Name: In vivo twee-foton beeldvorming van ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in corticale neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Leer in vivo twee-fotonbeeldvorming om ervaringsafhankelijke moleculaire veranderingen in corticale neuronen te volgen met genetisch gecodeerde reporters. Deze methode maakt real-time onderzoek naar neuronale adaptatie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag L. Belluscio bedanken voor de operatie filmen apparatuur, D. Kwon voor het filmen van hulp, K. Liu voor videobewerking bijstand, en K. MacLeod voor alle achtergrondmuziek. KW erkent de genereuze steun van het NIMH afdeling Intramurale Research Programma&#39;s en de genen, Cognitie en Psychose Program. Dit werk werd ondersteund door de NIMH Intramurale Research Program (VC, YY, SMKW) en de NIAAA afdeling Intramurale klinische en biologische Research Program (VC, RMC, DML).

De experimentele procedures die hieronder worden beschreven werden goedgekeurd door het National Institute of Mental Health Animal Care en gebruik Comite en waren in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide voor de zorg en het gebruik van proefdieren. 1. Pre-operatieve voorbereiding <ol><li> Reinig alle gereedschap in een hete kraal sterilisator voor aseptische chirurgie, het reinigen van de operatie site met 70% ethanol, en zette schoon drop doeken. Draag steriele handschoenen. Verdoven van het dier met vers bereide 1,2% avertin oplossing gegeven van 0,02 ml / g, intraperitonially. U kunt ook verdoven met isofluraan gas via een neuskegel, 5% voor inductie, 1,5% voor onderhoud, met een passieve aaseter circuit. Controleer de anesthesie niveau met behulp van de staart of teen knijpt om volledige sedatie te garanderen. </li><li> Bedek het dier ogen met steriele oogzalf, en injecteer vers bereid dexamethason (0,2 mg / kg) en carprofen (5 mg / kg) subcutaneously de hersenen zwelling en ontsteking 11 voorkomen. Scheer het haar over de schedel tussen de oren, en steriliseer de huid met betadine scrub en drie afwisselende swabs van 70% ethanol. </li><li> Monteer het dier in een stereotaxisch operatie stadium met earbars, met watercirculatie verwarmingselement onder de dierenset bij 37 ° C. Controleer regelmatig het dier anesthesie niveaus, en een aanvulling op de oorspronkelijke verdoving dosis als dat nodig is. </li><li> Injecteer 200 ul van 0,5% Marcaine onder de hoofdhuid om het gebied te verdoven. Incise de huid en verwijder de huid flap over de schedel. Verwijder het periost en droog het gebied met schone wattenstaafjes. </li></ol> 2. Chronische Cranial Window Chirurgie <ol><li> Gebruik een hoge snelheid tandheelkundige boor met een 0,5 mm boor tot een 3-5 mm cirkel met een diameter zachtjes schetsen over de hersenen regio van belang. Van tijd tot tijd nat de boorlocatie met een steriele 0,9% zoutoplossing en duidelijke weg bot stof met schone wattenstaafjes. Als het bot bloedt, gebruik gelfoam geweekt met een steriele zoutoplossing om de bloeding vlek en tot het stopt met wachten. </li><li> Wanneer de laatste bot laag is bereikt, tillen en het bot eiland te verwijderen met fijne punt tang. Dura bijlagen bij de onderste plank van het bot zich kunnen voordoen als het venster steekt een bot hechtdraad. Deze moeten voorzichtig worden verwijderd als het bot flap wordt opgeheven. </li><li> Roll bevochtigd gel schuim zachtjes over de blootgelegde dura aan het oppervlak schoon te maken en voor elke durale bloeden te stoppen wachten Critical stap:. Niet verder voordat alle durale bloeden is gestopt. Bloed dat wordt gevangen in de craniale venster leidt meestal tot een ondoorzichtige raam. </li><li> Als het gebied van belang onder een locatie waar de dura is bijzonder dik, het verwijderen van de dura bovenstaande nodig zijn. Als dit het geval is, voorzichtig onder de dura scheiden van de pia met zeer fijne forceps, een kleine incisie in de opgeheven dura maken met een andere paar fijne pincetten, pak de snijranden en voorzichtigsplitsing van de dura. De dura is dun maar sterk, dus wees voorzichtig niet naar de hersenen snijden met de intacte randen van de dura. </li><li> Spoel het gebied met steriele ACSF of een steriele zoutoplossing. </li><li> Leg een steriele glazen dekglaasje (3-5 mm) over de dura of pia Critical stap:. Wanneer er te veel schedel curves gebruikt Kwiksil 12 hechtmiddel te vullen ruimten waar de dura of pia zou nauw contact niet met de dekglaasje in regio die niet worden afgebeeld. </li><li> Gebruik cyanoacrylaat gel om het elastomeer kleefmiddel en de randen van het dekglaasje bedekt dekken. Bedek de hele blootgesteld schedel met cyanoacrylaat