Isolatie en analyse van Brain-afgezonderd Leukocyten uit Plasmodium berghei ANKA-geïnfecteerde muizen
2 januari 2013
Werkwijze voor isolatie van hechtende inflammatoire leukocyten uit hersenen bloedvaten Plasmodium berghei ANKA-geïnfecteerde muizen beschreven. De werkwijze maakt kwantificering en fenotypische karakterisatie van leukocyten geïsoleerd na kleuring met fluorescente antilichamen en daaropvolgende analyse door flowcytometrie.
Het algemene doel van deze procedure is om adherante inflammatoire leukocyten te isoleren uit hersenbloedvaten van door plasmodium burge eye anca geïnfecteerde muizen om experimentele cerebrale malaria te induceren. Muizen worden geïnfecteerd met plasmodium berge eye anca geparasiteerde rode bloedcellen door injectie. Nadat de muizen tekenen van de ziekte beginnen te vertonen, worden de circulerende cellen van malaria geïnfecteerde muizen verwijderd door intraorale perfusie.
De hersenen worden vervolgens geoogst en het weefsel wordt met enzymen verteerd om de isolatie van inflammatoire leukocyten mogelijk te maken. Multikleurige flowcytometrie wordt vervolgens uitgevoerd om immunofenotypering uit te voeren. De analyse van de gesequestreerde leukocyten in de hersenen van de verkregen gegevens geeft het percentage en de absolute aantallen leukocyten weer die migreren naar de hersenen van muizen met malaria.
Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van malaria pathogenese te beantwoorden, zoals welk type inflammatoire cellen migreren naar de plaats van parasietsequestrati in de hersenen van geïnfecteerde dieren onder verschillende experimentele omstandigheden. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal. De perfusiestappen zijn moeilijk te leren omdat ze zowel snelheid als zorg vereisen om geen significante bloedvaten te beschadigen. Het demonstreren van sommige delen van deze procedure zal worden gedaan door Leanna Mcic, een dierentechnicus, Ms. Victoria, Rick, een promovendus, en Dr. Lisa Aez, een postdoc uit mijn laboratorium.
Begin dit protocol door de muizen te infecteren met p berge eye anca. Ontdooi een gecryopreserveerde aliquot van P berge eye anca geparasiteerde rode bloedcellen of pbcs door het op kamertemperatuur te laten komen. Verwijder een acht tot 12 weken oude donormuis uit zijn kooi en plaats deze op een werkstation. Pak de scruff van de nek tussen de wijsvinger en de duim.
Draai de muis om en injecteer 100 tot 200 microliters van plasmodium berge eye in de buikholte. Gewoonlijk worden twee donormuizen geïnjecteerd met pbcs. Na het injecteren, plaats de muizen in hun kooi vier tot vijf dagen na de infectie.
Verwijder een donormuis uit zijn kooi en plaats deze op een werkstation. Plaats een druppel bloed van de staartader van de muis in de buurt van het einde van een bevroren eind microscoopglas. Plaats een tweede glas op een hoek van 45 graden en steek het in de druppel bloed.
Zodra het bloed zich langs de rand verspreidt, duwt u de spreider gelijkmatig over het microscoopglas om de bloeduitstrijk te maken. Laat de uitstrijk drogen om de bloeduitstrijk te fixeren. Dompel de glazen in 100% methanol gedurende 30 seconden.
Vervolgens kleurt u de glazen in vers bereidde GIM ZA gedurende 10 minuten. Na het kleuren met gim za, spoelt u het glas met stromend water gedurende 30 seconden. Laat het glas drogen en onderzoek het vervolgens onder de microscoop met behulp van de 100 x olie-immersielens. Tel de PRBC binnen duizend erytrocyten en bereken het procent para als de donormuis de vereiste niveaus van 2,5 tot 5% Parsit heeft bereikt. Verzamel bloed van de donormuis door cardiale punctie onder anesthesie of retroorbitale bloeding met behulp van een heparine-gecoate micro hematocriet capillair buis.
Los het bloed op in RPMI medium met een eindconcentratie van een keer 10 tot zes PRBC per 0,2 milliliter per muis. Overweeg dat een normale muis hematocriet ongeveer zes keer 10 tot de negende rode bloedcellen per milliliter is. In feite, acht tot 12 weken oude experimentele C 57 zwarte zes muizen door één keer 10 tot de zesde PRBC in 0,2 milliliter intraperitoneaal te injecteren zoals eerder.
Om de para niveaus van geïnfecteerde muizen te monitoren, bereid een bloeduitstrijk zoals eerder. Para moet worden bepaald elke twee tot drie dagen, beginnend op dag twee of drie na infectie vanaf dag vijf. Na infectie.
Muizen worden dagelijks gemonitord op tekenen van ernstige malaria zodra de para niveaus groter zijn dan 5% en muizen neurologische symptomen vertonen rond dag zes na infectie. De geïnfecteerde muizen worden geëuthanaseerd door CO2 inademing en onmiddellijk geperfundeerd met PBS zoals beschreven in het bijbehorende document. Het moeilijkste aspect van deze procedure is de intracardiale perfusie.
Een reeks tips voor probleemoplossing zijn hier geschetst. Met de muis vastgemaakt op een styrofoam dissectiebord. Binnen een dissectielade. Veeg de ventrale kant af met 70% ethanol en gebruik vervolgens grote schaar en pincet om de huid langs de middenlijn open te snijden om de borstholte bloot te leggen, vouw en speldt de huid aan de zijden vast.
Houd het borstbeen vast met fijne pincet en snijd het diafragma en langs beide zijden van het borstbeen door, waardoor de ribben worden afgesneden. Zorg ervoor dat u geen grote bloedvaten beschadigt. Speld de ribbenkast vast door het borstbeen losjes naast het hoofd.
