10 min.. </li><li> Spoel bloeduitstrijkje met stromend water gedurende 1 minuut, laat aan de lucht drogen en te onderzoeken schuif onder de microscoop (100x, olie-immersie). Inventariseer PRBC binnen 1.000 erytrocyten en bereken procent parasitemie. Donormuizen moeten bereiken parasitemie niveaus tussen 2,5-5% voordat ze kunnen worden ontlucht voor infectie van proefdieren. </li><li> Verzamel bloed van de donor muis door retro-orbitale bloeding met een gehepariniseerde micro-hematocriet capillair. Alle experimenten worden uitgevoerd in overeenstemming met de Walter &amp; Eliza Hall Instituut Animal Ethics Committee eisen. Afhankelijk van de lokale Animal Ethische Commissie heeft op andere eisen bloedingen procedures kunnen worden gebruikt. Los benodigde hoeveelheid bloed in RPMI medium bij een uiteindelijke concentratie van 1x10 6 pRBC/0.2 ml. Bedenk dateen gewone muis hematocriet is ~ 6x10 9 rode bloedcellen / 1 ml. </li><li> Infect experimentele C57BL / 6 muizen (8-12 weken oud) door injectie intraperitoneaal (ip) 1x10 6 pRBC/0.2 ml. </li><li> Om parasitemie niveaus van geïnfecteerde muizen te controleren volgt u de stappen 1,3-1,8. Parasitemie moet worden bepaald om de 2-3 dagen gestart op dag 2 of 3 pi </li><li> Ontstaan ​​van ernstige malaria in C57BL / 6 muizen zou kunnen manifesteren als gebogen uiterlijk, troefde bont en lage activiteit. Sommige muizen kan herstellen in dit stadium, maar progressie tot verlies van zelfrichtend reflex geeft onomkeerbare ziekte en dieren worden gedood. </li></ol> 2. Intracardiale Perfusie van Muizen en Brain Extraction <ol><li> Monteer een handmatige zwaartekracht perfusie systeem zorgen voor een 500 ml reservoir een kolom houder aan de top van een 60 cm kolom stand. Verbinding plastic slang aan de onderkant van het reservoir en zet een slangklem op buffer te regelen. Sluit de slang aan een 23 G naald. Fill tot het reservoir met PBS (bewaard bij 22 ° C), open klem en buffer te laten lopen door de slang om alle luchtbellen te verwijderen. </li><li> Euthanaseren P. berghei ANKA-geïnfecteerde muis door CO 2 inhalatie. Bevestig de dood door het ontbreken van pedaal, orbitale en respiratoire respons. </li><li> Pin euthanized muis door de achterpoten en de voorpoten dorsaal op een piepschuim dissectie board in een plastic bakje. Afhankelijk van de lokale Animal Ethische Commissie eisen anesthesie kan worden toegediend voorafgaand aanvang van intracardiale pefusion. </li><li> Veeg ventrale zijde met 70% ethanol. </li><li> Gebruik grote schaar en pincet voor de huid te openen langs de middellijn van de borstholte bloot te leggen. Vouw en speld de huid aan de zijkanten. </li><li> Houd het borstbeen met fijne tang en knip het middenrif en langs beide zijden van het borstbeen doorsnijden van de ribben. Zorg ervoor dat er geen grote bloedvaten beschadigen. </li><li> Speld de ribbenkast door het borstbeen losjes naast het hoofd. </li><li> Houd ventrikels with fijne tang en voorzichtig incise rechter atrium met fijne schaar. </li><li> Plaats 23G naald bevestigd aan de zwaartekracht perfusie systeem in linker ventrikel naar de aorta ascendens, terwijl PBS wordt uitgevoerd. Plaats slechts 0,5 cm van de naaldpunt. </li><li> Perfuseren muis gedurende 5 minuten of totdat effluent is duidelijk. </li><li> Losmaken muis en leg hem op zijn buik. Veeg hoofd met 70% ethanol. </li><li> Met grote schaar, een snede boven het cervicale ruggenmerg gebied. </li><li> Gebruik fijne schaar om een ​​mediane