gel of een krazyglue en tandheelkundig cement mengsel Critical stap:. Laat geen cyanoacrylaat gel naar de hersenen oppervlak niet aanraakt. </li><li> Embed een op maat gemaakte metalen kop fixatie bar aan de andere kant van de schedel. </li><li> Het dier terug naar een warme kamer herstel, na een injectie van intraperitonial ketoprofen, 5 mg / kg, for pijnbestrijding. Verdere analgetische nog twee dagen post-operatief. </li><li> Na twee weken van het postoperatieve herstel, het dier verdoven met isofluraan (5% voor inductie, 1,5% voor onderhoud), te monteren in een op maat gemaakte microscoop podium met een hoofd-fixatie frame, en controleer de craniale venster voor optische helderheid onder belichting met blauw licht. Brain oppervlak bloedvat duidelijkheid is een sterke aanwijzing van craniale venster kwaliteit. Indien het bloedvat randen scherp, het venster waarschijnlijk bruikbaar. De twee weken durende post-operatieve hersteltijd wordt aanbevolen om voldoende tijd voor het dier om te herstellen van een operatie mogelijk te maken. Craniale ramen meestal leeg te maken en te verbeteren in deze tijd, en blijven optisch transparant voor extra weken tot maanden tot hergroei van de schedel of verdikking van de dura degradeert venster kwaliteit. </li></ol> 3. Behavioral protocol en laser scanning van twee-foton microscopie <ol><li> Dieren met duidelijke cranial vensters worden blootgesteld aan een milieu stimulus of aan een gedrags training en daarna afgebeeld op het moment van maximale Arc-GFP expressie. Alvorens te beginnen met een gedrags-protocol gebruikt, dient het dier te worden bewaard in een consistente kooi-omgeving tot dag-tot-dag variatie te minimaliseren in de baseline Arc-GFP expressie niveaus. </li><li> Beginnen gedragstraining of milieu stimulatie paradigma, afhankelijk van de hersenen gebied van belang. Bijvoorbeeld kunnen dieren worden blootgesteld aan verschillende visuele omgevingen op opeenvolgende dagen, en afgebeeld dagelijks bij visuele stimulatie stimulus-specifieke responsen te identificeren in de visuele cortex 10. </li><li> Arc-GFP-fluorescentie in neuronen bereikt doorgaans een piek niveau twee uur na stimulatie. De experimentele tijdlijn kan worden geoptimaliseerd voor het detecteren van Arc-GFP expressie in neuronen bevorderen op hun hoogtepunt fluorescentieniveaus. </li><li> Na een gedrags-training of milieuveranderingenl stimulatie is voltooid, verdoven van het dier met isofluraan (5% voor inductie, 1,5% voor onderhoud) en monteer het dier in de custom-made microscoop podium met hoofd-fixatie frame onder de twee-foton microscoop. </li><li> Het dier hoofdpositie is bevestigd aan het hoofd-bevestigingskaderplaat die rechtstreeks op de fase met de geïmplanteerde metalen staaf op de schedel. Isofluraan en zuurstof continu toegevoerd aan de muis via een neuskegel. De lichaamstemperatuur wordt onderhouden met behulp van een verwarmingselement. </li><li> Zorg ervoor dat de microscoop detectoren worden beschermd tegen omgevingslicht door het uitvoeren van twee-foton laser scanning in een donkere kamer. Gebruik een 20x of 25x (1,05 numerieke apertuur) water immersie lens voor de beeldvorming. Ten eerste, onder epi-fluorescentie verlichting, verwerven een beeld van het oppervlak bloedvat patronen over het gebied van de hersenen van belang met een CCD-camera voor toekomstige beeld uitlijning. </li><li> Start twee-foton laser scanning om een ​​3-D beeld stack te verwerven. Een Olympus FV1000MPE multi-foton microscoop wordt gebruikt in onze setup. De excitatie golflengte van de twee-foton laser ingesteld op 920 nm, en de kracht van de laser uitgezonden door het doel is ingesteld op ongeveer 50 mW. Uitgezonden fluorescentie wordt gelijktijdig gedetecteerd in groen en rood kanalen (dichroïsche spiegel bij 570 nm, barrière filters op 495 tot 540 nm en 570 tot 625 nm), met behulp van een externe tweekanaals photomutiplier detectiesysteem dicht in de buurt met het model. Arc-GFP-fluorescentie verschijnt alleen in het groene kanaal, terwijl weefsel auto-fluorescentie wordt in beide kanalen 13, 14. </li><li> Typische afbeeldingsstapels hebben afmetingen van ongeveer 320x320x100 urn (breedte x lengte x diepte), een horizontale resolutie van 0,5 pm / pixel en een verticale resolutie van 3 um / pixel. </li><li> Na het verkrijgen van het beeld stack, de terugkeer van de dieren naar de kooi. Laat het dier niet te verstoren tot de volgende gedrags-en imaging-sessie. Herhaal het gedrag en beeldvorming procedure over dagen als wenselijked.. Gebruik de eerder verworven hersenoppervlak bloedvat beeld te oriënteren terug naar dezelfde beeldvorming locatie. </li></ol>

