Name: Evaluatie van polymere Gene Delivery Nanodeeltjes door Nanodeeltje Tracking Analyse en High-throughput Flow cytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Leer genoverdracht met niet-virale polymere nanodeeltjes te evalueren via nanodeeltje-trackinganalyse en high-throughput flowcytometrie. Deze methode karakteriseert deeltjesgrootte en transfectie-efficiëntie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs danken de TEDCO MSCRF (2009-MSCRFE-0098-00) en NIH R21CA152473 voor ondersteuning.

1. Cel Zaaien <ol><li> Sta niet toe dat cellen om te groeien naar overconfluency. Gebruik vroege passage cellen als transfecteren primaire cellen. </li><li> Vierentwintig uur voor transfectie, trypsinize de cellen telt de cellen met een hemocytometer en verdunnen celsuspensie met media op de gewenste celdichtheid (cellen / volume) te bereiken. Zaad cellen in weefselkweek heldere behandelde vlakke bodem 96-well platen met een reservoir en multichannel pipetten. De gekozen dichtheid moet geven 70-80% confluentie op de dag van transfectie. Bijvoorbeeld, zoals weergegeven in Tabel 1, werden de cellen verdund 25 tot 50 cellen / ul voor de transfectie data hier. </li></ol> 2. Celtransfectie <ol><li> Verdunning van polymeer en DNA voorraden. Ontdooien polymeer en DNA stock oplossingen bij kamertemperatuur (RT). Verdun polymeer stock oplossing en DNA stock oplossing afzonderlijk in heldere 96-well platen met twaalf kanaalspipetMet het geschikte oplosmiddel concentraties om de gewenste polymeergewicht verkrijgen DNA gewichtsverhoudingen (gew / gew). In dit geval is de gekozen oplosmiddel 25 mM natriumacetaat buffer (pH = 5,2). <ol><li> DNA verdunning. Typisch wordt DNA opgeslagen bij 1 mg / ml verdund in natriumacetaat buffer tot een concentratie van 0,03 tot 0,06 mg / ml in een duidelijke niet-weefselkweek behandelde plaat met 96 putjes (een goed voor een formulering). Tabel 2 toont de typische DNA verdunning protocol voor een formulering van vier duplo-putjes transfecteren in een plaat met 96 putjes geënt met cellen uit stap 1. </li><li> Polymer verdunning. De 100 mg / ml polymeer / DMSO oplossing verdund in natriumacetaatbuffer afhankelijk van de concentratie vereist om het gewenste polymeer te verkrijgen DNA wt / wt verhouding. Het bereik van wt / wt verhouding typisch gebruikt voor genafgifte met poly (beta-amino ester) s (PBAEs) is 20 tot 100. PBAE polymeren worden eerst verdund tot 10 mg / ml, gevolgd door verdunning pROTOCOL zoals getoond in Tabel 3. Het polymeer verdunningen worden uitgevoerd in een duidelijke niet-weefselkweek behandelde plaat met 96 putjes die het monster oriëntatie van de DNA verdunning gegevensplaatje. </li></ol></li><li> Nanodeeltjes de vorming. Voeg PBAE oplossing een gelijk volume van het plasmide DNA oplossing met een twaalf kanaalspipet en meng grondig. Laat het mengsel geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 10 min om zelfassemblage maken. </li><li> Nanodeeltjes transfectie. Na zelf-assemblage worden 20 ul per putje nanodeeltjes toegevoegd aan het kweekmedium druppelsgewijs met de twaalf-kanaal pipet. Herhalingsputjes onbehandeld of getransfecteerd met commercieel verkrijgbare reagentia als controles. De getransfecteerde cellen worden geïncubeerd bij 37 ° C gedurende twee tot vier uur en de putjes worden vervangen door vers medium (100 ul / putje). De keuze van de incubatietijd afhankelijk van de cellijn, kweekomstandigheden en transfectiesysteem. Het verschil in transfectieefficiency en celtoxiciteit als gevolg van verschillende incubatieperiode worden gekwantificeerd door de analyse protocol beschreven in stap 3. </li></ol> 3. Analyse van transfectie-efficiëntie en toxiciteit Cell Transfectie-efficiëntie wordt visueel onderzocht met een fluorescentiemicroscoop en gekwantificeerd met een flow cytometer achtenveertig uur na transfectie. Celtoxiciteit wordt visueel onderzocht met een fluorescentiemicroscoop en gekwantificeerd met behulp van de CellTiter 96 Aqueous One assay vierentwintig uur na transfectie. <ol><li> Fluorescentiemicroscopie. Visueel analyseren de putjes voor de expressie van de getransfecteerde reportergen (bijvoorbeeld EGFP of DsRed) met de juiste fluorescentiekanaal. Verwerven beelden voor elke wel, kiezen gezichtsveld dat geschikt vertegenwoordigen de transfectie-efficiëntie voor het betreffende formuleringen (figuur 1). Maak een notitie van een van de cellen toxiciteit visueel waargenomen. </li><li> Flowcytometrie. <ol><li> Gebruik meerkanaalspipetten de 96-well plaat bereiden voor flowcytometrie. Wassen met PBS, trypsinize met 30 ul / putje van trypsine / EDTA, neutraliseren met 170 pi FACS buffer (PBS + 2% FBS), pipet op en neer in elk putje, waaronder ongeveer randen en het volledige door 200 ui volume