Continue hoge-resolutie Microscopische waarneming van Replicatieve Aging in Budding gist

Het algemene doel van deze procedure is om individuele haploïde gistcellen te volgen gedurende hun volledige replicatieve levensduur. De eerste stap is het maken van een microfluïdische chip met een array van micropads. Vervolgens worden de gistcellen in de microfluïdische chip geladen; omdat het gebied onder de micropads een hoogte heeft die vergelijkbaar is met de diameter van een gistcel, zullen de cellen daar bezinken.

Vervolgens wordt een continue stroom vers medium over de gevangen gistcellen geleid, waarbij de ontstane dochtercellen door de mediumstroom worden weggespoeld. Brightfield- en fluorescentiemicroscopie worden gebruikt om veranderingen in de cel- of organelmorfologie, eiwitexpressie en eiwitlokalisatie te visualiseren die kunnen optreden in verouderende gistcellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van de klassieke microdissectiemethode is dat deze minder arbeidsintensief is en dat het langdurige, continue microscopische beelden van de volledige levensduur van individuele gistcellen mogelijk maakt.

Hoewel deze methode inzicht kan bieden in replicatieve veroudering, kan deze ook worden gebruikt voor studies die continue microscopische observatie over langere perioden vereisen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat er bij specifieke stappen tijdens de productie van de micro feic-chip voorzichtig moet worden gewerkt. Daarnaast kan het laden van de cellen in de micro feic-chip enige ervaring vereisen.

De mal van het siliciumwafer wordt geproduceerd via softlithografie. Raadpleeg voor details over de productie het bijbehorende protocol. Snijd een stuk stevige tag in dunne stroken van ongeveer 0.5 millimeter bij drie millimeter.

Plaats de strips voorzichtig met een scalpel op de silicon wafer-mal, iets bovenop de kanaalstructuur tussen de inlaatkanalen en de micro padre. Bedek vervolgens een glazen petrischaal met een dubbele laag aluminiumfolie en plaats de wafer in de petrischaal. De aluminiumfolie voorkomt dat PDMS tussen de wafer en de petrischaal terechtkomt tijdens de productie van de microfluidische chips.

Om te beginnen met de procedure voor het maken van microfluidische chips, plaatst u een lege plastic beker op de balans en tareert u de balans. Giet 40 gram PDMS-base in de plastic beker. Voeg PDMS-uithardingsmiddel toe in een gewichtsverhouding van 1 op 10, wat in dit geval ongeveer vier milliliter is.

Meng het geheel gedurende enkele minuten grondig met de wegwerpplasticpipet; het is belangrijk dat het mengsel goed gemengd is om een correcte polymerisatie van de PDMS in een later stadium te waarborgen. Giet de PDMS bovenop de wafer in de glazen Petrischaal. Het PDMS-mengsel in de Petrischaal zal veel luchtbellen bevatten die ontgast moeten worden.

Plaats de PDMS-petrischaal in een desiccator die is aangesloten op een vacuümpomp gedurende ongeveer 30 minuten, totdat alle bellen zijn verwijderd. Polymeriseer de PDMS door de petrischaal met de wafer bovenop een warmteplaat te plaatsen bij 120 °C gedurende één uur, gevolgd door 65 °C gedurende nog een uur. Verwijder na deze twee uur de aluminiumfolie-wafer en de gepolymeriseerde PDMS uit de glazen petrischaal.

Pel de aluminiumfolie in het PDMS vanaf de achterkant van de wafer af. Til vervolgens voorzichtig de PDMS-laag van de bovenkant van de wafer. Plaats de PDMS-laag ondersteboven op de werkbank, met de kanalen naar boven gericht, en snijd de op het PDMS afgedrukte individuele chipontwerpen voorzichtig uit met het scalpel.

Probeer ongeveer drie millimeter PDMS rond de randen van de kanalen te behouden. De volgende stap is het ponsen van gaten in de PDMS aan de uiteinden van de inlaat, uitlaat en het zijkanaal, zoals geïllustreerd in dit diagram. Om een gat te ponsen, duwt u een 20 gauge lure stub in een rechte lijn volledig door de PDMS heen.

Verwijder de PDMS-kolom in de lokstomp voordat u de stomp eruit trekt. Dit voorkomt opnieuw dat de PDMS-kolom het nieuw geponste gat blokkeert. Zodra alle gaten zijn geponst, worden de oppervlakken van de chip gereinigd van stofdeeltjes en PDMS-residuen door er schilderstape op aan te brengen en deze onmiddellijk weer te verwijderen.

Reinig op dezelfde wijze het dekglas waaraan de chip zal worden bevestigd. Plaats de chip en het dekglas onder de UV-lamp van een benchtop UV-ozonreiniger, met de zijden die aan elkaar gebonden moeten worden naar de lamp gericht, en stel deze zes tot acht minuten bloot aan UV-licht; plaats vervolgens de blootgestelde oppervlakken op elkaar. Tik voorzichtig langs de zijkanten van de chip om de hechting van de PDMS aan het dekglas te bevorderen en om eventuele luchtbellen te verwijderen.

Tik niet op de bovenkant van de kanaalstructuur, omdat de micropads hierdoor aan de afdekking kunnen hechten. Dit geldt ook voor het glas. Plaats de nieuw gemaakte microfluïdische opstelling gedurende één uur op een warmteplaat bij 100 °C.

Controleer vervolgens de hechting van het dekglas aan de PDMS-chip door de randen van de PDMS-chip voorzichtig iets op te tillen. Als dit niet mogelijk is, is de hechting geslaagd en is de chip klaar voor gebruik. Om de microfluïdische chip voor te bereiden op het laden van cellen, plaatst u de chip in de metalen houder met siliconengel tussen het glas van de chip en de metalen delen van de houder.