<ol><li>Leslie, J. H., Nedivi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-regulated+genes+as+mediators+of+neural+circuit+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Activity-regulated genes as mediators of neural circuit plasticity.</a> Progress in neurobiology. 94 (3), 223-237 (2011).</li>
<li>Flavell, S. W., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+mechanisms+linking+neuronal+activity+to+gene+expression+and+plasticity+of+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Signaling mechanisms linking neuronal activity to gene expression and plasticity of the nervous system.</a> Annual review of neuroscience. 31, 563-590 (2008).</li>
<li>Guzowski, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+behaviorally+relevant+neural+circuits+with+immediate-early+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Mapping behaviorally relevant neural circuits with immediate-early gene expression.</a> Current opinion in neurobiology. 15 (5), 599-606 (2005).</li>
<li>Barth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+circuits+and+systems+using+transgenic+reporters+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Visualizing circuits and systems using transgenic reporters of neural activity.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 17 (5), 567-5671 (2007).</li>
<li>Lyford, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+growth+factor+and+activity-regulated+gene%2C+encodes+a+novel+cytoskeleton-associated+protein+that+is+enriched+in+neuronal+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">a growth factor and activity-regulated gene, encodes a novel cytoskeleton-associated protein that is enriched in neuronal dendrites.</a> Neuron. 14 (2), 433-445 (1995).</li>
<li>Link, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatodendritic+expression+of+an+immediate+early+gene+is+regulated+by+synaptic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Somatodendritic expression of an immediate early gene is regulated by synaptic activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5734-5738 (1995).</li>
<li>Shepherd, J. D., Bear, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+views+of+Arc%2C+a+master+regulator+of+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">New views of Arc, a master regulator of synaptic plasticity.</a> Nature neuroscience. 14 (3), 279-284 (2011).</li>
<li>Fu, M., Zuo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+plasticity+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural plasticity in the cortex.</a> Trends in Neurosciences. 34 (4), 177-187 (2011).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Wang, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+a+role+of+arc+in+enhancing+orientation+specificity+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals a role of arc in enhancing orientation specificity in visual cortex.</a> Cell. 126 (2), 389-402 (2006).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J. Vis. Exp. (12), e680(2008).</li>
<li>Dombeck, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Large-Scale+Neural+Activity+with+Cellular+Resolution+in+Awake%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+Mice.+Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake.</a> Mobile Mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).</li>
<li>Zipfel, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+tissue+intrinsic+emission+microscopy+using+multiphoton-excited+native+fluorescence+and+second+harmonic+generation%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation.</a> PNAS. 100 (12), 7075-7080 (2003).</li>
<li>Eichhoff, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcium+imaging+of+the+aging+and+diseased+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Nucl.+Med.+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">In vivo calcium imaging of the aging and diseased brain.</a> Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 99-106 (2008).</li>
<li>Klohs, J., Rudin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+molecular+events+in+the+brain+by+noninvasive+imaging.+The+Neuroscientist%3A+a+review+journal+bringing+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22neurology+and+psychiatry%22%5BJournal%5D)">Unveiling molecular events in the brain by noninvasive imaging. The Neuroscientist: a review journal bringing neurobiology.</a> neurology and psychiatry. 17 (5), 539-559 (2011).</li>
<li>Chen, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chamber+and+artificial+dura+method+for+long-term+optical+imaging+in+the+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">A chamber and artificial dura method for long-term optical imaging in the monkey.</a> Journal of neuroscience. 113 (1), 41-419 (2002).</li>
<li>Kleinfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).</li>
<li>Barretto, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+disease+progression+in+deep+brain+areas+using+fluorescence+microendoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy.</a> Nature medicine. 17 (2), 223-228 (2011).</li>
<li>Stosiek, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De in vivo imaging hier beschreven werkwijze kan herhaald onderzoek Arc genexpressie verandert op dezelfde sets van neuronen gedurende meerdere dagen in het levende dier. Het is een efficiënte en veelzijdige methode om informatie over neurale plasticiteit gerelateerde moleculaire dynamica in individuele neuronen verkrijgen in reactie op verschillende gedrag vertonen. Standaard histochemische methoden zoals in situ hybridisatie en immunohistochemie kan eencellige resolution 3 bereiken, maar m...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Apparatuur </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> FV1000 multi-foton laser scanning microscoop </td><td> Olympus </td><td> FV1000MPE </td><td> Imaging </td></tr><tr><td> Dissectie microscoop </td><td> Omano </td><td> 555V107 </td><td> Chirurgie </td></tr><tr><td> Stereotaxis chirurgie podium voor muizen </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 726335 </td><td> Chirurgie </td></tr><tr><td> 20X of 25X water immersie objectief </td><td> Olympus </td><td> XLPL25XWMP </td><td> Imaging </td></tr><tr><td> Microscoop podium met hoofd-fixatie kader </td><td> Custom made </td><td> N / A </td><td> Imaging </td></tr><tr><td> Fijne tang </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.251-20 </td><td> Chirurgie </td></tr><tr><td> Dental boor braam </td><td> Fine Science Tools </td><td> 19.007-05 </td><td> Chirurgie </td></tr><tr><td> CCD camera </td><td> QImaging </td><td> QICAM 12-bit </td><td> Imaging </td></tr></tbody></table>

