Elektroporatie van de hindbrain om Axonale Trajectories en Synaptic Doelen Trace in de Chick Embryo
29 mei 2013
Hoe neuronale netwerken zijn in de embryonale hersenen opgericht is een fundamentele vraag in ontwikkelingsstoornissen neurobiologie. Hier combineerden we een electroporatietechniek met nieuwe genetische hulpmiddelen, zoals Cre / Lox-plasmiden en piggyBac-gemedieerde DNA omzetting systeem in de aviaire hindbrain om dorsale interneurons labelen en volgen hun axonale projecties en synaptische doelen op verschillende ontwikkelingsstadia.
Het algemene doel van deze procedure is om specifieke subsets van neuronen in de achterste hersenen van een kuiken te labelen en hun axon-trajecten en doelen te traceren. Dit wordt bereikt door eerst een kleine ovale opening te maken in het midden van een embryo op dag 2,75. Vervolgens worden DNA-plasmiden in het achterste hersenin lumen geïnjecteerd.
Vervolgens wordt het achterste hersenen eenzijdig geëlektroporeerd om expressie van de constructen in de gewenste neuronale groep mogelijk te maken en worden de eieren geïncubeerd. Ten slotte wordt de hersenstam uit het hele embryo gedissecteerd voor flat mount voorbereiding of weefselsneden. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die axonale projecties en synaptische doelen in de achterste hersenen en het cerebellum in verschillende ontwikkelingsstadia laten zien door middel van immunofluorescente kleuring en microscopieanalyse.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van ontwikkelingsneurobiologie, zoals hoe specifieke neuronale cellen hun axonen projecteren en synaptische verbindingen vormen tijdens de embryonale ontwikkeling. Om voorbereid te zijn op elektroporatie, incubeer ze 65 tot 70 uur bij 37 tot 38 en een half graden Celsius totdat ze stadium 16 tot 17 bereiken. Terwijl de eieren incuberen, trek glas capillairen aan verbonden L-vormige gouden elektroden met een adapterhouder naar de pulsverteller.
Stel de elektroporatieparameters in op 25 volt, vijf pulsnummers, 45 milliseconden pulslengte en 300 pulsintervallen. Bereid een mondpijp met een 10 milliliter spuitnaald, paraformstrips, een zachte borstel, scherpe dissectiescharen en 25 milliliter steriel PBS. Bereid een geschikte mix van DNA-plasmiden voor en voeg fast green kleurstof toe om het geïnjecteerde DNA te visualiseren.
Wanneer de eieren de juiste ontwikkelingsfase hebben bereikt, haal ze uit de incubator en houd ze in horizontale positie. Gebruik 70% ethanol om de eierschalen schoon te maken. Behandel één ei per keer om embryonale blootstelling te minimaliseren.
Laat ze een tijdje aan de lucht met de punten van de schaar. Maak een gaatje bij de eipoel en verwijder met de spuit drie tot vier milliliter albumine. Gebruik de dissectiescharen om een kleine ovale opening te maken bij de bovenste horizontale pool van de eischaal.
Druppel tijdens het hele proces een paar druppels PBS op de embryo om uitdroging te voorkomen. Gebruik een mondpijp om een kleine hoeveelheid van het DNA-mengsel in de glazen capillair te laden. Plaats vervolgens het embryo met zijn achterste uiteinde in direct zicht.
Vervolgens, terwijl je de capillair ongeveer 45 graden houdt, penetreer je het achterste hersenin. Verwijder geen membraan rond het embryo zonder luchtbellen te vormen. Adem voorzichtig uit om de DNA-oplossing in het achterste hersenin lumen te injecteren.
De oplossing zal zich onmiddellijk na de DNA-injectie naar voren verspreiden. Plaats de parallelle elektroden op de precieze doelwitten AP en DV van het achterste hersenin. Zonder het hart aan te raken, duwt u de elektroden lichtjes ventraal en geeft u een puls.