caudale-rostrale cut te beginnen bij de basis van de schedel en schil de huid weg naar de schedel bloot te leggen. </li><li> Die het hoofd plaatst de bladen van een kleine schaar in elk orbitale holte en een snede tussen de banen. </li><li> Maak een longitudinale snede langs de pijlnaad en zorgvuldig verwijderen van de schedel op elke hersenhelft naar buiten. </li><li> Met behulp van een spatel, til de hersenen en plaats deze in een 10 ml centrifugebuis die RPMI medium. </li></ol>3. Isolatie van Brain-afgezonderd Leukocyten (BSL) <ol><li> Werken in een veiligheidskast, vers geoogste hersenen plaats op een roestvrijstalen celzeef (40-60 maaswijdte) in een petrischaal met 3-5 ml van RPMI weefselkweekmedium. </li><li> Snijd hersenweefsel in kleine stukjes. </li><li> Druk kleine stukjes hersenweefsel door de cel zeef met behulp van een kristal plunjer. </li><li> Overdracht hersenhomogenaat een 10 ml en centrifugeer bij 250 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Los pellet in 3 ml RPMI-medium, dat 0,05% Collagenase D en 2U/ml DNAse I. </li><li> Draai mengsel gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Verwijder de celresten door op het mengsel door een 70 pm nylon celzeef en / of door incubatie op ijs gedurende 5 minuten. </li><li> Leg hersenhomogenaat op een 7 ml 30% Percoll kussen en centrifugeer bij 400 xg (zonder rem) gedurende 20 min bij kamertemperatuur. </li><li> Hersuspendeer pellet in 1 ml rode bloedcellen lysis buffer en incubeer op ijs gedurende 5 minuten totlyseren hechtende PRBC, die niet konden uit de hersenen worden verwijderd door intracardiale perfusie. </li><li> Voeg 9 ml van RPMI medium, wassen cellen en centrifugeer bij 250 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer BSL-bevattende pellet in 50-100 pi RPMI medium en overdracht cellen aan een Eppendorf buis. </li><li> Verdun een 5-10 pi aliquot van het celmonster 1:2 in Trypan blauw voor identificatie van levensvatbare cellen. </li><li> Tellen levensvatbare cellen onder de microscoop met een hemocytometer. Vanaf dag 6 pi verder, toen P. berghei ANKA-geïnfecteerde muizen weer te geven neurologische symptomen, 20.000-100.000 BSLs kan worden hersteld. </li></ol> 4. Immunofenotypering van BSL door meerkleuren flowcytometrie <ol><li> Centrifugeer cellen bij 250 xg gedurende 10 min bij 4 ° C, zuig de supernatant en resuspendeer pellet in 50 ul kleuring buffer (PBS, 1% foetaal kalf serum (FCS), 2 mm EDTA). </li><li> Voeg 1 pl gezuiverd anti-CD16/32 antilichaam (Fcblock). </li><li> Incubeer cellen gedurende 10 min op ijs. </li><li> Was de cellen met 1 ml Buffer kleuring. Centrifugeer cellen bij 250 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en zuig de supernatant. </li><li> Resuspendeer cellen in 50 ul Buffer Kleuring met vooraf bepaalde optimale verdunningen van gekozen fluorescente antilichamen, anti-CD4, anti-CD8, anti-TCR en anti-NK1.1. </li><li> Incubeer gedurende 1 uur op ijs. </li><li> Was de cellen met 1 ml Buffer kleuring. Centrifugeer cellen bij 250 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en zuig de supernatant. </li><li> Resuspendeer cellen in 100 ul PBS. </li><li> Breng cellen een flowcytometrie plastic buis. </li><li> Met een flow cytometer, ten minste het 5.000-10.000 events. Geschikte unstained cel controles en fluorochroom vergoeding monsters moeten worden opgenomen, zoals vereist. </li><li> Analyseer de resultaten met behulp van geschikte flowcytometrie software. </li></ol>