in vivo twee-foton beeldvorming van ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in corticale neuronen

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

De hersenen het vermogen te veranderen in reactie op ervaring is essentieel voor gezonde hersenfunctie, en afwijkingen in dit proces bijdragen van verschillende hersenaandoeningen 1,2. Om een ​​beter begrip van de mechanismen waarmee hersencircuits reageren bieden een dier vereist het vermogen om de ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in een bepaalde set van neuronen monitoren gedurende een langere periode, in het levende dier. De ervaring en bijbehorende neurale activiteit bekend genexpressie veranderingen in neuronen 1,2 veroorzaken de meeste methoden om dergelijke veranderingen te detecteren niet mogelijk herhaalde waarneming van dezelfde neuronen over meerdere dagen of niet voldoende resolutie om acht individuele neuronen 3 , 4. We beschrijven een methode die in vivo twee-foton microscopie combineert met een genetisch gecodeerd fluorescerende reporter ervaring-afhankelijke genexpressie in de individuele corticale neuronen volgen de<html> loop van dag tot dag bieden. Een van de gevestigde ervaring-afhankelijke genen is Activity-gereguleerde cytoskelet geassocieerde eiwit (Arc) 5,6. De transcriptie van Arc is zeer snel en zeer geïnduceerd door verscherpte neuronale activiteit 3 en het eiwitproduct reguleert de endocytose van glutamaatreceptoren en langdurige synaptische plasticiteit 7. De expressie van Arc is op grote schaal gebruikt als een moleculaire marker om neuronale circuits betrokken bij specifieke gedrag 3 kaart. In de meeste van deze studies werd Arc expressie gedetecteerd door in situ hybridisatie of immunohistochemie in vaste hersencoupes. Hoewel deze methoden blijkt dat de expressie van Arc werd gelokaliseerd op een subset van neuronen na exciterend gedrag bieden, hoe de patronen van cellulaire Arc expressie kan veranderen met meerdere episodes van herhaalde onderscheidend ervaringen over dagen niet onderzocht. ntent &quot;&gt; In vivo twee-foton microscopie een krachtige manier om ervaring op-afhankelijke cellulaire veranderingen in het levende brein 8,9 onderzoeken biedt. Om het onderzoek van de Arc expressie in levende neuronen mogelijk te maken door twee-foton microscopie, we eerder genereerde een knock- in muizenlijn waarin een GFP reporter wordt geplaatst onder de controle van de endogene promoter Arc 10. Dit protocol beschrijft chirurgische preparaten en imaging procedures voor het bijhouden bieden afhankelijke Arc-GFP expressie patronen in neuronale ensembles in het levende dier. In deze werkwijze , chronische craniale ramen werden eerst geïmplanteerd in Arc-GFP muizen over de corticale gebieden plaats. Deze dieren werden vervolgens herhaaldelijk afgebeeld door twee-foton microscopie na gewenste gedragsparadigma&#39;s in de loop van enkele dagen. Deze methode kan algemeen voor dieren met andere fluorescerende verslaggevers van ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen 4.