Houd de ventrikels vast met fijne pincet en snij voorzichtig de rechter atrium in met fijne schaar. Voeg een 23 gauge naald toe die is bevestigd aan het zwaartekrachtperfusiesysteem in de linker ventrikel richting de opgaande aorta. Terwijl PBS stroomt, steekt u slechts 0,5 centimeter van de naaldpunt in en perfundeert u de muis gedurende vijf minuten of totdat de effluent helder is.
Na de interale perfusie, dissecteer de hersenen en plaats deze in een 10 milliliter centrifugebuis met RPMI.Medium. Plaats de vers geoogste hersenen bovenop een 40 tot 60 maasgrootte roestvrijstalen celfilter in een petrischaal met drie tot vijf milliliter RPMI weefselkweekmedium. Snijd het hersenweefsel in kleine stukjes.
Gebruik vervolgens een kristalplunger om kleine stukjes hersenweefsel door het celfilter te duwen. Breng het hersenhomogenaat over in een 10 milliliter buis en centrifugeer deze gedurende 10 minuten bij 250 keer G bij vier graden Celsius. Gooi na het centrifugeren de supernatant weg en los het pellet op in drie milliliter RPMI
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het isoleren van adherante inflammatoire leukocyten uit de hersenbloedvaten van met Plasmodium berghei ANKA geïnfecteerde muizen. De techniek maakt kwantificering en fenotypische karakterisering van deze leukocyten mogelijk met behulp van fluorescerende antilichamen en flowcytometrie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Immunologie
- Besmettelijke ziekten
Achtergrond
- Experimentele cerebrale malaria wordt geïnduceerd bij muizen die geïnfecteerd zijn met Plasmodium berghei ANKA.
- Het begrijpen van de rol van inflammatoire leukocyten in de hersenen is cruciaal voor het bestuderen van malariapathologie.
- Isolatie van deze cellen maakt een gedetailleerde analyse van hun kenmerken en gedrag mogelijk.
- Flowcytometrie is een krachtig hulpmiddel voor immunofenotypisering van leukocyten.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het isoleren van leukocyten uit de hersenen.
- Om de inflammatoire respons tijdens malaria-infectie te kwantificeren en te karakteriseren.
- Om het begrip van de immuunmechanismen die bij cerebrale malaria betrokken zijn, te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Muizen worden geïnfecteerd met Plasmodium berghei ANKA via injectie van geparasiteerde rode bloedcellen.
- Intraorale perfusie wordt uitgevoerd om circulerende cellen uit malaria-geïnfecteerde muizen te verwijderen.
- Hersenweefsel wordt geoogst en gedigesteerd met enzymen om leukocyten te isoleren.
- Multicolor flowcytometrie wordt uitgevoerd voor immunofenotypisering van de geïsoleerde cellen.
Belangrijkste resultaten
- De methode isoleert met succes adherante inflammatoire leukocyten uit hersenbloedvaten.
- Flowcytometrie-analyse onthult het percentage en de absolute aantallen leukocyten die naar de hersenen migreren.
- Fenotypische karakterisering geeft inzicht in de immuunrespons tijdens malaria-infectie.
- De resultaten dragen bij aan een beter begrip van de pathofysiologie van cerebrale malaria.
Conclusies
- De isolatiemethode is effectief voor het bestuderen van inflammatoire leukocyten in de context van malaria.
- De bevindingen kunnen toekomstig onderzoek naar therapeutische strategieën voor cerebrale malaria informeren.
- Deze aanpak kan worden toegepast op andere modellen van neuro-inflammatie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Isolation and phenotypic analysis of brain-sequestered leukocytes in Plasmodium berghei ANKA-infected mice addresses a critical need for mechanistic de-risking in neuroinflammatory disease models. This method enables precise quantification and characterization of inflammatory cell migration to the brain vasculature, supporting predictive confidence in target validation and translational research for neuroinflammation and infectious disease portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune cell recruitment and phenotype at sites of vascular sequestration.
- Supports biological de-risking by distinguishing inflammatory from non-inflammatory leukocyte populations.
- Facilitates functional target validation for anti-inflammatory or immunomodulatory interventions in preclinical models.
Screening & Assay Development
- Provides a validated workflow for preparing brain-sequestered leukocytes for downstream flow cytometry analysis.
- Ensures assay reproducibility by standardizing perfusion and tissue processing steps to minimize contamination.
- Generates quantitative outputs suitable for comparative compound evaluation in screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models of cerebral malaria and neuroinflammation for translational biomarker studies.
- Enables continuity from mechanistic discovery to preclinical assessment of therapeutic candidates targeting leukocyte migration or activation.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust immune cell phenotyping data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven analysis of immune cell dynamics in disease-relevant mouse models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on leukocyte recruitment and phenotype in response to infection or intervention.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative flow cytometry data for immune cell profiling.
- Analytics: Provides absolute and relative leukocyte counts, enabling statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges mechanistic findings to preclinical efficacy studies in neuroinflammatory disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized protocol adaptable to other neuroinflammatory or infectious disease research pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in immune cell targeting strategies and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of immune cell isolation and analysis workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for immunomodulatory candidates and improves capital allocation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of assets targeting neuroinflammatory pathways.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in animal perfusion, tissue processing, and flow cytometry.
- Demands access to specialized instrumentation for cell isolation and multicolor flow cytometry analysis.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of perfusion and staining protocols to ensure data comparability.
- Adaptable to other disease models with appropriate validation of tissue processing steps.
- Potential limitations include technical variability in perfusion and cell recovery, impacting downstream analysis.