<ol><li>Brian de Souza, J., Riley, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+malaria%3A+the+contribution+of+studies+in+animal+models+to+our+understanding+of+immunopathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Cerebral malaria: the contribution of studies in animal models to our understanding of immunopathogenesis.</a> Microbes and Infection. 4, 291-300 (2002).</li>
<li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nature. 5, 722-735 (2005).</li>
<li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenic+basis+of+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415, 673-679 (2002).</li>
<li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> Journal of neuroinflammation. 9, 50(2012).</li>
<li>LaFrance-Corey, R. G., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Brain-infiltrating+Leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes.</a> J. Vis. Exp. (52), e2747(2011).</li>
<li>Lim, S. M., Koraka, P., Osterhaus, A. D., Martina, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((West+Nile+virus%3A+immunity+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">West Nile virus: immunity and pathogenesis.</a> Viruses. 3, 811-828 (2011).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+pathogenic+role+of+brain-sequestered+alphabeta+CD8%2B+T+cells+in+experimental+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">On the pathogenic role of brain-sequestered alphabeta CD8+ T cells in experimental cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 169, 6369-6375 (2002).</li>
<li>Campanella, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+receptor+CXCR3+and+its+ligands+CXCL9+and+CXCL10+are+required+for+the+development+of+murine+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemokine receptor CXCR3 and its ligands CXCL9 and CXCL10 are required for the development of murine cerebral malaria.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 105, 4814-4819 (2008).</li>
<li>Hansen, D. S., Bernard, N. J., Nie, C. Q., Schofield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+stimulate+recruitment+of+CXCR3%2B+T+cells+to+the+brain+during+Plasmodium+berghei-mediated+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">NK cells stimulate recruitment of CXCR3+ T cells to the brain during Plasmodium berghei-mediated cerebral malaria.</a> Journal of Immunology. 178, 5779-5788 (2007).</li>
<li>Amante, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+natural+regulatory+T+cells+in+the+pathogenesis+of+experimental+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">A role for natural regulatory T cells in the pathogenesis of experimental cerebral malaria.</a> The American journal of pathology. 171, 548-559 (2007).</li>
<li>Nie, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IP-10-mediated+T+cell+homing+promotes+cerebral+inflammation+over+splenic+immunity+to+malaria+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">IP-10-mediated T cell homing promotes cerebral inflammation over splenic immunity to malaria infection.</a> PLoS pathogens. 5, e1000369(2009).</li>
<li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+malaria+parasite+sequestration%3A+CD36+is+the+major+receptor%2C+but+cerebral+pathology+is+unlinked+to+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 11468-11473 (2005).</li>
<li>Nitcheu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin-dependent+brain-infiltrating+cytotoxic+CD8%2B+T+lymphocytes+mediate+experimental+cerebral+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunololgy%22%5BJournal%5D)">Perforin-dependent brain-infiltrating cytotoxic CD8+ T lymphocytes mediate experimental cerebral malaria pathogenesis.</a> Journal of Immunololgy. 170, 2221-2228 (2003).</li>
<li>Lundie, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-stage+Plasmodium+infection+induces+CD8%2B+T+lymphocytes+to+parasite-expressed+antigens%2C+largely+regulated+by+CD8alpha%2B+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Blood-stage Plasmodium infection induces CD8+ T lymphocytes to parasite-expressed antigens, largely regulated by CD8alpha+ dendritic cells.</a> Proceeding of the National Academy of Science U S A. 105, 14509-14514 (2008).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De isolatie en analyse van BSL is een methode die karakterisering en kwantificering van inflammatoire cellen migreren naar de hersenen in reactie op weefselbeschadiging of infectie in experimentele muismodellen maakt. De invoering van een intracardiale perfusie stap voor het verwijderen van het bloedcompartiment voor orgaanextractie en latere celisolatie is nuttig om contaminatie van inflammatoire cellen met niet-inflammatoire circulerende leukocyten voorkomen. Dit is misschien niet een essentiële vereiste in neurotrope...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Oplossingen en buffers </td></tr><tr><td> Giemsa&#39;s azur eosine methyleenblauw-oplossing </td><td> Merck Millipore </td><td> 1.09204.0500 </td><td> 1:10 verdunning in gedestilleerd water </td></tr><tr><td> RPMI medium </td><td></td><td></td><td> Muis tonus </td></tr><tr><td> Muis tonus PBS </td><td></td><td></td><td> 20 mM natriumfosfaat, 0,149 NaCl, pH 7,3 </td></tr><tr><td> 0,4% Trypan Blue </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T-8154 </td><td> 1:2 verdunning </td></tr><tr><td> Collagenase D </td><td> Worthington Biochemical </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deoxyribonuclease (DNAse) I </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D4263-5VL </td><td> Van runderpancreas </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0891-01 </td><td> 30% oplossing in PBS </td></tr><tr><td> Ultrapuur Tris </td><td> Invitrogen </td><td> 15505-020 </td><td></td></tr><tr><td> Ammonium Chloride (NH4Cl) </td><td> AnalaR </td><td> 10017 </td><td></td></tr><tr><td> Red Cell Lysis Buffer </td><td></td><td></td><td> 17 mM Tris, 14 nm NH 4 Cl, pH 7,2 </td></tr><tr><td> FCS </td><td> Gibco </td><td> 1009 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA dinatriumzout </td><td> Merck </td><td> 10093.5V </td><td> 0,1 M, pH 7,2 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Antilichamen en conjugaten </td></tr><tr><td> Anti-muis CD16/CD32 (Fc Block), kloon 2.4G2 </td><td> BD Pharmingen </td> &lt;td&gt; 553142 </td><td> 1 ul in 50 ul buffer kleuring (0.5mg/50 ml) </td></tr><tr><td> FITC-anti-muis CD4, kloon H129.19 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553651 </td><td></td></tr><tr><td> PE-anti-muis NK1.1, kloon PK136 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553165 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5-anti-muis CD8, kloon 53-6-7 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551162 </td><td></td></tr><tr><td> APC-anti-muis TCR-β, kloon H57-597 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553174 </td><td></td></tr><tr><td> PE-anti-muis CXCR3, clone 220803 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> FAB1685P </td><td></td></tr><tr><td> Gebiotinyleerd-anti-muis CCR5, kloon C34-3448 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559922 </td><td></td></tr><tr><td> Steptavidin-PerCP-Cy5.5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 551419 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Apparatuur en materiaal </td></tr><tr><td> SuperFrost microscoopglaasje </td><td> Lomb Menzel-Glaser </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissection tang, schaar </td><td> REDA Instrumente </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 500 ml PBS reservoir </td><td> Nalgene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rubber slangen </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 23G naald </td><td> BD PrecisionGlide </td><td> 302008 </td><td></td></tr><tr><td> Cell dissociatie kit met metalen zeef </td><td> Sigma Aldrich </td><td> CD-1 </td><td></td></tr><tr><td> 70 pm nylon celzeef </td><td> BD Falcon </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> Hemocytometer </td><td> GmbH Neubauer </td><td> 717810 </td><td></td></tr><tr><td> Flowcytometrie buizen </td><td> BD Falcon </td><td> 352008 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie en analyse van brain-afgezonderd leukocyten uit<em&gt; plasmodium berghei</em&gt; anka-geïnfecteerde muizen

