Name: Continue hoge-resolutie Microscopische waarneming van Replicatieve Aging in Budding gist (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Leer continue hoge-resolutie microscopische waarneming van replicatieve veroudering in budding gist met een microfluidische chip. Deze methode maakt langdurige beeldvorming van individuele cellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij willen Laura Schippers bedanken voor het schrijven van de eerste versies van de cel laden protocol en Marcus de Goffau en Guille Zampar voor het maken van mitochondriale morfologie.

1. Productie en bereiding van een silicium wafer Mold Microfluïdische chips zijn gemaakt van een silicium wafer mal geproduceerd door zachte lithografie. Deze wafers kunnen vele malen worden hergebruikt om microfluïdische chips te produceren. Het is raadzaam dat de productie van een respectievelijke wafer wordt uitgevoerd door een groep gespecialiseerd in microfluïdische 6. De wafel wordt in twee stappen fotolithografische proces gebruikmakend van twee verschillende lagen van negatieve fotolak SU-8 7. De onderste laag wordt gebruikt om de cel trapping gebied (SU-8 2002, hoogte 3-4 urn) te genereren, terwijl de kanalen zijn gemaakt met de toplaag (SU-8 2010, hoogte 10 urn). Een impressie van de wafer productie-proces kan worden gevonden in Huang et al. 8. De tekeningen van de microfluïdische chips kunnen worden verkregen van de auteurs, alsmede advies over hoe je een respectievelijke wafer te verkrijgen. <ol><li> Zodra de wafer wordt verkregen, snijd een stuk van Tough-Tag into dunne stroken van ongeveer 0,5 mm bij 3 mm met een scalpel en plaats ze voorzichtig op de schijf enigszins boven de kanaalstructuur tussen de inlaatkanalen en micropad matrix (figuur 2A). Dit resulteert in de vorming van een grote extra kanaal in elke chip, die niet alleen tijdens de celdeling laden worden, maar is ook belangrijk voor de stabiele werking van het microfluïdische apparaat. </li><li> Dek de glazen petrischaal met een dubbele laag aluminiumfolie en zet de wafer in de petrischaal. De aluminiumfolie voorkomt PDMS wordt uitgevoerd tussen de wafer en de petrischaal. Als PDMS doet kruipen tussen de wafer en de glazen petrischaal, zal de wafer worden definitief vastgesteld in de petrischaal. Hoewel de wafer nog bruikbaar, zal het niet mogelijk zijn de glazen petrischaal vervangen als het breekt en PDMS moet daarna worden weggesneden. </li></ol> 2. Productie van Microfluïdische Chips <ol><li> Plaats een lege plastickop op de balans en de tarra van de balans. Giet 40 g PDMS base in de plastic beker (voor een 12 cm diameter glazen petrischaal). Voeg PDMS verharder met een disposable pipet in een w / w verhouding van 01:10, dat wil zeggen ongeveer 4 ml. </li><li> Meng de PDMS en verharder grondig gedurende enkele minuten. Dit kan de plastic wegwerp pipet die werd gebruikt om het uithardingsmiddel pipetteren. Het is belangrijk dat het mengsel goed gemengd voor het gieten bovenop de wafer. Slechte menging zal deel uitmaken van de PDMS niet te polymeriseren veroorzaken. </li><li> Giet de PDMS bovenop de wafer in de glazen petrischaal. </li><li> Mengen van PDMS met verharder leidt tot belvorming in het PDMS mengsel. Deze belletjes moeten worden verwijderd voordat het PDMS polymeriseert. De PDMS kan worden ontgast na gieten bovenop de wafer door het plaatsen van de petrischaal in een exsiccator verbonden met een vacuümpomp. Met deze opstelling, het duurt ongeveer 30 minuten om alle luchtbellen uit het mengsel te verwijderen. </li><li> Polymeriseren the PDMS door het plaatsen van de Petri schaal met de wafer op een hete plaat bij 120 ° C gedurende 1 uur en daarna bij 65 ° C gedurende een uur. </li><li> Verwijder de aluminium folie met de wafel en gepolymeriseerde PDMS de glazen petrischaal. Trek het aluminiumfolie en de resterende dunne laag van gepolymeriseerde PDMS van de achterkant van de wafer. De laag PDMS bovenop de wafer kan dan van de wafer gescheiden door tillen voorzichtig. </li><li> Plaats de PDMS-laag ondersteboven (met de kanalen naar boven) op de bank en knip de enkele chip ontwerpen afgedrukt op de PDMS voorzichtig met een scalpel. Probeer ongeveer 3 mm van PDMS behouden rond de randen van de kanalen om bevestiging van de chip later verbeteren om de dekglas. </li><li> Perforeren de PDMS aan de uiteinden van de inlaat, uitlaat en zijkanaal (Figuur 2A) door op een 20 Gauge Luer stub helemaal door de PDMS op een rechte wijze. </li></ol> Zorg ervoor dat de PDMS-chipwordt nog steeds ligt ondersteboven op de bank terwijl het ponsen van de gaten. Dit voorkomt PDMS plakken aan de binnenkant van het kanaal, dat verstopping van het kanaal kunnen veroorzaken. <ol start="9"><li> Na het ponsen elk gat, verwijder de kolom van PDMS in de Luer stub met een pincet voordat de stub trekken weer. De kolom PDMS zou anders blijven achter en blokkeert het gewoon gaatje. </li><li> Reinig het oppervlak van de chip van stofdeeltjes en overblijvende PDMS door het plaatsen van plakband op en onmiddellijk verwijderen van de tape weer. Zo ook het reinigen van de dekking van glas waarop de chip zal worden gehecht. </li><li> Leg de schoongemaakte chip en dekking van glas onder de UV-lamp van het tafelmodel UV-Ozon Cleaner. De partijen die samen moeten worden gebonden voor de lamp. </li><li> Expose de PDMS en dekglaasjes het UV-licht gedurende 6-8 min en vlak daarop zetten de chip op het dekglas door het plaatsen van de blootgestelde oppervlakken elkaar. </li><li> Tik voorzichtig rond de zijkanten van de chiptot bevestiging van de PDMS bevorderen om de dekking van glas en om eventuele luchtbellen te verwijderen. Druk niet op de top van de channel-structuur, omdat dit kan leiden tot de micropads om gehecht te raken aan de dekking van glas ook. </li><li> Plaats de nieuw gemaakte microfluïdische opstelling op een hete plaat bij 100 ° C gedurende 60 minuten. Test de sterkte van de binding tussen het dekglaasje en PDMS chip door te proberen iets omhoog de randen van de chip PDMS. Wanneer de PDMS