In vivo twee-foton beeldvorming van ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in corticale neuronen
5 januari 2013
Ervaring-afhankelijke moleculaire veranderingen in neuronen zijn essentieel voor het vermogen van de hersenen aan te passen als reactie op gedrags-uitdagingen. Een In vivo Twee-foton beeldvorming methode wordt hier beschreven die het mogelijk maakt het volgen van dergelijke moleculaire veranderingen in individuele corticale neuronen door middel van genetisch gecodeerd verslaggevers.
Ervaringsafhankelijke moleculaire veranderingen in neuronen zijn essentieel voor het vermogen van de hersenen om zich aan te passen in reactie op gedragsdagen. Hier wordt een in vivo twee-foton beeldvormingsmethode beschreven die het mogelijk maakt om dergelijke moleculaire veranderingen in individuele corticale neuronen te volgen door middel van genetisch gecodeerde reporters. Een van de bekende ervaringsafhankelijke genen is het activiteit gereguleerd cytoskelet-geassocieerd eiwit of arc.
De transcriptie van ARC wordt snel en sterk geïnduceerd door versterkte neuronale activiteit. Om de expressie van arc in levende neuronen door middel van twee foton microscopie te onderzoeken, maken we gebruik van een knockin muislijn waarin een GFP reporter onder de controle van de endogene arc promotor wordt geplaatst. Dit protocol beschrijft de chirurgische voorbereidingen en beeldvormingsprocedures voor het volgen van ervaringsafhankelijke arc GFP expressiepatronen in neuronale ensembles in het levende dier. Eerst beschrijven we de diervoorbereiding die nodig is voor deze techniek.
Een arc GFP dier zal een craniumvensteroperatie ondergaan en zich gedurende ongeveer twee weken herstellen van de operatie. De kwaliteit van het craniale venster wordt vervolgens gecontroleerd en als neuronen erdoorheen kunnen worden geïmagingd, wordt het dier in een qua-omgeving geplaatst tot het begin van gedrags- en twee foton beeldvormingsexperimenten. Deze dieren worden vervolgens herhaaldelijk geïmaged door middel van twee foton microscopie.
Nadat de gewenste gedragsparadigma's gedurende enkele dagen zijn voltooid, reinig alle gereedschappen in een hete kralensterilisator. Reinig voor aseptische chirurgie de operatieplaats met 70%ethanol en leg schone afdekdoeken neer. Anesthesieer het dier met 1,2%Everton-oplossing gegeven op 0,02 milliliter per gram intraperitoneaal.
Controleer het anesthesieniveau met behulp van staart- of tenenprikjes om volledige sedatie te garanderen. Bedek de ogen van het dier met steriele oogzalf en injecteer Dexamethason 0,2 milligram per kilogram en carprofen vijf milligram per kilogram subcutaan. Scheer het haar boven de schedel tussen de oren en steriliseer de huid met Betadine scrub en drie afwisselende watten met 70%Ethanol. Monteer het dier in een stereotactische operatiestand met oorstaven en een watercirculatie verwarmingskussen onder het dier ingesteld op 37 graden.
Controleer regelmatig de anesthesieniveaus van het dier en vul de originele anesthesiedosering aan als nodig. Injecteer 200 microliter 0,5%Marcaine onder de schedelhuid om het gebied te verdoven, snij de huid in en verwijder de huidflap boven de schedel. Verwijder het periost en droog het gebied af met schone wattenstaafjes.
Gebruik een hoge snelheid tandborstel met een 0,5 millimeter boor om voorzichtig een cirkel van drie tot vijf millimeter diameter boven de hersengebied van belang te omlijnen, afhankelijk van uw behoeften. Bevochtig het boorpunt regelmatig met steriele 0,9%zoutoplossing en verwijder botdeeltjes met schone wattenstaafjes. Als het bot bloedt, gebruik dan gelfoam vooraf gedrenkt in steriele zoutoplossing om het bloed te doven en wacht tot het ophoudt.
Wanneer de laatste botlaag is bereikt, til en verwijder het boteiland met fijnpuntige pincetten. U kunt duurale bevestigingen aan de onderste plank van het bot tegenkomen. Als uw venster een botnaad kruist, moeten deze voorzichtig worden verwijderd.
