Multi-unit Opname Methoden om neurale activiteit karakteriseren in de Locust ( Schistocerca Americana) Olfactorische Circuits

Het algemene doel van deze procedure is om geurgerelateerde multi-unit neurale activiteit op te nemen van de eerste drie signaalverwerkingscentra van de olfactorische route van het insect. Dit wordt bereikt door eerst een sprinkhaant in een speciaal ontworpen kamer te binden en een van zijn antennes te stabiliseren voor elektrofysiologische opnames. De tweede stap is om een glazen micro-elektrode te fabriceren en deze in te brengen bij de basis van een zon om de door geuren opgewekte reacties te monitoren.

Vervolgens om neurale activiteit vanuit de sprinkhaan-hersenen op te nemen. Een meertraps dissectieprocedure wordt gevolgd om het neurale weefsel bloot te leggen, dat de input van de olfactorische sensorische neuronen verwerkt. De laatste stap omvat de juiste plaatsing van de multi-elektrode arrays om ensemble-neurale activiteit van de sprinkhaan en de antennelob en de champignonlichaam op te nemen.

Uiteindelijk worden de hier gedemonstreerde extracellulaire opnamemethoden gebruikt om geurgerelateerde reacties te karakteriseren bij de eerste drie verwerkingscentra langs de olfactorische route van het insect. Hoewel deze methode is gebruikt om de geurgerelateerde neurorespons in een relatief eenvoudig ongewerveld olfactorisch systeem te karakteriseren, kan deze ook worden aangepast om de ensemble-activiteit in andere neurale systemen te onderzoeken. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat sommige sleutelaspecten van deze procedure, zoals elektrodeplaatsing en sommige dissectiestappen, erg moeilijk te leren zijn.

Bovendien zijn de methoden meestal kwalitatief en zijn verschillende laboratoria deze in de loop van de tijd anders perfectioneerd. Om deze procedure te beginnen, selecteer een jonge volwassen sprinkhaan van beide geslachten met volledig gegroeide vleugels, maar vóór het paringsstadium van een overvolle kolonie. Vervolgens bind de sprinkhaan door zijn poten te amputeren.

Verzegeld de amputatieplaatsen met weefselkleefstof. Bevestig vervolgens de sprinkhaan aan de speciaal ontworpen kamer met een klein stuk elektrisch plakband dat om zijn thorax wordt geplaatst. Maak onder een dissectiemicroscoop een ondiepe groef in het wasplatform voor antenneplaatsing.

Plaats de antenne in de groef en stabiliseer deze met bati-was aan de twee uiteinden van de antenne. Voeg daarna een aardelektrode toe aan de thorax. Gebruik Batik-was om de incisieplaats te verzegelen en om de aarddraad op zijn plaats te houden.

Plaats vervolgens de gestabiliseerde sprinkhaantennes onder een stereomicroscoop op een trillingsisolatietafel. Verbind de uitlaatlijnen van de geurflessen met de geurtoevoerbuis. Plaats de geurtoevoerbuis op enkele centimeters van de antenne, waarbij de geurdampen worden verwijderd door een vacuümtrechter, ongeveer 10 centimeter achter de sprinkhaantennes.

Maak vervolgens glazen elektroden met een siliciumglas capillair met een micropipet en vul de glazen elektrode met sprinkhaan-zoutoplossing. Plaats vervolgens de glazen elektrode in een micropipethouder die is bevestigd aan een gemotoriseerde micromanipulator. Zorg ervoor dat de basis van de opnamesyn duidelijk zichtbaar is onder de microscoop.

Breng de elektrode voorzichtig in de basis van een syn in. Versterk vervolgens het signaal 10.000 keer. Gebruik een wisselstroomversterker.

Filter het signaal tussen 0,3 tot 10,0 kilohertz en verzamel het met een samplefrequentie van 15 kilohertz. Gebruik een data-acquisitiesysteem, wanneer de elektrode op de juiste manier is gepositioneerd, kan spontane neurale activiteit worden gedetecteerd. Stimulus-geïnduceerde reacties kunnen worden gemonitord door een geurpuls door de geurtoevoerbuis te leveren.

Gepositioneerd dicht bij de antenne en het volgen van de verandering in de extracellulaire activiteit, volgde de beperkingsprocedures zoals eerder beschreven. Plaats de sprinkhaan in een speciaal ontworpen kamer. Begin het dissectieproces door een wascup rond het hoofd van de sprinkhaan te bouwen.

Bouw twee wastorens aan beide kanten van het sprinkhaakhond, tot de hoogte van de antennes. Plaats vervolgens elke antenne door een klein stuk polyethyleenbuis dat strak past in een rubberen afdichting. Bevestig vervolgens de afdichtingen aan de wastorens zodat de plastic buis vrij kan glijden naar of weg van de basis van de an antennes, terwijl het voorkomt dat de an antennes bewegen.

Vervolgens onder de microscoop, begin met het bouwen van een wascup rond het hoofd van de sprinkhaan om saline-perfusie tijdens en na de dissectieprocedure mogelijk te maken. De wascup moet net boven de monddelen beginnen, beide wastorens omvatten en zich uitstrekken voorbij de samengestelde ogen. Zodra de wascup volledig is geconstrueerd, bevestigt u de basis van de an antennes aan het onderste uiteinde van de plastic buis met behulp van epoxyhars.

Dit zorgt ervoor dat de an antennes op hun plaats worden gehouden, zelfs nadat het omringende cuticula is verwijderd. Houd de wascup vanaf dit punt gevuld met zoutoplossing. Verwijder nu de centrale rechthoekige regio tussen de twee.

Een antenne. Verwijder vervolgens het cuticula in de aangrenzende regio's zonder de samengestelde ogen of cuticula aan de basis van de an antennes te verstoren. Gebruik fijne pincetten om voorzichtig de luchtzakken en vetlichamen rond de hersenen te verwijderen.

Het sprinkhaanbrein moet nu duidelijk zichtbaar zijn. De hersengebieden die de olfactorische informatie verwerken, bevinden zich tussen de twee. An antennes trekt voorzichtig aan de maag en snijdt deze af met een fijne schaar.

Verwijder vervolgens de vleugels en maak een kleine incisie in de buik net boven het rectum. Verwijder de darm door de achterdarm met grove pincetten te trekken. Deze stap zorgt ervoor dat darmbeweging de voorbereiding niet destabiliseert.

Om lek van de zoutoplossing te voorkomen. Bind de buik net voor de incisieplaats met hechtdrad. Gebruik vervolgens een klein platform gemaakt van een dunne draadlus bedekt met een fijne laag was om de hersenen te verhogen en te stabiliseren voor elektrofysiologisch.

De opname van de hersenen wordt beschermd door een