<html> Dit protocol beschrijft een methode om ervaring afhankelijke moleculaire veranderingen in individuele corticale neuronen in levende dieren volgen. Een chronische craniale venster is voor het eerst gemaakt over een corticaal gebied van interesse in een muis die een fluorescerende reporter van genexpressie. Twee-foton microscopie kan vervolgens worden gecombineerd met verschillende gedrag paradigma gedragsmatig geïnduceerde moleculaire veranderingen in individuele neuronen waarnemen en volgen deze wijzigingen in dez...

Ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in neuronen zijn essentieel voor het vermogen van de hersenen aan te passen als reactie op gedrags-uitdagingen. Een<em&gt; In vivo</em&gt; Twee-foton beeldvorming methode wordt hier beschreven die het mogelijk maakt het volgen van dergelijke moleculaire veranderingen in individuele corticale neuronen door middel van genetisch gecodeerd verslaggevers.

In vivo twee-foton beeldvorming van ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in corticale neuronen

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Ervaringsafhankelijke moleculaire veranderingen in neuronen zijn essentieel voor het vermogen van de hersenen om zich aan te passen in reactie op gedragsdagen. Hier wordt een in vivo twee-foton beeldvormingsmethode beschreven die het mogelijk maakt om dergelijke moleculaire veranderingen in individuele corticale neuronen te volgen door middel van genetisch gecodeerde reporters. Een van de bekende ervaringsafhankelijke genen is het activiteit gereguleerd cytoskelet-geassocieerd eiwit of arc.De transcriptie van ARC wordt snel en sterk geïnduceerd door versterkte neuronale activiteit. Om de expressie van arc in levende neuronen door middel van twee foton microscopie te onderzoeken, maken we gebruik van een knockin muislijn waarin een GFP reporter onder de controle van de endogene arc promotor wordt geplaatst. Dit protocol beschrijft de chirurgische voorbereidingen en beeldvormingsprocedures voor het volgen van ervaringsafhankelijke arc GFP expressiepatronen in neuronale ensembles in het levende dier. Eerst beschrijven we de diervoorbereiding die nodig is voor deze techniek.Een arc GFP dier zal een craniumvensteroperatie ondergaan en zich gedurende ongeveer twee weken herstellen van de operatie. De kwaliteit van het craniale venster wordt vervolgens gecontroleerd en als neuronen erdoorheen kunnen worden geïmagingd, wordt het dier in een qua-omgeving geplaatst tot het begin van gedrags- en twee foton beeldvormingsexperimenten. Deze dieren worden vervolgens herhaaldelijk geïmaged door middel van twee foton microscopie.Nadat de gewenste gedragsparadigma's gedurende enkele dagen zijn voltooid, reinig alle gereedschappen in een hete kralensterilisator. Reinig voor aseptische chirurgie de operatieplaats met 70%ethanol en leg schone afdekdoeken neer. Anesthesieer het dier met 1,2%Everton-oplossing gegeven op 0,02 milliliter per gram intraperitoneaal.Controleer het anesthesieniveau met behulp van staart- of tenenprikjes om volledige sedatie te garanderen. Bedek de ogen van het dier met steriele oogzalf en injecteer Dexamethason 0,2 milligram per kilogram en carprofen vijf milligram per kilogram subcutaan. Scheer het haar boven de schedel tussen de oren en steriliseer de huid met Betadine scrub en drie afwisselende watten met 70%Ethanol. Monteer het dier in een stereotactische operatiestand met oorstaven en een watercirculatie verwarmingskussen onder het dier ingesteld op 37 graden.Controleer regelmatig de anesthesieniveaus van het dier en vul de originele anesthesiedosering aan als nodig. Injecteer 200 microliter 0,5%Marcaine onder de schedelhuid om het gebied te verdoven, snij de huid in en verwijder de huidflap boven de