blok niet kan worden opgetrokken glazen oppervlak, de hechting is succesvol en de chip is klaar voor gebruik. </li></ol> 3. Voorbereiden van de Spaander voor Cell Laden Falen van een microfluïdische apparaat kan mogelijk lekkage van medium veroorzaken in de microscoop. Om dit te vermijden, is het advies om een ​​metalen houder gebruiken en / of zegel van de zijden van de chip waar het PDMS voldoet het glas met nagellak of epoxy lijm. Dit voorkomt lekkage van medium bij het PDMS chip is niet goed genoeg gebonden aan het dekglas. Ook de buisverbindingen kunnen worden vastgezet rond de insertie in het op vergelijkbare wijze lekkage van medium te voorkomen. Een zelfgemaakte water sensor die schakelt de spuit pomp in geval van lekkage kan gebruikt worden als een extra veiligheidsmaatregel. Tekeningen van de metalen houder speciaal ontworpen voor de microfluïdische chip kan worden verkregen van de auteurs. <ol><li> Plaats de microfluïdische chip in de metalen houder, met siliconengel tussen het glas van de chip en de metalen delen van de houder om een ​​waterdichte afdichting te creëren. Schroef de moeren voorzichtig, niet om het glas te breken. </li><li> Sluit dunne buisjes (ca. 5-15 cm lang) aan het zijkanaal en het afvoerkanaal van de chip. Het gebruik van een pincet vergemakkelijkt de slang voegen in de gaten. </li><li> Vul een 50 ml Luer-Lok spuit met kweekmedium, verwijdert de lucht uit de spuit en sluit deze achtereenvolgens aan een spuit filter, een 20 Gauge Luer stub, een korte dikke buis (ca. 2 cm lang) en een dunne buis. Zorg ervoor dat de dunne bade is lang genoeg om de afstand tussen de spuitpomp en de microscooptafel overspannen. </li><li> Plaats de spuit in de spuit pomp, snel vooruit de pomp totdat de dunne buis wordt volledig gevuld met medium. </li><li> Duw de dunne buis verbonden met de spuit in het inlaatkanaal van de chip en laat de mediumstroom door de chip in 10 gl / min (Figuur 2B). Verzamel het medium waardoor de chip (bijv. in een petrischaal). Het medium zal opraken via het zijkanaal vanwege de weerstand verschil tussen de Tough-label maakte grote nevengeul en de uitlaat kanaal. </li><li> Plaats de chip op de microscoop podium en zet de focus van de microscoop op de pads. </li></ol> Het gebruik van immersie doelstellingen olie heeft de voorkeur boven die van onderdompeling doelstellingen water omdat olie zal niet uitdrogen over de tijd-verloop van het experiment. Afhankelijk van de microscoop kunnen er problemen met het behoud van de fOcus tijdens de eerste uren van het experiment. Het is daarom raadzaam om de chip te verlaten voor een tot twee uur in de microscoop podium, zodat het naar beneden kan regelen voordat cellen en het starten van het experiment. 4. Laden van de gistcellen in de Microfluidic Chip <ol><li> Sluit een 5 ml Luer spuit met een 20 Gauge Luer stub en een dikke buis (ca. 3 cm). </li><li> Neem een ​​monster van de celcultuur in de chip worden geladen. </li></ol> De aangewezen celgetal voor het laden is tussen 1-5 x 10 6 cellen per ml. Culturen met een hogere cel tellingen moeten worden verdund vóór het laden. Bij het kweken van cellen op YPD, kan cel laden efficiency worden verbeterd vele malen als de cellen eerst worden gewassen met en gesuspendeerd in minimaal medium met een vergelijkbare glucose percentage vóór het laden. Tijdens de werking van de chip, YPD medium kan weer veilig gebruikt worden. <ol start="3"><li> Laad ongeveer 1 ml van de celsuspensie in ee spuit en verwijder alle lucht uit de spuit. </li><li> Verlaag de stroomsnelheid van de spuitpomp tot 0,5 gl / min. De lage en aanhoudende stroom afgedwongen door de injectiepomp tijdens het laden (in stap 4.5) zal aandringen niet-ingeschrevenen cellen uit via het zijkanaal (figuur 2C). </li><li> Verbind de spuit met de celsuspensie aan de buis van het uitlaatkanaal. Plaats de cellen door op de plunjer van de injectiespuit zachtjes. Let op de cellen die in en afwikkeling onder de micropads via de oculaire of via het computerscherm. </li><li> Handhaaf de druk op de zuiger totdat voldoende cellen te regelen onder de pads. De optimale belasting is 1-3 cellen per blok. Zoals cellen vestigen onder de pads willekeurig, is het vrij normaal dat een paar pads bevatten geen cellen en andere pads zijn volledig gevuld met cellen. </li><li> Koppel de spuit gebruikt voor cel laden en de dikke buis verbonden met het uit de dunne buis van de uitlaat kanaal, spoelt de kant channel voor een paar minuten bij hogere stroomsnelheden (10 pl / min) om luchtbellen en / of cellen die niet de chip (figuur 2B) nog niet verlaten te verwijderen. Indien cellen niet uit het zijkanaal worden verwijderd, kunnen ze beginnen te groeien in het zijkanaal en interfereren met het experiment later. </li><li> Zet de stroom van de spuitpomp terug tot 0,5 gl / min en sluit het zijkanaal af door deze op een dikke buis (ca. 5 cm lang) met een katheter plug aan het uiteinde (figuur 2D). </li><li> Vrij waardoor een uiteindelijke stroomsnelheid van 1,5 ul / min. Debieten kunnen variëren, afhankelijk van medium en giststam. </li><li> Start een filmpje met de microscoop en camera-instellingen geschikt zijn voor het doel van het experiment. Zorg ervoor dat de snelheid van de microscoop podium is ingesteld op zo&#39;n lage snelheid die de olie kunnen volgen. Voor de bepaling van replicatieve levensduur, image cellen elke 10 minuten. Om cellen te beschermen tegen de kleine hoeveelheden UV-licht dat wordt uitgezonden door de halogeenlamp, die wordt gebruikt tijdens DIC acquisitie, is het raadzaam om een ​​extra UV-filter te plaatsen in de lichtweg. Bij gebruik van fluorescentiemicroscopie, heeft het de voorkeur beeld de cellen minder vaak (bijvoorbeeld elke 20 minuten) fototoxische effecten te vermijden. Het experiment is voltooid wanneer alle cellen geladen bij de start van het experiment zijn dood, die onder normale omstandigheden duurt tot 5 dagen. Het wordt aanbevolen om regelmatig de aandacht van de beelden tijdens het experiment en zonodig bijstellen. </li></ol>