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

We beschrijven een werkwijze voor isolatie en karakterisering van hechtende ontstekingscellen uit hersenen bloedvaten P. berghei ANKA-geïnfecteerde muizen. Infectie van gevoelige muizen-stammen met deze parasiet stam resulteert in de inductie van experimentele cerebrale malaria, een neurologisch syndroom dat recapituleert bepaalde belangrijke aspecten van Plasmodium falciparum-gemedieerde ernstige malaria in mensen 1,2. Rijpe vormen van bloed-stage malaria expressie parasitaire eiwitten op het oppervlak van de geïnfecteerde erythrocyten, waardoor ze binden aan vasculaire endotheelcellen. Dit proces leidt tot verstoppingen in de bloedstroom, wat resulteert in hypoxie en bloedingen 3 en stimuleert ook de werving van inflammatoire leukocyten naar de plaats van parasiet vastlegging. In tegenstelling tot andere infecties, zoals virussen neutrotopic 4-6, zowel malaria-geparasiteerde rode bloedcellen (PRBC) en geassocieerde InflammAtory leukocyten blijven afgezonderd binnen de bloedvaten in plaats van te infiltreren in de hersenen parenchym. Dus om contaminatie van afgezonderd leukocyten met niet-inflammatoire circulerende cellen, uitgebreide intracardiale perfusie van geïnfecteerde-muizen voorafgaand aan orgaanextractie en weefsel verwerking wordt verontreinigd is nodig in deze procedure om het bloed compartiment te verwijderen. Na perfusie, zijn hersenen geoogst en ontleed in kleine stukjes. De weefselstructuur wordt verder verstoord door enzymatische behandeling met collagenase en D DNAse I. De resulterende hersenhomogenaat wordt vervolgens gecentrifugeerd op een Percoll-gradiënt die scheiding van hersenen gesekwestreerde leukocyten (BSL) van myeline en andere weefselafval maakt. Geïsoleerde cellen worden vervolgens gewassen, geteld met een hemocytometer en gekleurd met fluorescente antilichamen voor verdere analyse door flowcytometrie. Deze procedure maakt uitgebreide fenotypische karakterisatie van inflammatoire leukocyten migreren naar de hersenen in rereactie op verschillende stimuli, waaronder beroerte alsook virale of parasitaire infecties. De werkwijze verschaft ook nuttig voor het beoordelen van nieuwe anti-inflammatoire behandelingen in preklinische diermodellen.