Terwijl het botflapje wordt opgetild, rolt u vochtig en gelfoam voorzichtig over de blootgestelde dura om het oppervlak te reinigen en wacht u tot het duurbloeden stopt. Als uw gebied van belang zich onder een locatie met een bijzonder dikke dura bevindt, kan het noodzakelijk zijn om de dura erboven te verwijderen. Als dit het geval is, scheidt u de dura voorzichtig van de PIA eronder met zeer fijne pincetten.
Maak een kleine incisie in de opgetilde dura met een ander paar fijne pincetten. Grijp vervolgens de gesneden randen en splits de dura voorzichtig. De dura is dun maar sterk, dus wees voorzichtig om de hersenen niet te snijden met de intacte randen van de dura.
Terwijl u terugwerkt en weg van uw gebied van belang, spoelt u het gebied royaal met steriele A CSF of steriele zoutoplossing. Als de omringende schedel aanzienlijk om de blootgestelde dura of pia kroont, gebruik dan snel cellenlijm om ruimtes op te vullen die geen nauwe contact zouden maken met de vensterafdekking in gebieden die niet zullen worden geïmaged. Leg vervolgens een steriele glazen afdekking voorzichtig over de dura of pia.
Gebruik Sano acrylgel om het elastomere kleefmiddel en de randen van het glas te bedekken. Afdekking. Bedek de volledige blootgestelde schedel met Sano cyanoacrylaatgel of een mix van crazy glue en tandcement.
Bevestig een op maat gemaakte metalen hoofdfixatiebalk aan het tegenovergestelde uiteinde van de schedel. Breng het dier terug naar een warm herstelgedeelte na een intraperitoneale injectie van ketoprofen vijf milligram per kilogram voor pijnbeheersing. Ga door met de pijnstiller gedurende twee dagen na de operatie.
Na twee weken postoperatief herstel, anesthesieer het dier met ISO fluor. 5%voor inductie, 1,5%voor onderhoud. Monteer het in een op maat gemaakte microscoopstandaard met een hoofdfixatieframe en controleer het craniale venster op optische helderheid.
Onder verlichting met blauw licht is de helderheid van de bloedvaten op het oppervlak van de hersenen zeer indicatief voor de kwaliteit van het craniale venster. Als de randen scherp gedefinieerd zijn, is het waarschijnlijk dat het venster bruikbaar is. Voordat een gedragsprotocol begint, moet het dier in een consistente thuiscangewoonte worden gehouden om dag-tot-dag variatie te minimaliseren.
In baseline arc, beginnen GFP expressieniveaus gedragstraining of omgevingsstimulatie paradigma's afhankelijk van het hersengebied van belang. Bijvoorbeeld, dieren kunnen over opeenvolgende dagen worden blootgesteld aan verschillende visuel
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een in vivo twee-foton imaging-methode om ervaringsafhankelijke moleculaire veranderingen in individuele corticale neuronen te volgen. Deze veranderingen zijn cruciaal voor de aanpassing van de hersenen aan gedragsmatige uitdagingen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Ervaringsafhankelijke moleculaire veranderingen zijn essentieel voor neuronale adaptatie.
- Activity regulated cytoskeletal associated protein (ARC) is een sleutelgen dat hierbij betrokken is.
- ARC-expressie wordt geïnduceerd door verhoogde neuronale activiteit.
- Het volgen van ARC-expressie in levende neuronen biedt inzicht in het neuronale gedrag.
Doel van de studie
- Om de expressiepatronen van ARC in levende neuronen te onderzoeken.
- Om genetisch gecodeerde reporters te gebruiken voor real-time imaging.
- Om het begrip van neuronale reacties op ervaringen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een knock-in muislijn met een GFP-reporter onder de arc-promoter.
- Chirurgische preparaties voor beeldvorming in levende dieren.
- Tweefotonmicroscopie voor het volgen van expressiepatronen.
- Analyse van neuronale ensembles tijdens gedragsmatige uitdagingen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle tracking van ARC GFP-expressie in levende corticale neuronen.
- De impact van ervaring op moleculaire veranderingen in neuronen is aangetoond.
- Een methode voor het bestuderen van neuraal gedrag in real-time is verschaft.