<ol><li>Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+yeast+to+discover+the+fountain+of+youth%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Aging+Knowledge+Environ%22%5BJournal%5D)">Using yeast to discover the fountain of youth.</a> Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1(2001).</li>
<li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+span+of+individual+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).</li>
<li>Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+replicative+life+span+in+the+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring replicative life span in the budding yeast.</a> J. Vis. Exp. (28), e1209(2009).</li>
<li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. , (2012).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Soft Lithography.</a> Angewandte Chemie International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).</li>
<li>Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+multi-layer+SU-8+microstructures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).</li>
<li>Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+cancer+stem+cell+migration+using+compartmentalizing+microfluidic+devices+and+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging.</a> J. Vis. Exp. (58), e3297(2011).</li>
<li>Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+determining+yeast+replicative+life+span+in+a+long-lived+genetic+background%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Genes determining yeast replicative life span in a long-lived genetic background.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 126 (4), 491-504 (2005).</li>
<li>Scheckhuber, C. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+mitochondrial+fission+results+in+increased+life+span+and+fitness+of+two+fungal+ageing+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models.</a> Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).</li>
<li>Defossez, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+replication+block+protein+Fob1+extends+the+life+span+of+yeast+mother+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells.</a> Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).</li>
<li>Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SIR2%2F3%2F4+complex+and+SIR2+alone+promote+longevity+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+two+different+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms.</a> Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).</li>
<li>Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mechanism+for+asymmetric+segregation+of+age+during+yeast+budding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding.</a> Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).</li>
<li>Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+heterogeneity+in+populations+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).</li>
<li>Huh, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+localization+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein localization in budding yeast.</a> Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).</li>
<li>Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+new+generation+of+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.</a> PLoS One. 7 (11), e48275(2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