Draai de moeren voorzichtig aan om een waterdichte afsluiting te creëren en te voorkomen dat het glas breekt. Sluit dunne slangetjes aan op het zijkanaal en het uitlaatkanaal van de chip. Het gebruik van een pincet maakt het eenvoudiger om de slangetjes in de geponste gaten in te voeren.

Vul een spuit van 50 milliliter met luer-lock met kweekmedium. Verwijder de lucht uit de spuit en verbind deze opeenvolgend met een spuit. Filtreer een 20 gauge luer-stub, een korte, dikke slang en een dunne slang.

Plaats de spuit in de spuitpomp en spoel de pomp door totdat de dunne slang volledig met medium is gevuld. Steek de aan de spuit verbonden dunne slang in het inlaatkanaal van de chip en laat het medium met een snelheid van 10 µL per minuut door de chip stromen. Verzamel het medium dat de chip verlaat in een Petrischaal.

Het medium zal via het zijkanaal weglopen. Dit komt door het verschil in weerstand tussen het zijkanaal, dat is gemaakt van het grote stevige label, en het uitlaatkanaal. Plaats de chip op de microscooptafel en stel de focus van de microscoop in op de pads.

Om deze procedure te starten, verbindt u een spuit van vijf milliliter met een Luer-tip aan een Luer-stub van 20 gauge en een dikke slang. Vul de spuit met ongeveer één milliliter van de celsuspensie die in de chip moet worden geladen. De voorkeur gaat uit naar een celconcentratie voor het laden van tussen één en vijf maal 10⁶ cellen per milliliter.

Verlaag de stroomsnelheid van de spuitenpomp naar 0,5 µL per minuut. Het meest lastige deel van deze procedure is het laden van de cellen in de microfluïdische chip. Dit vereist gewoonlijk enige oefening.

Verbind de spuit met de celsuspensie met de buis van het uitlaatkanaal. Laad de cellen door op de zuiger van de spuit te drukken. Observeer voorzichtig via het oculair of het computerscherm hoe de cellen binnenkomen en zich onder de micropads nestelen.

Houd druk uit te oefenen op de zuiger totdat er voldoende cellen onder de pads zijn neergedaald. De optimale belading is één tot drie cellen per pad. Koppel de spuit die voor het laden van de cellen is gebruikt los en spoel het zijkanaal enkele minuten door met hogere stroomsnelheden om luchtbellen en/of cellen die de chip nog niet hebben verlaten te verwijderen.

Verlaag de stroomsnelheid van de spuitpomp opnieuw naar 0,5 µL per minuut en sluit het zijkanaal af door dit te verbinden met een dikke slang met een katheterstop aan het uiteinde. Verhoog de stroomsnelheid van de spuitpomp tot een uiteindelijke stroomsnelheid van één tot vijf µL per minuut. Stroomsnelheden kunnen variëren afhankelijk van het medium en de giststam.

Start een opname met de microscoop- en camera-instellingen die geschikt zijn voor het doel van het experiment. Dit is een voorbeeld van een time-lapse movie van een enkele wildtype E-cel die groeit op YPD. Er werden elke 10 minuten beelden van het medium gemaakt en de getoonde schaalbalk vertegenwoordigt vijf micrometers.

De cel produceert in totaal 30 knoppen voordat deze afsterft. De replicatieve levensduur kan worden bepaald door het aantal knoppen te tellen dat door een enkele moedercel wordt geproduceerd. Deze gegevens worden omgezet in een levensduurcurve door het percentage levensvatbare cellen uit te zetten tegen het aantal geproduceerde knoppen of het aantal generaties.

Deze figuur toont een voorbeeld van levensduurcurves verkregen voor een wild-type giststam en twee mutantstammen. Deletie van het SER2-gen resulteert in een kortere levensduur, terwijl deletie van het FOB1-gen resulteert in een langere levensduur. Mitochondriale morfologie als functie van de leeftijd kan worden bestudeerd met behulp van het microfluïdische apparaat.

Er werd een verouderingsexperiment uitgevoerd met BY 7 42 wild-type gistcellen die ILV 3G FP tot expressie brachten, dat gericht is op de mitochondriën. In deze figuur wordt een representatief voorbeeld van ouderdomsgerelateerde veranderingen in de mitochondriële morfologie in een enkele cel aangegeven door de witte pijl. Alle afbeeldingen zijn op dezelfde schaal weergegeven en de schaalbalk staat voor vijf micrometer.

De tweede time-lapse movie is van een enkele cel die ILV 3G FP tot expressie brengt uit het experiment waarbij de mitochondriale morfologie als functie van de leeftijd werd waargenomen. Beelden werden elke 30 minuten genomen en de schaalbalk staat voor vijf micrometer. Deze laatste figuur toont de mitochondriale morfologieën die waargenomen zijn in dezelfde set cellen bij verschillende replicatieve leeftijden: voor het produceren van hun eerste knop, na 10 knoppen en voorafgaand aan de dood.

Een voorbeeldafbeelding van elke morfologieklasse is opgenomen: tubulair, gefragmenteerd tubulair, en vlekken en grote vlekken. De morfologische veranderingen die worden waargenomen in cellen van middelbare leeftijd vertonen gelijkenissen met die welke eerder zijn gerapporteerd door cellen continu te monitoren terwijl ze delen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de replicatieve veroudering van gist, zoals waarom een gistcel veroudert, welke fenotypische veranderingen plaatsvinden en hoe deze de replicatieve levensduur van de gist beïnvloeden?

Na het bekijken van deze video weet u hoe u uw eigen microchips kunt maken en replicatieve veroudering in cellen kunt bestuderen met gebruik van vrijwel elke fluorescentiemicroscoop.