De resultaten in Fig. 2 tonen percentages en absolute aantallen van de verschillende BSL populaties hersteld van hersenen van geperfundeerde of unperfused malaria geïnfecteerde en naïef controle muizen. BSL geïsoleerd werden gekleurd met PE-anti-NK1.1 en APC-anti-TCR-β antilichamen zoals aangegeven in de tekst Protocol. Consistent met eerdere bevindingen 7-9, αβTCR + T-cellen bestaat een groot deel van de BSL pool in hersenen van geperfundeerde malaria geïnfecteerde muizen (dag 6 pi). Deze populati...

Werkwijze voor isolatie van hechtende inflammatoire leukocyten uit hersenen bloedvaten<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-geïnfecteerde muizen beschreven. De werkwijze maakt kwantificering en fenotypische karakterisatie van leukocyten geïsoleerd na kleuring met fluorescente antilichamen en daaropvolgende analyse door flowcytometrie.

Isolatie en analyse van Brain-afgezonderd Leukocyten uit<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-geïnfecteerde muizen

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Het algemene doel van deze procedure is om adherante inflammatoire leukocyten te isoleren uit hersenbloedvaten van door plasmodium burge eye anca geïnfecteerde muizen om experimentele cerebrale malaria te induceren. Muizen worden geïnfecteerd met plasmodium berge eye anca geparasiteerde rode bloedcellen door injectie. Nadat de muizen tekenen van de ziekte beginnen te vertonen, worden de circulerende cellen van malaria geïnfecteerde muizen verwijderd door intraorale perfusie.De hersenen worden vervolgens geoogst en het weefsel wordt met enzymen verteerd om de isolatie van inflammatoire leukocyten mogelijk te maken. Multikleurige flowcytometrie wordt vervolgens uitgevoerd om immunofenotypering uit te voeren. De analyse van de gesequestreerde leukocyten in de hersenen van de verkregen gegevens geeft het percentage en de absolute aantallen leukocyten weer die migreren naar de hersenen van muizen met malaria.Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van malaria pathogenese te beantwoorden, zoals welk type inflammatoire cellen migreren naar de plaats van parasietsequestrati in de hersenen van geïnfecteerde dieren onder verschillende experimentele omstandigheden. Visuele d

isolation-analysis-brain-sequestered-leukocytes-from-plasmodium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Intravitale microscopie om temporele en ruimtelijke hemodynamische en inflammatoire gebeurtenissen in de pial microcirculatie te volgen.

Intravitale Microscopie van de hersenen van muizen microcirculatie met behulp van een gesloten Cranial Window

Een snelle methode om te infiltreren leukocyten te verkrijgen van de muis hersenen wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van een continue en discontinue gradiënt Percoll Ficoll gradiënt te selecteren en te zuiveren van de leukocyten-verrijkte laag. Geïsoleerde leukocyten kan dan worden gekenmerkt door flowcytometrische metingen.

Isolatie van Brain-infiltrerende leukocyten

This video demonstrates the generation of an experimental mouse model of cerebral malaria. Sporozoites isolated from Plasmodium berghei-infected female mosquitoes are injected into a restrained mouse's tail veins, leading to blood-brain barrier disruption and brain inflammation, causing cerebral malaria. This infected mouse model offers a valuable tool to study in vivo microvascular pathology associated with cerebral malaria.