De microfluïdische hier beschreven methode is een belangrijk nieuw instrument in het verouderen onderzoek als het in staat stelt eenvoudig en automatisch genereren van gist replicative levensduur data in combinatie met een continue hoge resolutie imaging. Deze eigenschappen zijn belangrijke verbeteringen in de experimentele mogelijkheden van de klassieke uitsnijmethode, maar er zijn enkele beperkingen van de methode waarmee rekening moet worden gehouden. Merk op dat de bepaalde replicatieve ...

Ontluikende gist is een belangrijk modelorganisme voor veroudering onderzoek 1. Tot voor kort studeren replicatieve veroudering in gistcellen een bewerkelijk proces waarbij een uitsnijmethode, waarbij elke top handmatig werd uit de moedercel 2,3. Om dit probleem op te lossen, hebben we onlangs een nieuwe microfluïdische setup staat om individuele moeder cellen te volgen gedurende hun hele levensduur 4. In onze microfluïdische chip, worden gistcellen gevangen onder zacht elastomeer gebaseerde micropads (zie figuur 1). Een continue stroom van medium spoelt nieuw gevormde dochtercellen dat de cellen met verse voeding. In een experiment, kan tot 50 moedercellen worden gecontroleerd op volledig geautomatiseerde wijze gedurende de gehele replicatieve levensduur. Door de uitstekende optische eigenschappen van de microfluïdische chip, is het mogelijk om verschillende aspecten van gist celbiologie (bijv. gelijktijdig controleren </em&gt; met behulp van fluorescerende eiwitten). Vergeleken met de klassieke uitsnijmethode, de microfluïdische opstart biedt aanzienlijke voordelen. Het zorgt voor een gedefinieerde en constante milieu gedurende de hele veroudering experiment. Het vereist geen dure gespecialiseerde apparatuur en kan worden uitgevoerd op elke microscoop uitgerust met automatische scherpstelling en time-lapse vaardigheden en temperatuur-controle voor celkweek. De productie en exploitatie van de microfluïdische chips geleerd kan worden binnen een paar dagen. Daarnaast kunnen cellen direct worden geladen van een exponentieel groeiende kweek, een voordeel boven andere onlangs microfluïdische wijze 5 dat biotinylering van moedercellen vereist. Een combinatie met hoge-resolutie afbeelding, de hier beschreven werkwijze kan worden gebruikt om geleidelijke veranderingen te meten in cellulaire morfologie, eiwit expressie en lokalisatie tijdens gist veroudering op een ongekende manier. De mogelijkheid omlangdurige bewaking van de afzonderlijke cellen biedt ook unieke mogelijkheden voor gist celcyclus studies. Deze methode is een onlangs geoptimaliseerd om de biotinylering van het protocol 16, dat werd gepubliceerd terwijl dit manuscript in beoordeling verwijderen.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>DC Sylgard 184 elastomer </td><td>Mavom bv</td><td>1060040</td><td>Deze verpakking bevat PDMS base en PDMS curing agent.</td></tr><tr><td>Glass petri dishes 120/20 mm </td><td>VWR International</td><td>391-2850</td><td></td></tr><tr><td>Cover glasses 22x40 mm </td><td>CBN Labsuppliers BV</td><td>190002240</td><td></td></tr><tr><td>Tough-Tags </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359106</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum foil </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic disposable cup </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serological pipette 5 ml </td><td>VWR International</td><td>612-1245</td><td></td></tr><tr><td>Scotch tape </td><td>VWR International</td><td>819-1460</td><td></td></tr><tr><td>Baysilone paste (GE Bayer silicones) </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85403-1EA</td><td></td></tr><tr><td>PTFE microbore tubing, 0.012"ID x 0.030"OD </td><td>Cole Parmer</td><td>EW-06417-11</td><td>Wordt aangeduid als dunne buis </td></tr><tr><td>Tygon microbore Tubing, 0.030"ID x 0.090"OD </td><td>Cole Parmer</td><td>EW-06418-03</td><td>Wordt aangeduid als dikke buis </td></tr><tr><td>Scalpel </td><td>VWR International</td><td>233-5334</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Luer-Lok syringes </td><td>BD</td><td>300137</td><td></td></tr><tr><td>5 ml syringes, Luer tip </td><td>VWR International</td><td>613-1599</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers </td><td>VWR International</td><td>232-2132</td><td></td></tr><tr><td>20 Gauge Luer stubs </td><td>Instech Solomon</td><td>LS20</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filters (pore size 0.20 &mu;m) </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16534K</td><td></td></tr><tr><td>Stainless steel catheter Plug, 20 ga x12 mm </td><td>Instech Solomon</td><td>SP20/12</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes </td><td>VWR International</td><td>391-0892</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Benchtop UV-Ozone Cleaner </td><td>NOVA Scan</td><td>PSD-UVT</td><td></td></tr><tr><td>Harvard Pump 11 Elite </td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4505</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 silicon master mold (wafer) </td><td></td><td></td><td>Zelf gemaakt; Neem voor details contact op met de corresponderende auteur </td></tr><tr><td>Balance </td><td>Sartorius corporation</td><td>ED4202S</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum pump </td><td>KNF Neuberger</td><td>N022 AN.18</td><td></td></tr><tr><td>Desiccator </td><td>VWR International</td><td>467-2115</td><td></td></tr><tr><td>Hot plate </td><td>VWR International</td><td>460-3267</td><td></td></tr><tr><td>Optioneel: Metalen houder voor cover glass (22x40 mm) </td><td></td><td></td><td>Zelf gemaakt; Neem voor details contact op met de corresponderende auteur </td></tr><tr><td>(Fluorescentie) Microscoop met 60x objectief, autofocus, time-lapse mogelijkheden en bij voorkeur een geautomatiseerde (gemotoriseerde XY control) stage </td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-E</td><td></td></tr></tbody></table>

