Continue hoge-resolutie Microscopische waarneming van Replicatieve Aging in Budding gist

Het algemene doel van deze procedure is om afzonderlijke haplo-gistcellen te volgen tijdens hun hele replicatieve levensduur. De eerste stap is het maken van een microfluïdische chip met een array van micropads. Vervolgens worden de gistcellen in de microfluïdische chip geladen en omdat het gebied onder de micropads een hoogte heeft die vergelijkbaar is met de diameter van een gistcel, zullen de cellen zich daar nestelen.

Vervolgens wordt een continue stroom vers medium toegepast op de gevangen gistcellen, en de opkomende dochtercellen worden weggespoeld door de stroom medium brightfield en fluorescentie. Microscopie wordt gebruikt om veranderingen in cel- of orgaanmorfologie, eiwitexpressie en eiwitlokalisatie die kunnen optreden bij verouderende gistcellen te visualiseren. Het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van de klassieke microdissectiemethode is dat het minder arbeidsintensief is en dat het langdurige continue microscopische beelden van de hele levensduur van individuele gistcellen mogelijk maakt.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in replicatief verouderen, kan het ook worden gebruikt voor studies die continue microscopische observatie over langere perioden vereisen. Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn in deze methode het moeilijk vinden omdat er bij bepaalde stappen van de productie van de micro feic chip zorgvuldig moet worden gehandeld. Bovendien kan het laden van de cellen in de micro feic chip enige ervaring vereisen.

De siliconenwafermal is geproduceerd door zachte litografie. Raadpleeg het bijbehorende protocol voor details over de productie. Snijd een stuk taai etiket in dunne stroken van ongeveer 0,5 millimeter bij drie millimeter.

Plaats de stroken met een scalpel voorzichtig op de siliconenwafermal iets boven de kanaalstructuur tussen de inlaatkanalen en de micro padre. Bedek vervolgens een glazen petrischaal met een dubbele laag aluminiumfolie en plaats de wafer in het petrischaal. De aluminiumfolie zal voorkomen dat PDMS zich tussen de wafer en het petrischaal verspreidt tijdens de productie van de microfluïdische chips.

Om de procedure voor het maken van microfluïdische chips te beginnen, plaatst u een lege plastic beker op de weegschaal en scheurt de weegschaal. Giet 40 gram PDMS-basis in de plastic beker. Voeg PDMS-hardingsmiddel toe in een gewichtsverhouding van één op 10, wat in dit geval ongeveer vier milliliter is.

Gebruik de wegwerpbare plastic pipet en meng gedurende enkele minuten grondig, het is belangrijk dat het mengsel goed gemengd is om later een goede polymerisatie van het PDMS te garanderen. Giet de PDMS bovenop de wafer in de glazen petrischaal. Het PDMS-mengsel in de petrischaal zal veel bubbels bevatten om te ontgassen.

Plaats de PDMS, de petrischaal in een desiccator verbonden met een vacuümpomp gedurende ongeveer 30 minuten totdat alle bubbels zijn verwijderd. Polymeriseer de PDMS door de petrischaal met de wafer op een heet plaatje bij 120 graden Celsius gedurende een uur te plaatsen, gevolgd door 65 graden Celsius gedurende nog eens een uur. Verwijder na de twee uur de aluminiumfoliewafer en gepolymeriseerd PDMS uit de glazen petrischaal.

Pel de aluminiumfolie af in PDMS van de achterkant van de wafer. Til vervolgens voorzichtig de laag PDMS van de bovenkant van de wafer. Plaats de PDMS-laag ondersteboven met de kanalen naar boven op de werkbank en snijd voorzichtig de enkele chipontwerpen uit die op het PDMS zijn gedrukt met de scalpel.

Probeer ongeveer drie millimeter PDMS rond de randen van de kanalen te behouden. De volgende stap is het ponsen van gaten in de PDMS aan de uiteinden van de inlaatuitlaat en het zijkanaal zoals geïllustreerd in dit diagram. Om een gat te ponsen, duwt u een 20 gauge lure-stuitje recht door de PDMS.

Verwijder de kolom PDMS in de lure-stuitje voordat u de stuitje eruit trekt. Dit voorkomt opnieuw dat de PDMS-kolom het nieuw geponste gat blokkeert. Zodra alle gaten zijn geponst, maakt u de oppervlakken van de chip schoon van stofdeeltjes en resterend PDMS door er scotchtape op te plaatsen en de tape onmiddellijk te verwijderen.

Maak ook het dekglas schoon waarop de chip zal worden bevestigd. Plaats de chip en het dekglas onder de UV-lamp van een tafelblad UV-ozonereiniger met de zijden die aan elkaar moeten worden vastgebonden, gericht naar de lamp, blootgesteld aan UV-licht gedurende zes tot acht minuten, en leg de blootgestelde oppervlakken bovenop elkaar. Tik zachtjes rond de zijden van de chip om de hechting van de PDMS aan het dekglas te bevorderen en om eventuele luchtbellen te verwijderen.

Tik niet op de kanaalstructuur omdat dit kan leiden tot het aanhechten van de micropads aan het glas. Plaats de nieuw gemaakte microfluïdische setup op een heet plaatje bij 100 graden Celsius gedurende een uur.

Controleer vervolgens de hechting van het dekglas aan de PDMS-chip door de randen van de PDMS-chip lichtjes op te tillen. Als dit niet mogelijk is, is de binding succesvol en is de chip klaar voor gebruik. Om de microfluïdische chip voor te bereiden op celbelasting, plaatst u de chip in de metalen houder met siliconengel tussen het glas van de chip en de metalen delen van de houder.

Om een waterdichte afdichting te maken, schroef de moeren voorzichtig vast om het glas niet te breken. Verbind dunne buizen met het zijkanaal en het uitlaatkanaal van de chip. Het gebruik van een pincet maakt het gemakkelijker om de buis in de geponste gaten te plaatsen.

Vul een 50 milliliter lure lock-sering met kweekmedium. Verwijder de lucht uit de spuit en sluit deze vervolgens aan op een spuit. Filter een 20 gauge lure-stuitje, een korte dikke buis en een dunne buis.

Plaats de spuit in de spuitpomp en snel vooruit totdat de dunne buis volledig gevuld is met medium. Duw de dunne buis die aan de spuit is verbonden in het inlaatkanaal van de en laat het medium met een snelheid van 10 microliters per minuut door de chip stromen. Verzamel het medium dat de chip verlaat in een petrischaal.

Het medium zal via het zijkanaal we