Generation of a Mouse Model of Experimental Cerebral Malaria Using Host Mosquito-Derived Sporozoites

This video demonstrates an assay for immunizing a mouse model with live attenuated sporozoites. The radiation-attenuated Plasmodium sporozoites are injected into the dorsal side of the mouse's ear. After injections at multiple locations on both ears, the mouse is allowed to recover.

Intradermal Immunization with Live Attenuated Sporozoites in a Mouse Model

De malariaparasiet binnenvalt en herhalingen binnen de rode bloedcellen. Nauwkeurige vaststelling van de merozoïet invasie en parasitemia is daarom van cruciaal belang bij de beoordeling van het verloop van de malaria-infectie. Hier beschrijven we een flowcytometrie gebaseerd protocol voor het meten van deze parameters in een muismodel van malaria.

In vivo evaluatie van het knaagdier Plasmodium parasitemia en merozoïet Invasion van flowcytometrie

We beschrijven hier een protocol voor het isoleren van myeloïde cellen uit muizenhuid en drainerende lymfknoop na intradermale injectie van Plasmodium sporozoïeten. Stroomcytometrie van de verzamelde cellen biedt een betrouwbare test om de ontstekingsreactie in de huid en de drainerende lymfknoop op de parasiet te karakteriseren.

Myeloïde Cell Isolatie van Mouse Skin en aftappen lymfkliertest Na Intradermal Immunisatie met levende verzwakte<em&gt; Plasmodium</em&gt; sporozoieten

We beschrijven een muismodel van experimentele cerebrale malaria en laten zien hoe inflammatoire en microvasculaire pathologie in vivo kunnen worden gevolgd met behulp van magnetische resonantie beeldvorming.

In vivo Tracking van Oedema Ontwikkeling En Microvasculaire Patologie In Een Model Van Experimentele Cerebrale Malaria Met Magnetic Resonance Imaging

Als gevolg van de opvallende gelijkenissen van de levenscyclus en de biologie van knaagdieren malariaparasieten voor menselijke malariaparasieten, knaagdieren malaria modellen zijn onmisbaar geworden voor malaria onderzoek. Hierin hebben we enkele van de belangrijkste technieken gestandaardiseerd die worden gebruikt in de fenotypische analyse van wild-type en transgene knaagdier malaria soorten.

Fenotypische analyse van knaagdieren malaria parasiet asexual en seksuele bloed stadia en muggen stadia

Het algemene doel van dit protocol is om te instrueren hoe te extraheren, te onderhouden, en scheiden murine astrocyt en microglia cellen uit het centrale zenuwstelsel, gevolgd door infectie met protozoa parasieten.

Gelijktijdige isolatie van primaire astrocyten en Microglia voor Protozoa-parasietinfectie

Tot op heden zijn protocollen voor de gelijktijdige isolatie van alle belangrijke celtypen van het centrale zenuwstelsel uit dezelfde muis een onvervulde vraag. Het protocol toont een procedure die toepasbaar is bij naïeve en experimentele auto-immuun encefalomyelitis-muizen om complexe cellulaire netwerken tijdens neuro-inflammatie te onderzoeken en tegelijkertijd het vereiste aantal muizen te verminderen.

Gelijktijdige isolatie van de belangrijkste celtypen van het centrale zenuwstelsel van volwassen auto-immuun encefalomyelitis-muizen

De seksuele ontwikkeling van Plasmodium vindt plaats in de middendarm van de mug. Het richten op de seksuele stadia van de parasiet is een veelbelovende strategie om de overdracht te blokkeren. We ontwikkelden Ookluc, een transgene P. berghei die nanoluciferase tot expressie brengt na de vorming van zygoten, waardoor high-throughput screening van transmissieblokkerende verbindingen mogelijk is. In dit artikel worden de methoden voor screening met Ookluc beschreven.

Ookluc: een Plasmodium berghei-lijn voor het identificeren van transmissieblokkerende verbindingen

Leer een methode om ontstekingsleukocyten uit hersenbloedvaten van Plasmodium berghei ANKA-geïnfecteerde muizen te isoleren. Deze techniek maakt kwantificering en fenotypische karakterisering mogelijk met flowcytometrie.

Isolatie en analyse van Brain-afgezonderd Leukocyten uit

Meer video's verkennen