continue hoge-resolutie microscopische waarneming van replicatieve aging in budding gist

Continuous High-resolution Microscopic Observation of Replicative Aging in Budding Yeast

We demonstreren het gebruik van een eenvoudige microfluïdische setup, waarbij enkele gist cellen gedurende hun gehele levensduur kan worden gevolgd. De microfluïdische chip maakt gebruik van het verschil in grootte tussen moeder en dochter cellen met behulp van een array van micropads. Bij laden, worden de cellen gevangen onder deze micropads, omdat de afstand tussen de micropad en dekglas is vergelijkbaar met de diameter van een gistcel (3-4 um). Na het laden wordt kweekmedium continu doorgespoeld chip, die niet alleen zorgt voor een constante en gedefinieerde milieu gedurende het gehele experiment, maar ook spoelt de nieuwe dochtercellen, die niet onder de elektroden vanwege hun kleinere afmetingen behouden. De setup behoudt moedercellen zo efficiënt dat in een experiment tot 50 individuele cellen kunnen worden gecontroleerd op volledig geautomatiseerde wijze gedurende 5 dagen of eventueel langer. Bovendien, de uitstekende optische eigenschappen van de chip mogelijk highResolutie beeldvorming van cellen tijdens het hele verouderingsproces.

In dit protocol worden de cellen geladen in de microfluïdische chip direct vanaf mid-exponentiële cultuur. Te bepalen of de leeftijdsverdeling van cellen opgesloten in de microfluïdische chip is vergelijkbaar met dat van de cultuur vóór het laden werden de cellen gekleurd met tarwe agglutinine geconjugeerd aan FITC (WGA-FITC) te lopen littekens visualiseren. Zoals te zien is in figuur 3, wordt het insluiten van cellen onder de micropads van de microfluïdische chip niet voorgespannen naar cellen van een ...

We beschrijven hier de werking van een microfluïdische apparaat dat continue en hoge-resolutie microscopische beeldvorming van enkele ontluikende gistcellen kunnen gedurende hun volledige replicatie en / of chronologische levensduur.

Continue hoge-resolutie Microscopische waarneming van Replicatieve Aging in Budding gist

We demonstrate the use of a simple microfluidic setup, in which single budding yeast cells can be tracked throughout their entire lifespan. The ...

