Isoleren En Immunokleuring Lymfocyten en dendritische cellen uit Patches Murine Peyer

Het algemene doel van deze procedure is om lymfocyten en dendritische cellen te isoleren en immunokleuring uit te voeren van neuron payers patches, met behulp van twee parallelle experimentele benaderingen. Eerst snijdt u verse payers patches uit de dunne darm van de muis. Vervolgens dissocieert u fysiek de payer's patches, verzamelt het weefsel en voert het door een gaasfilter om een enkele celsuspensie te genereren voor flow cytometry analyse.

Verzamel de cellen door centrifugatie en verdeel aliquoten in een 96-well ronde bodemplaat. Label vervolgens de cellen met antilichamen tegen specifieke celoppervlaktemarkers. Ga onmiddellijk door met flow cytometrische analyse om de specifieke celtypen te tellen. Gelijktijdig isoleert u payer's patches en bevriest u weefselmonsters snel.

In OCT blokken, cryosectie, label de monsters met antilichamen tegen specifieke celoppervlaktemarkers en visualiseer vervolgens door confocale scanlasermicroscopie. Deze methoden zullen B-cellen, T-cellen en dendritische cellen kwantificeren in specifieke compartimenten binnen de payer's patch weefsels. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat PI's patchweefsels extreem kwetsbaar zijn en gemakkelijk kunnen worden beschadigd.

Tijdens het hanteren. Leg de vers geïsoleerde dunne darm op een laag vochtige papierhanddoeken of Kim wipes. Bevochtig vervolgens de dunne darm voorzichtig met zoutoplossing om uitdroging van het weefsel te voorkomen.

Nu, identificeer visueel individuele payers patches op de anti-mesenterische zijde van de darm. Typisch heeft een enkele muis vijf tot 10 zichtbare payers patches die gelijkmatig verdeeld zijn van de dunne darm tot ileum. Gebruik gekromde chirurgische schaar om de individuele payer's patches doorgaans te verwijderen.

Plaats ze in koude hank's balanssorteeroplossing, waarbij het weefsel op vier graden Celsius wordt gehouden om de celviabiliteit te behouden. Breng vervolgens de payer's patches over in vijf milliliters miltdissociatiemedium en schud gedurende 15 tot 20 minuten bij 37 graden Celsius op 250 RPM. Om een enkele celsuspensie te genereren, plaatst u het monster op een steriele 70 micron nylon gaascelfilter en vermaalt u het weefsel er met geweld in met de basis van een zuiger uit een enkele cc spuit om resterende cellulaire aggregaten te verwijderen.

Decanteer de celsuspensie door een tweede 70 micron celfilter en verzamel de cellen in een 15 of 50 milliliter conische buis. Doe 10 tot vijf cellen per putje in een 96-well ronde bodemplaat, bezink de cellen door centrifugatie gedurende vijf minuten bij 1000 keer G. Decanteer vervolgens het supernatant door de plaat voorzichtig om te draaien.

Resuspendeer nu de cellen in FC-blokkeringsbuffer en incubeer op ijs gedurende 15 minuten. Voeg vervolgens Fluor-geconjugeerde antilichamen toe aan de celsuspensies in de gewenste verdunning en incubeer op ijs. Was de cellen met 100 microliter flowbuffer. Resuspendeer vervolgens de cellen in 400 microliter fixatiebuffer om de cellen te analyseren door flow cytometry om payers patches te isoleren voor cryosectie.

Snijd 0,5 centimeter transversale segmenten van de dunne darm die een enkele payer's patch bevatten. Breng het weefsel over in een petrischaal met PBS. Plaats vervolgens de darmweefselssegmenten verticaal in basisvormen die OCT bevatten.

Dompel de vormen in vloeibare stikstof en laat het weefsel volledig bevriezen. Verwijder de bevroren basisvormen uit de vloeibare stikstof met behulp van een pincet. Laat de mal opwarmen tot kamertemperatuur, net lang genoeg om de randen van de OCT-blok te verzachten.

Verwijder vervolgens het bevroren OCT-blok uit de mal. Draai de mal om en druk voorzichtig op de achterkant om het blok op een schone vier bij vier centimeter stuk aluminiumfolie te laten vallen. Wikkel het weefsel onmiddellijk in de folie en plaats het in een gelabelde monstersteek geplaatst in vloeibare stikstof of op droogijs. Cryosecteer het weefsel met behulp van een LI a CM 3 0 5 0 s cryo microtoom of equivalent.

Stel de kamertemperatuur op de cryostaat in op min 21 graden Celsius. Snijd idealiter secties van 12 tot 14 microns dikte. Verzamel de secties op Supercross plus glazen microscoopglazen.

Inspecteer de monsters visueel met behulp van een standaard laagvermogen lichtmicroscoop. Dompel de glazen in aceton gedurende twee minuten. Houd er rekening mee dat langdurige incubatie kan leiden tot loslating van weefsels van het glas.

Was de monsters drie keer met PBST. Cirkel de secties met een beeldhydrofobe pen. Incubeer de monsters vervolgens in blokbuffer, leg de weefselsecties over met primaire antilichaamoplossing.

Droog het gebied rond de secties met behulp van Kim wipes of ander absorberend weefsel zonder de eigenlijke weefselsecties aan te raken. Plaats met behulp van een pipette of druppelaar voorzichtig een druppel verlengd goud montagemedium rechtstreeks op de sectie. Breng een glazen deksel aan, vermijd luchtbellen en dep eventueel overtollig montagemiddel weg.

Medium fax analyse van monodisperze suspensies van totale payers patch cellen onthult een duidelijk onderscheid tussen goede en slechte celpreparaties in goede celpreparaties. Met meer dan 80% levensvatbaarheid, toont de overgrote meerderheid van de cellen een hoge voorwaartse verstrooiing aan die een hoog celvolume aangeeft en een lage zijwaartse verstrooiing consistent met lage celgranulariteit. In dit experiment werd opzettelijk een slechte celpreparatie bereid om aan te tonen dat in een slechte populatie de meerderheid van de cellen lage FSC, hoge SSC en buiten de aangegeven gait R één vertonen.

Deze cellen ondergaan waarschijnlijk apoptose en/of necrose. Hierbij wordt een cocktail van maximaal vier verschillende Fluor. Vier geconjugeerde monoklonale antilichamen gebruikt om onderscheid te maken tussen verschillende celtypen.

In payers patch werden eencellissuspensies gebruikt met labelen met een cluster van differentiatiemarkers. CD 19 en B twee 20 laten zien dat B-cellen ongeveer 60% van de gepoorde payers vormen. Specifieke T-celsubsets kunnen gemakkelijk worden geenumereerd door dubbel labelen met antilichamen te