De elektroden moeten bedekt zijn met bubbels om elektrische geleidbaarheid aan te geven, verwijder voorzichtig de elektroden en druppel een paar druppels PBS om het embryo af te koelen en de bubbels te verwijderen. Gebruik een perfilstrip om de eieropening goed te verzegelen om uitdroging tijdens incubatie te voorkomen met een zachte borstel en PBS was de elektroden, plaats het ei voor de gewenste tijd in de incubator. Overleving van embryo's is ongeveer 90% twee tot drie dagen na elektroporatie en daalt tot 50% 12 dagen na elektroporatie.
Om flat mount preparaten van het achterste hersenen te maken, dissecteer je het embryo voorzichtig, scheid het van omliggende membranen en bloedvaten. Plaats het embryo in een kleine siliconen gecoate Petri-schaal met PBS met het embryo naar de dorsale zijde gericht. Gebruik wolfraampinnen om het aan de schaal te bevestigen.
Maak vervolgens met een scherpe glazen capillair een dorsale insnede in het achterste hersenin dakplaat met scherpe pincetten en microschaar. Houd het bovenste deel van het hoofd vast en trek het achterste hersenweefsel voorzichtig van rostrale naar caudale richting.
Na scheiding van het achterste hersenen, verwijder je resterende ventrale weefsels. Incubeer het achterste hersenen in 4% paraformaldehyde of PFA oplossing gedurende één tot twee uur op kamertemperatuur. Was het vervolgens met PBT om de PFA te verwijderen.
Na het volgen van de immunofluorescentie voorbereiding beschreven in het tekstprotocol, plaats je het achterste hersenen met de dorsale zijde naar boven op een glazen plaat. Voeg fluorescerend montagemedium toe aan het achterste hersenen en gebruik glazen capillairen of wolfraampinnen om het achterste hersenen op de plaat te vlakken. Voeg een kleine hoeveelheid vet aan elke hoek toe om te voorkomen dat het weefsel door de dekglas wordt geperst.
Plaats voorzichtig een dekglas op het achterste hersenen, vermijd luchtbellen voor hechting. Voeg nagellak toe aan de randen van het dekglas. Cryosecties van de hersenstam kunnen in elke ontwikkelingsfase worden uitgevoerd, maar na E 6,5.
Ze zouden de voorkeurmethode moeten zijn vanwege de moeilijkheid om axonen in het flat gemonteerde embryo te visualiseren, dat erg dik wordt. Bovendien vereist de demonstratie van synapsis het doorsnijden van het weefsel en de hoge vergroting onder een microscoop. Om een monster voor cryosectie voor te bereiden, dissecteer je het embryo en verwijder je alle weefsels rond de hersenen.
Spoel af met PBS. Gebruik vervolgens microschaar en scherpe pincetten om het embryo bij de coddle regio van de medulla te snijden. Maak een brede insnede tussen het cerebellum en de middenhersenen en verwijder de hele hersenstam.
Het weefsel zou de medulla pons en cerebellum moeten bevatten. In het volgende voorbeeld werd een enhancer element dat wordt geexpresseerd in de DA een subgroep van interneuronen in het achterste hersenen gecloneerd stroomopwaarts van Cree recombinase en co-geëlektrop
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt hoe neurale netwerken worden gevormd in het embryonale brein, met de nadruk op de achterhersenen van de kip. Door gebruik te maken van elektroporatie en geavanceerde genetische instrumenten labelen onderzoekers specifieke neuronen en volgen zij hun verbindingen tijdens de ontwikkeling.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschappelijk vakgebied
- Developmentele Neurobiologie
- Neurowetenschappen
- Genetische Modificatie
Achtergrond
- Het begrijpen van de vorming van neurale netwerken is van cruciaal belang voor de ontwikkelingsneurobiologie.
- Het labelen van neuronen helpt bij het volgen van hun ontwikkeling en verbindingen.
- Elektroporatie is een techniek die wordt gebruikt om DNA in cellen te introduceren.
- Genetische instrumenten zoals Cre/Lox en PiggyBac verbeteren de precisie van het labelen.
Doel van de studie
- Om dorsale interneuronen in de rhiencefalon (achterhersenen) van de kuiken te labelen.
- Om axonale projecties en synaptische doelwitten te volgen.
- Om neuronale ontwikkeling in verschillende stadia te analyseren.
Gebruikte methoden
- Elektroporatietechniek voor de introductie van DNA.