Het algemene doel van deze procedure is om individuele haploïde gistcellen te volgen gedurende hun volledige replicatieve levensduur. De eerste stap is het maken van een microfluïdische chip met een array van micropads. Vervolgens worden de gistcellen in de microfluïdische chip geladen; omdat het gebied onder de micropads een hoogte heeft die vergelijkbaar is met de diameter van een gistcel, zullen de cellen daar bezinken.Vervolgens wordt een continue stroom vers medium over de gevangen gistcellen geleid, waarbij de ontstane dochtercellen door de mediumstroom worden weggespoeld. Brightfield- en fluorescentiemicroscopie worden gebruikt om veranderingen in de cel- of organelmorfologie, eiwitexpressie en eiwitlokalisatie te visualiseren die kunnen optreden in verouderende gistcellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van de klassieke microdissectiemethode is dat deze minder arbeidsintensief is en dat het langdurige, continue microscopische beelden van de volledige levensduur van individuele gistcellen mogelijk maakt.Hoewel deze methode inzicht kan bieden in replicatieve veroudering, kan deze ook worden gebruikt voor studies die continue microscopische observatie over langere perioden vereisen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat er bij specifieke stappen tijdens de productie van de micro feic-chip voorzichtig moet worden gewerkt. Daarnaast kan het laden van de cellen in de micro feic-chip enige ervaring vereisen.De mal van het siliciumwafer wordt geproduceerd via softlithografie. Raadpleeg voor details over de productie het bijbehorende protocol. Snijd een stuk stevige tag in dunne stroken van ongeveer 0.5 millimeter bij drie millimeter.Plaats de strips voorzichtig met een scalpel op de silicon wafer-mal, iets bovenop de kanaalstructuur tussen de inlaatkanalen en de micro padre. Bedek vervolgens een glazen petrischaal met een dubbele laag aluminiumfolie en plaats de wafer in de petrischaal. De aluminiumfolie voorkomt dat PDMS tussen de wafer en de petrischaal terechtkomt tijdens de productie van de microfluidische chips.Om te beginnen met de procedure voor het maken van microfluidische chips, plaatst u een lege plastic beker op de balans en tareert u de balans. Giet 40 gram PDMS-base in de plastic beker. Voeg PDMS-uithardingsmiddel toe in een gewichtsverhouding van 1 op 10, wat in dit geval ongeveer vier milliliter is.Meng het geheel gedurende enkele minuten grondig met de wegwerpplasticpipet; het is belangrijk dat het mengsel goed gemengd is om een correcte polymerisatie van de PDMS in een later stadium te waarborgen. Giet de PDMS bovenop de wafer in de glazen Petrischaal. Het PDMS-mengsel in de Petrischaal zal veel luchtbellen bevatten die ontgast moeten worden.Plaats de PDMS-petrischaal in een desiccator die is aangesloten op een vacuümpomp gedurende ongeveer 30 minuten, totdat alle bellen zijn verwijderd. Polymeriseer de PDMS door de petrischaal met de wafer bovenop een warmteplaat te plaatsen bij 120 °C gedurende één uur, gevolgd door 65 °C gedurende nog een uur. Verwijder na deze twee uur de aluminiumfolie-wafer en de gepolymeriseerde PDMS uit de glazen petrischaal.Pel de aluminiumfolie in het PDMS vanaf de achterkant van de wafer af. Til vervolgens voorzichtig de PDMS-laag van de bovenkant van de wafer. Plaats de PDMS-laag ondersteboven op de werkbank, met de kanalen naar boven gericht, en snijd de op het PDMS afgedrukte individuele chipontwerpen voorzichtig uit met het scalpel.Probeer ongeveer drie millimeter PDMS rond de randen van de kanalen te behouden. De volgende stap is het ponsen van gaten in de PDMS aan de uiteinden van de inlaat, uitlaat en het zijkanaal, zoals geïllustreerd in dit diagram. Om een gat te ponsen, duwt u een 20 gauge lure stub in een rechte lijn volledig door de PDMS heen.Verwijder de PDMS-kolom in de lokstomp voordat u de stomp eruit trekt. Dit voorkomt opnieuw dat de PDMS-kolom het nieuw geponste gat blokkeert. Zodra alle gaten zijn geponst, worden de oppervlakken van de chip gereinigd van stofdeeltjes en PDMS-residuen door er schilderstape op aan te brengen en deze onmiddellijk weer te verwijderen.Reinig op dezelfde wijze het dekglas waaraan de chip zal worden bevestigd. Plaats de chip en het dekglas onder de UV-lamp van een benchtop UV-ozonreiniger, met de zijden die aan elkaar gebonden moeten worden naar de lamp gericht, en stel deze zes tot acht minuten bloot aan UV-licht; plaats vervolgens de blootgestelde oppervlakken op elkaar. Tik voorzichtig langs de zijkanten van de chip om de hechting van de PDMS aan het dekglas te bevorderen en om eventuele luchtbellen te verwijderen.Tik niet op de bovenkant van de kanaalstructuur, omdat de micropads hierdoor aan de afdekking kunnen hechten. Dit geldt ook voor het glas. Plaats de nieuw gemaakte microfluïdische opstelling gedurende één uur op een warmteplaat bij 100 °C.Controleer vervolgens de hechting van het dekglas aan de PDMS-chip door de randen van de PDMS-chip voorzichtig iets op te tillen. Als dit niet mogelijk is, is de hechting geslaagd en is de chip klaar voor gebruik. Om de microfluïdische chip voor te bereiden op het laden van cellen, plaatst u de chip in de metalen houder met siliconengel tussen het glas van de chip en de metalen delen van de houder.Draai de moeren voorzichtig aan om