- Heeft bijgedragen aan het begrip van de mechanismen van neurale adaptatie.
Conclusies
- De tweefoton-beeldgevingsmethode is effectief voor het bestuderen van neuronale veranderingen.
- ARC speelt een belangrijke rol bij de neuronale aanpassing aan ervaringen.
- Deze benadering kan worden toegepast op andere ervaringsafhankelijke genen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Het over tijd volgen van ervaringsafhankelijke moleculaire veranderingen in individuele neuronen maakt een mechanische risicobeoordeling mogelijk van therapeutische targets die gekoppeld zijn aan neuroplasticiteit en cognitieve stoornissen. Deze methode ondersteunt targetvalidatie door neuronale activiteit te koppelen aan genexpressiedynamiek in ziekterelevante systemen, waardoor het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase wordt vergroot. Het biedt een translationeel biomarkerkader voor het beoordelen van de effecten van verbindingen op de adaptatie van corticale circuits.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door Arc-GFP-expressie te monitoren als moleculaire proxy voor neuronale activatiepatronen.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door longitudinale observatie van dezelfde neuronale ensembles over meerdere gedragsepisodes heen.
- Voorspellende waarde: Faciliteert portfolio-triage door dynamiek van immediate-early-genen te koppelen aan mechanismen van synaptische plasticiteit die ten grond liggen aan cognitieve fenotypes.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert gevalideerde biologische systemen (chronische craniale vensters in Arc-GFP-muizen) voor reproduceerbare, kwantitatieve fluorescentie-metingen.
- Schaalbaarheid: Maakt gestandaardiseerde imagingsessies over meerdere dagen mogelijk, wat screening van verbindingen in ervaringsafhankelijke paradigma's ondersteunt.
- Kwaliteit van de output: Levert spatiotemporele data met een hoge resolutie over veranderingen in genexpressie in individuele corticale neuronen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Volgt moleculaire veranderingen in corticale neuronen die relevant zijn voor neuropsychiatrische en neurodegeneratieve aandoeningen waarbij sprake is van aberrante plasticiteit.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen target engagement in de ontdekkingsfase en preklinische validatie via ervaringsafhankelijke monitoring van biomarkers.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Informeert de criteria voor verdere ontwikkeling door de targetmodulatie in levende neurale circuits over tijd te kwantificeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van het testen van target-hypotheses via lead-identificatie tot de preklinische beoordeling van de werkzaamheid, door dynamische read-outs van neuronale moleculaire responsen te bieden.
- Discovery Biology: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door activiteitsafhankelijke genreguleringspaden in corticale neuronen te verduidelijken.
- Screening: Levert assay-klare preparaten met kwantitatieve, cel-specifieke fluorescentie-outputs voor de evaluatie van de respons op verbindingen.
- Analytics: Maakt longitudinale tracking van expressiepieken mogelijk (bijv. Arc-GFP 2u na stimulatie) om condities over meerdere dagen te vergelijken.
- Translationeel Onderzoek: Sluit aan bij biomarker-strategieën door ervaring-gedreven moleculaire veranderingen te koppelen aan functionele circuitadaptaties.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor het bestuderen van elk ervaring-afhankelijk gen via promoter-gestuurde fluorescerende reporters.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij target-validatie door neuronale activiteit te correleren aan de expressie van immediate-early genen.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid door middel van chronische window-implantaten en vaste imaging-parameters.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door direct bewijs te leveren van target-engagement in levende corticale circuits.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk op basis van longitudinale biomarker-dynamiek in ziekterelateerde neuronale ensembles.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in schedelvensterchirurgie, twee-fotonmicroscopie en gedragsneurowetenschappen.
- Is afhankelijk van gespecialiseerde instrumentatie, waaronder waterimmersie-lenzen, instelbare lasers en fluorescentiedetectiesystemen.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor chirurgische procedures, beeldvormingsprotocollen en de uitvoering van gedragsparadigma's.
- Houdt rekening met aanpassingen bij het toepassen van de methode op verschillende corticale regio's of fluorescente reporterlijnen.
- Wordt beperkt door de helderheid van het schedelvenster, beperkingen in de beeldvormingsdiepte en de helderheid van de reporter, zoals vermeld in het bronmateriaal.