schedel. Verwijder het periost en droog het gebied af met schone wattenstaafjes.Gebruik een hoge snelheid tandborstel met een 0,5 millimeter boor om voorzichtig een cirkel van drie tot vijf millimeter diameter boven de hersengebied van belang te omlijnen, afhankelijk van uw behoeften. Bevochtig het boorpunt regelmatig met steriele 0,9%zoutoplossing en verwijder botdeeltjes met schone wattenstaafjes. Als het bot bloedt, gebruik dan gelfoam vooraf gedrenkt in steriele zoutoplossing om het bloed te doven en wacht tot het ophoudt.Wanneer de laatste botlaag is bereikt, til en verwijder het boteiland met fijnpuntige pincetten. U kunt duurale bevestigingen aan de onderste plank van het bot tegenkomen. Als uw venster een botnaad kruist, moeten deze voorzichtig worden verwijderd.Terwijl het botflapje wordt opgetild, rolt u vochtig en gelfoam voorzichtig over de blootgestelde dura om het oppervlak te reinigen en wacht u tot het duurbloeden stopt. Als uw gebied van belang zich onder een locatie met een bijzonder dikke dura bevindt, kan het noodzakelijk zijn om de dura erboven te verwijderen. Als dit het geval is, scheidt u de dura voorzichtig van de PIA eronder met zeer fijne pincetten.Maak een kleine incisie in de opgetilde dura met een ander paar fijne pincetten. Grijp vervolgens de gesneden randen en splits de dura voorzichtig. De dura is dun maar sterk, dus wees voorzichtig om de hersenen niet te snijden met de intacte randen van de dura.Terwijl u terugwerkt en weg van uw gebied van belang, spoelt u het gebied royaal met steriele A CSF of steriele zoutoplossing. Als de omringende schedel aanzienlijk om de blootgestelde dura of pia kroont, gebruik dan snel cellenlijm om ruimtes op te vullen die geen nauwe contact zouden maken met de vensterafdekking in gebieden die niet zullen worden geïmaged. Leg vervolgens een steriele glazen afdekking voorzichtig over de dura of pia.Gebruik Sano acrylgel om het elastomere kleefmiddel en de randen van het glas te bedekken. Afdekking. Bedek de volledige blootgestelde schedel met Sano cyanoacrylaatgel of een mix van crazy glue en tandcement.Bevestig een op maat gemaakte metalen hoofdfixatiebalk aan het tegenovergestelde uiteinde van de schedel. Breng het dier terug naar een warm herstelgedeelte na een intraperitoneale injectie van ketoprofen vijf milligram per kilogram voor pijnbeheersing. Ga door met de pijnstiller gedurende twee dagen na de operatie.Na twee weken postoperatief herstel, anesthesieer het dier met ISO fluor. 5%voor inductie, 1,5%voor onderhoud. Monteer het in een op maat gemaakte microscoopstandaard met een hoofdfixatieframe en controleer het craniale venster op optische helderheid.Onder verlichting met blauw licht is de helderheid van de bloedvaten op het oppervlak van de hersenen zeer indicatief voor de kwaliteit van het craniale venster. Als de randen scherp gedefinieerd zijn, is het waarschijnlijk dat het venster bruikbaar is. Voordat een gedragsprotocol begint, moet het dier in een consistente thuiscangewoonte worden gehouden om dag-tot-dag variatie te minimaliseren.In baseline arc, beginnen GFP expressieniveaus gedragstraining of omgevingsstimulatie paradigma's afhankelijk van het hersengebied van belang. Bijvoorbeeld, dieren kunnen over opeenvolgende dagen worden blootgesteld aan verschillende visuel

in-vivo-two-photon-imaging-experience-dependent-molecular-changes

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Om te begrijpen netwerk dynamiek van microcircuits in de neocortex, is het essentieel om tegelijkertijd op te nemen van de activiteit van een groot aantal neuronen. In-vivo twee-foton calcium beeldvorming is de enige methode die het mogelijk maakt een op te nemen van de activiteit van een dichte neuronale populatie met single-cell resolutie.