een waterdichte afsluiting te creëren en te voorkomen dat het glas breekt. Sluit dunne slangetjes aan op het zijkanaal en het uitlaatkanaal van de chip. Het gebruik van een pincet maakt het eenvoudiger om de slangetjes in de geponste gaten in te voeren.Vul een spuit van 50 milliliter met luer-lock met kweekmedium. Verwijder de lucht uit de spuit en verbind deze opeenvolgend met een spuit. Filtreer een 20 gauge luer-stub, een korte, dikke slang en een dunne slang.Plaats de spuit in de spuitpomp en spoel de pomp door totdat de dunne slang volledig met medium is gevuld. Steek de aan de spuit verbonden dunne slang in het inlaatkanaal van de chip en laat het medium met een snelheid van 10 µL per minuut door de chip stromen. Verzamel het medium dat de chip verlaat in een Petrischaal.Het medium zal via het zijkanaal weglopen. Dit komt door het verschil in weerstand tussen het zijkanaal, dat is gemaakt van het grote stevige label, en het uitlaatkanaal. Plaats de chip op de microscooptafel en stel de focus van de microscoop in op de pads.Om deze procedure te starten, verbindt u een spuit van vijf milliliter met een Luer-tip aan een Luer-stub van 20 gauge en een dikke slang. Vul de spuit met ongeveer één milliliter van de celsuspensie die in de chip moet worden geladen. De voorkeur gaat uit naar een celconcentratie voor het laden van tussen één en vijf maal 10⁶ cellen per milliliter.Verlaag de stroomsnelheid van de spuitenpomp naar 0,5 µL per minuut. Het meest lastige deel van deze procedure is het laden van de cellen in de microfluïdische chip. Dit vereist gewoonlijk enige oefening.Verbind de spuit met de celsuspensie met de buis van het uitlaatkanaal. Laad de cellen door op de zuiger van de spuit te drukken. Observeer voorzichtig via het oculair of het computerscherm hoe de cellen binnenkomen en zich onder de micropads nestelen.Houd druk uit te oefenen op de zuiger totdat er voldoende cellen onder de pads zijn neergedaald. De optimale belading is één tot drie cellen per pad. Koppel de spuit die voor het laden van de cellen is gebruikt los en spoel het zijkanaal enkele minuten door met hogere stroomsnelheden om luchtbellen en/of cellen die de chip nog niet hebben verlaten te verwijderen.Verlaag de stroomsnelheid van de spuitpomp opnieuw naar 0,5 µL per minuut en sluit het zijkanaal af door dit te verbinden met een dikke slang met een katheterstop aan het uiteinde. Verhoog de stroomsnelheid van de spuitpomp tot een uiteindelijke stroomsnelheid van één tot vijf µL per minuut. Stroomsnelheden kunnen variëren afhankelijk van het medium en de giststam.Start een opname met de microscoop- en camera-instellingen die geschikt zijn voor het doel van het experiment. Dit is een voorbeeld van een time-lapse movie van een enkele wildtype E-cel die groeit op YPD. Er werden elke 10 minuten beelden van het medium gemaakt en de getoonde schaalbalk vertegenwoordigt vijf micrometers.De cel produceert in totaal 30 knoppen voordat deze afsterft. De replicatieve levensduur kan worden bepaald door het aantal knoppen te tellen dat door een enkele moedercel wordt geproduceerd. Deze gegevens worden omgezet in een levensduurcurve door het percentage levensvatbare cellen uit te zetten tegen het aantal geproduceerde knoppen of het aantal generaties.Deze figuur toont een voorbeeld van levensduurcurves verkregen voor een wild-type giststam en twee mutantstammen. Deletie van het SER2-gen resulteert in een kortere levensduur, terwijl deletie van het FOB1-gen resulteert in een langere levensduur. Mitochondriale morfologie als functie van de leeftijd kan worden bestudeerd met behulp van het microfluïdische apparaat.Er werd een verouderingsexperiment uitgevoerd met BY 7 42 wild-type gistcellen die ILV 3G FP tot expressie brachten, dat gericht is op de mitochondriën. In deze figuur wordt een representatief voorbeeld van ouderdomsgerelateerde veranderingen in de mitochondriële morfologie in een enkele cel aangegeven door de witte pijl. Alle afbeeldingen zijn op dezelfde schaal weergegeven en de schaalbalk staat voor vijf micrometer.De tweede time-lapse movie is van een enkele cel die ILV 3G FP tot expressie brengt uit het experiment waarbij de mitochondriale morfologie als functie van de leeftijd werd waargenomen. Beelden werden elke 30 minuten genomen en de schaalbalk staat voor vijf micrometer. Deze laatste figuur toont de mitochondriale morfologieën die waargenomen zijn in dezelfde set cellen bij verschillende replicatieve leeftijden: voor het produceren van hun eerste knop, na 10 knoppen en voorafgaand aan de dood.Een voorbeeldafbeelding van elke morfologieklasse is opgenomen: tubulair, gefragmenteerd tubulair, en vlekken en grote vlekken. De morfologische veranderingen die worden waargenomen in cellen van middelbare leeftijd vertonen gelijkenissen met die welke eerder zijn gerapporteerd door cellen continu te monitoren terwijl ze delen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de replicatieve veroudering van gist, zoals waarom een gistcel veroudert, welke fenotypische veranderingen plaatsvinden en hoe deze de replicatieve levensduur van de gist beïnvloeden?Na het bekijken van deze video weet u hoe u uw eigen microchips kunt maken en replicatieve veroudering in cellen kunt bestuderen met gebruik van vrijwel elke fluorescentiemicroscoop.