- Injectie van DNA-plasmiden in het achterbrein.
- Incubatie van eieren voor neuronale expressie.
- Dissectie van de hersenstam voor analyse via microscopie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle labeling van specifieke neuronale subpopulaties in de achterhersenen.
- Visualisatie van axonale projecties en synaptische targets.
- De resultaten tonen de neuronale connectiviteit in verschillende ontwikkelingsstadia aan.
- Immunofluorescentiekleuring zorgde voor heldere beelden van neuronale structuren.
Conclusies
- De studie biedt inzichten in de totstandkoming van neuronale netwerken.
- Elektroporatie in combinatie met genetische hulpmiddelen is effectief voor neuronale labeling.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de hersenontwikkeling bij gewervelden.
Veelgestelde Vragen
Industriële Relevantie voor Management
Preciese neuronale labelling en axonale tracing in de achterhersenen van de kuiken maken het mogelijk om mechanistische risico's van hypothesen over de vorming van neurale circuits tijdens de vroege ontwikkeling te minimaliseren. Deze aanpak ondersteunt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van targets voor studies naar neuro-ontwikkelingspaden en informeert de risico-gecorrigeerde voortgang van CNS-ontdekkingsprogramma's. Het vermogen van de methode om synaptische connectiviteit over verschillende ontwikkelingsstadia te volgen, versterkt de translationele continuïteit van ontdekking naar preklinisch onderzoek.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt onderzoek mogelijk naar projectiepatronen en synaptische targeting die specifiek zijn voor neuronale subtypen.
- Ondersteunt biologische risicobeperking door mechanismen van connectiviteit tijdens de ontwikkeling te verduidelijken.
- Faciliteert functionele targetvalidatie voor componenten van neurale circuits.
- Biedt voorspellende zekerheid bij het prioriteren van neurodevelopmentale targets.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde neuronale systemen voor op downstream fenotypische screeningworkflows.
- Levert reproduceerbare, kwantitatieve beeldvorming van axonale trajecten en synaptische sites.
- Maakt standaardisatie van genetische labelings- en tracingprotocollen mogelijk voor assayontwikkeling.
- Ondersteunt een betrouwbare evaluatie van kandidaat-interventies die de neurale connectiviteit beïnvloeden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt ontwikkelingsgerichte connectiviteitsmapping uit met ziekte-relevante modellen van neurale circuits.
- Biedt continuïteit van vroege ontdekking tot preklinische validatie van synaptische targets.
- Informeert risico-gecorrigeerde beslissingen voor het verder uitwerken van therapeutische programma's voor het centrale zenuwstelsel.
- Verbetert de predictieve risicoreductie van kandidaat-targets in de translationele neurowetenschappen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege identificatie van neuronale targets tot validatie in preklinische modellen, ter ondersteuning van zowel mechanistische studies als translationeel onderzoek bij de ontwikkeling van geneesmiddelen voor het centrale zenuwstelsel (CZS).
- Ontdekkingsbiologie: Maakt hypothesetoetsing van neuronale projectie- en synaptische targetingmechanismen mogelijk.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare imaging-outputs voor assay-gereedheid.
- Analytiek: Levert hogeresolutiemetingen van axonale en synaptische patronen voor comparatieve analyse.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt de afstemming op ziekterelateerde neurale circuitmodellen en biomarkerstrategieën.
- Bedrijfsbrede hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor neuronale labeling en circuittracing over meerdere CZ-programma's.
Operationele en Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar neurale circuits.
- Operationele waarde: Standaardiseert en schaalt workflows voor neuronale labeling en tracing voor reproduceerbaarheid.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie bij het beheer van CNS-portfolio's.
- Impact op portfolio: Maakt risicogecorrigeerde prioritering en ontwikkeling van neurodevelopmentale targets mogelijk.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in embryonale manipulatie, elektroporatie en geavanceerde microscopie.
- Vereist toegang tot genetische modificatietools en beeldvormingsinfrastructuur.
- Noodzaak tot cross-team standaardisatie van labelings- en tracingprotocollen.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende neuronale subtypen of ontwikkelingsstadia.
- Visualisatie van axonen in een laat stadium kan weefselcoupes vereisen vanwege de dikte van het monster.