In vivo 2-Photon Imaging Calcium in Layer 2 / 3 van Muizen

Een minimaal invasieve protocol om de muis te wervelkolom te stabiliseren en uit te voeren...

In vivo beeldvorming van de muis ruggenmerg met behulp van twee-foton Microscopie

Source: Mizuno, H., et al. In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice. J. Vis. Exp. (2018)This video showcases two-photon microscopy being used to image neurons in the brain of an anesthetized transgenic mouse pup. The two-photon laser allows for deeper imaging with high spatial resolution and minimal light scattering, enabling the detailed capture of neuronal morphology, including dendritic projections.

Two-Photon Microscopy for Imaging Neuronal Morphology  in a Mouse Pup

Source: Kamei, R., et. al., In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus. J. Vis. Exp. (2022)The video demonstrates the setup and imaging process for in vivo two-photon microscopy of microglial dynamics in the hippocampal CA1 (Cornu ammonis 1) and dentate gyrus, ensuring optimal optical alignment and structural integrity assessment.

In Vivo Two-Photon Imaging of Microglial Dynamics in the Mouse Hippocampus

Een werkwijze wordt beschreven voor het labelen neuronen met fluorescente kleurstoffen in voorafbepaalde functionele micro-domeinen van de neocortex. Eerst wordt intrinsieke optisch imaging gebruikt om een ​​functionele kaart te verkrijgen. Dan twee-foton microscopie wordt gebruikt om het etiket en beeld neuronen binnen een micro-domein van de kaart.

Gerichte Labeling van neuronen in een specifiek functioneel Micro-domein van de neocortex door combinatie van intrinsieke signaal en twee-foton Imaging

Time-lapse beeldvorming in het levende dier levert waardevolle informatie over structurele reorganisatie in de intacte hersenen. Hier introduceren we een voorbereiding met een verdunde schedel die transcraniële beeldvorming mogelijk maakt van fluorescent gelabelde synaptische structuren in de levende muizencortex door middel van twee-foton microscopie.

Twee-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging van vertakte stekels in de Mouse Cortex met een uitgedunde schedel Voorbereiding

Deze video toont de craniotomieprocedure die chronische beeldvorming van neuronen in de retrospleniale cortex van muizen mogelijk maakt met in vivo twee-foton microscopie in de Thy1-GFP transgene lijn. Deze benadering wordt gecombineerd met injectie van mCherry-expresserend adeno-geassocieerd virus in de dorsale hippocampus. Deze technieken maken langdurige monitoring van ervaringsafhankelijke structurele plasticiteit in RSC mogelijk.

Simultane twee-foton<em&gt; In Vivo</em&gt; Beeldvorming van Synaptic In- en Postsynaptische Doelen op Mouse retrospleniale Cortex

We presenteren een in vivo twee-foton imaging protocol voor beeldvorming van de hersenschors van neonatale muizen. Deze methode is geschikt voor het analyseren van de ontwikkelingstoxiciteit dynamiek van corticale neuronen, de moleculaire mechanismen waarmee de neuronale dynamiek, en de veranderingen in de dynamiek van de neuronale in ziekte modellen.

In Vivo Twee-foton beeldvorming van corticale neuronen in neonatale muizen

Deze methode beschrijft een chronische voorbereiding die optische toegang tot de hippocampus van levende muizen mogelijk maakt. Deze voorbereiding kan worden gebruikt voor het uitvoeren van longitudinale optische beeldvorming van neuronale structurele plasticiteit en activiteit-opgeroepen cellulaire plasticiteit over een periode van enkele weken.

Longitudinale Two-photon beeldvorming van dorsale Hippocampal CA1 in levende muizen

Dit artikel beschrijft een methode voor chronische in vivo observatie van de rustende microglia in de hippocampus CA1 van de muis met behulp van nauwkeurig gecontroleerde chirurgie en twee-fotonenmicroscopie.

In Vivo Chronische twee-foton beeldvorming van microglia in de hippocampus van de muis

Leer in vivo twee-fotonbeeldvorming om ervaringsafhankelijke moleculaire veranderingen in corticale neuronen te volgen met genetisch gecodeerde reporters. Deze methode maakt real-time onderzoek naar neuronale adaptatie mogelijk.

In vivo twee-foton beeldvorming van ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in corticale neuronen

Meer video's verkennen