continuous-high-resolution-microscopic-observation-replicative-aging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Chronologische veroudering in gist verwijst naar het verlies van cel levensvatbaarheid geassocieerd met de tijd in de stationaire fase. Hier beschrijven we een high-throughput methode voor het kwantitatief bepalen van gist chronologische levensduur.

Kwantificeren van Gist Chronologisch Life Span door uitgroei van Aged cellen

In dit artikel geven we een algemeen protocol voor het meten van de replicatieve levensduur van gist moeder cellen.

Het meten van replicatieve levensduur in de gist

Gendeletie en eiwit overexpressie zijn gemeenschappelijke methoden voor het bestuderen van functies van eiwitten. In dit artikel beschrijven we een protocol voor de analyse van fenotype ontwikkeling als een functie van de proteïne concentratie op de bevolking en de single-cell niveau...

Analyse van de ontwikkeling van een morfologische fenotype als een functie van de eiwitconcentratie in gist

Hier beschrijven we een set van DNA-mutatie assays die kunnen worden gecombineerd met de gist chronologische levensduur model om de genen / paden die reguleren of bijdragen aan de genomische DNA instabiliteit tijdens Aging Study.

Studeren Age-afhankelijke genomische instabiliteit met behulp van de S. cerevisiae Chronologische levensduur Model

Mutatie tarieven bij jonge Saccharomyces cerevisiae cellen gemeten door fluctuatie tests worden gebruikt om mutatie frequenties voorspellen voor moeder cellen van verschillende replicative leeftijden. Magnetische sortering en flow cytometrie worden vervolgens gebruikt om de feitelijke mutatie frequenties en leeftijd van moedercellen meten afwijkingen identificeren voorspelde mutatiefrequentie.

De combinatie van magnetische sorteren van Moeder Cellen en Schommelingen Tests om Genome Instabiliteit Tijdens mitose Aging in Analyze Saccharomyces cerevisiae

We bieden een reproduceerbare basismethode voor de langetermijnmicroscopie van de seksuele levenscyclus van splijtingsgist. Met kleine aanpassingen zoals beschreven, stelt het gepresenteerde protocol onderzoekers in staat zich te concentreren op verschillende stappen van het reproductieproces.

Microscopie van Fission Yeast Sexual Lifecycle

Dit artikel een protocol geoptimaliseerd voor het vervaardigen van microfluïdische chips en de opstelling van microfluïdische experimenten om de levensduur en cellulaire fenotypen van afzonderlijke gistcellen te meten.

Met behulp van microfluïdische apparaten te meten Levensduur en Cellulaire Phenotypes in Single Budding gistcellen

Gist is een voordelige model voor het bestuderen van de dynamica van microtubuli in vivo vanwege de krachtige genetica en de eenvoud van het microtubule-cytoskelet. Het volgende protocol wordt beschreven hoe om te transformeren en cultuur gistcellen, verwerven confocale microscopie afbeeldingen en kwantitatief te analyseren dynamiek van microtubuli in levende gistcellen.

Hoge-resolutie beeldvorming en analyse van individuele Astral dynamiek van microtubuli in gist

Hier presenteren we live-celbeeldvorming die een niet-toxische microscopie methode is die onderzoekers in staat stelt om eiwit gedrag en nucleaire dynamiek in levende splijting gistcellen te bestuderen tijdens mitose en meiosis.

Onderzoek van de kern dynamiek van de mitotische en Meiotische splijtstof gist door fluorescentie-Live-cel microscopie

Hier is een protocol om genetische interacties te identificeren door middel van een verhoogde kopie nummer suppressor scherm in Saccharomyces cerevisiae. Deze methode stelt onderzoekers in staat om te identificeren, klonen, en testen suppressors in kortstondige gist mutanten. We testen het effect van de toename van het kopieeraantal van SIR2 op de levensduur in een autofagie null mutant.

Een suppressor scherm voor de karakterisering van genetische links reguleren chronologische levensduur in Saccharomyces cerevisiae

Leer continue hoge-resolutie microscopische waarneming van replicatieve veroudering in budding gist met een microfluidische chip. Deze methode maakt langdurige beeldvorming van individuele cellen mogelijk.

Continue hoge-resolutie Microscopische waarneming van Replicatieve Aging in Budding gist

Meer video's verkennen