van elk putje in overeenkomstige putjes met ronde bodem of V-bodem 96-well plaat. </li><li> Centrifugeer de plaat bij 130 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Verwijder 170 pi medium van elk putje en pipet te mengen cellen met vermijding bellen. Het gebruik van een levensvatbaarheid vlek zoals propidiumjodide (PI), voeg 10 ul FACS buffer + PI (50:1 FACS buffer: PI verdunning; PI stock concentratie 1 mg / ml) in elk putje. Plaats onmiddellijk op ijs en dek tegen licht. </li><li> Start de C6 Accuri flowcytometer, de HyperCyt 96-well gehechtheid, en de HyperView software. Gebruik HyperView Ontwerp en Protocol tabbladen om de juiste p kiezenlaat type, plaat lay-out en andere instellingen, zoals trillen / sip / spoelen / schudden tijd. Om bovenstaande protocol werden de volgende parameters gebruikt, een pre-plate prime een minuut, en een pre-plate schudden gedurende 30 seconden bij 2400 rpm. Sip tijd werd gedurende 15 sec bij 15 tpm, een sonde goed spoelen om de 2 sec, en een inter-en om de 12 putten voor 12 sec schudden bij 2.400 tpm. De inter-schud is belangrijk om de cellen verspreid in de media en een betere mogelijkheid om de gegevens te verwerken zoals geregistreerd door pauzes tussen groepen wells (in dit geval 12 sec). </li><li> Gebruik HyperView Well Identification tab om de gegevens en gescheiden in de juiste put (figuur 2) te verwerken. Om de individuele putjes identificeren, kan het helpen om de software ruisfilter, alsmede met een basisstation nog filter onder de geavanceerde instellingen. </li><li> Kwantificeer percentage van positief getransfecteerde levende cellen van passende gating aan verschillende pop scheidenvraagd (figuur 3). Eerst bekijken de stroom van gegevens op een FSC vs SSC spreidingsdiagram om afzonderlijke cellen van vuil (Figuur 3A). Als propidium jodide (PI) werd gebruikt, de individuele gate celpopulatie en mening dat gegevens op een FSC vs FL3 plot om levende cellen te scheiden van dode cellen en de gate levende cellen. Om het aantal getransfecteerde cellen kwantificeren de live celpopulatie op de geëigende kanalen bijvoorbeeld GFP zichtbaar in FL1. Met de onbehandelde populatie, de onbehandelde cellen gate om het achtergrondsignaal (Figuur 3B) identificeren. De positief getransfecteerde cellen worden geïsoleerd met behulp van deze poort en door het bekijken van de getransfecteerde populaties met zowel scatter en contourlijncurves (figuur 3C en 3D). Er kan een continuüm van positief getransfecteerde cellen, zoals verschillende cellen worden getransfecteerd met verschillende graden van fluorescentie. </li></ol></li><html><li> CellTiter 96 Aqueous One assay <ol><li> Transfecteren andere plaat op dezelfde wijze voor celtoxiciteit metingen. </li><li> Premix 1 ml van de CellTiter 96 Een waterige testoplossing met 10 ml vers medium. Verwijder het afdrukmateriaal uit cellen en het gebruik van een meerkanaalspipet tot 110 ul van de voorgemengde oplossing + media per well toe te voegen. </li><li> Meet de absorptie bij 490 nm elk uur interval 1-4 uur totdat de absorptie uit de put met onbehandelde toestand in het lineaire gebied van de assay. Bestaan ​​uit vier controleputjes met enige oplossing + media voor een achtergrond absorptie lezen. </li><li> Gemiddelde van de absorptiewaarden van de vier duplo-putjes per staat en aftrekken van de gemiddelde absorptie van elke achtergrond gemiddelde. Normaliseren gecorrigeerde gemiddelde voor elke behandelde aandoening de gecorrigeerde gemiddelde van de onbehandelde toestand om het percentage cellevensvatbaarheid te bepalen. </li></ol></li></ol>_title &quot;&gt; 4. Nanodeeltje Sizing met NTA en Plasmide per deeltje Berekeningen <ol><li> Prime het fluidics systeem van de NanoSight NS500 door het uitvoeren van het verdunningsmiddel pomp naar voren op ongeveer 1/5de van de max. snelheid en het monster pomp naar achteren op ongeveer 1/10e van de max. snelheid. Ga door tot het fluidics systeem wordt gespoeld met verdunningsmiddel. </li><li> Bereid de nanodeeltjes te analyseren. Bij PBAEs afzonderlijk verdunnen stock plasmide DNA (1 mg / ml) en stock PBAE (100 mg / ml) in natrium acetaat buffer (25 mM, pH 5) in Eppendorf buisjes. </li><li> Verdun het plasmide DNA concentratie tot 0,06 mg / ml. Polymeerconcentratie kan variëren afhankelijk van het gewenste gewicht gewicht verhouding van polymeer tot DNA (bijvoorbeeld voor 60 gew / gew deeltjes wordt polymeer verdund tot 3,6 mg / ml). </li><li> Voeg de polymeeroplossing een gelijk volume van het plasmide DNA oplossing toe en meng grondig. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 10 min om zelfassemblage maken. </li><li> Dilute de nanodeeltjes oplossing 100-voudig in PBS zodat de nanodeeltjes concentratie in het juiste bereik voor NTA en tot een uiteindelijk volume van ten minste 500 pi verkrijgen. </li><li> Plaats het monster in de NanoSight Door de laadbuis in de sample Eppendorf buis (Figuur 4A). Zorg ervoor dat er geen luchtbellen te introduceren. </li><li> In de opnamemodus, verhoogt u de camera-niveau totdat de deeltjes kan worden gezien. Scherpstellen zodat de deeltjes glad uitzien (figuur 4A en 4B). </li><li> Terwijl in de standaard modus, past de camera-niveau voorbij het punt dat alle deeltjes te zien op het scherm. Verlaag de camera niveau het laagste niveau dat de deeltjes allemaal nog worden waargenomen. Als een intermediair camera niveau nodig is, gaat u naar de geavanceerde modus en wijzig de sluiter van de camera en krijgen om de juiste niveaus. </li><li> Visueel controleren om ervoor te zorgen dat er tussen 20 - 100 deeltjes op de screen. Een ideale aantal voor de nanodeeltjes tracking is ongeveer 50 deeltjes. Als er te veel of te weinig, spoel de NS500, pas dan de verdunning in PBS, en opnieuw laden van het monster. </li><li> Stel de opname duur volgens de standaard modus tafel. Meestal 30 - 60 sec een geschikte capture lengte (Figuur 4B). </li><li> Om de volgende sample te laden, spoel het systeem, vervolgens opnieuw laden van de nieuwe monster. </li><li> Zodra video&#39;s worden vastgelegd, ga dan naar de verwerkende fase door het openen van een videobestand. </li><li> Er zijn een aantal parameters die kunnen worden afgestemd om optimaal verwerken video (Figuur 4C). Het doel is om parameters te selecteren die het best elk deeltje op het scherm, zoals aangegeven door een rood kruis op het scherm van elk deeltje (figuur 5) vast te leggen. </li><li> Verhoog het scherm krijgen om beter te zien de deeltjes. Onder de standaard of geavanceerde modus, selecteert u de auto voor de parameters aan te passen door ClickIng de daarvoor bestemde vakken. In het geval dat de automatische instellingen niet voldoende deeltjes te selecteren, unclick de doos en handmatig instellen van de parameters (Figuur 4C). </li><li> Zodra alle deeltjes worden geplukt op het scherm, klikt u op de knop proces van de software om het videobestand (Figuur 4C) te verwerken. Dit geeft de deeltjesgrootteverdeling, maat gemiddelden, en deeltjesconcentratie. </li><li> Om te zorgen dat de deeltjes concentratie nauwkeurig is, wijzigt u de PBS verdunning, zoals door het verhogen van verdunning door 2x, en herhaal de bovenstaande procedure. Meten meerdere verdunningen van hetzelfde monster wordt aanbevolen dat de meting van de concentratie van het monster nauwkeurig is. Een goed aanbod voor de meting is 10 7 -10 9 deeltjes / ml. </li><li> Controleer of alle plasmiden worden opgenomen in nanodeeltjes door het uitvoeren van gelelektroforese van de nanodeeltjes en het beoordelen of een vrije DNA aanwezig is.Indien niet alle plasmiden zijn ingekapseld, gebruik maken van standaard technieken om DNA-absorptie te meten om de totale ingekapselde plasmiden kwantificeren. </li><li> Het gemiddelde aantal plasmiden per deeltje berekenen, deelt het totale ingekapselde plasmideconcentratie de NTA gemeten deeltjesconcentratie. Om de plasmide per deeltje monsterverdeling schatten dmv de NTA deeltjesgrootte histogram de volumefractie van elk 1 nm bin deeltje berekenen. Vermenigvuldigen volumefractie verdeling van de totale hoeveelheid plasmide het aantal plasmiden te verkrijgen in elke bin. Verdeel deze nummers het aantal deeltjes in elke bin het aantal plasmiden per deeltje te verkrijgen voor elke deeltjesgrootte (Figuur 6). </li></ol>

<ol><li>Putnam, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymers+for+gene+delivery+across+length+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Polymers for gene delivery across length scales.</a> Nature Materials. 5, 439-451 (2006).</li>
<li>Sheyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+cells+in+regenerative+medicine+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).</li>
<li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo%3A+polyethylenimine%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).</li>
<li>Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rita+Schaffer+Lecture%3A+Nanoparticles+for+Intracellular+Nucleic+Acid+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery.</a> Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).</li>
<li>Lynn, D. M., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradable+poly%28beta-amino+esters%29%3A+Synthesis%2C+characterization%2C+and+self-assembly+with+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA.</a> J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).</li>
<li>Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+transfection+with+polymeric+nanoparticles+are+dependent+on+polymer+end-group+structure%2C+but+largely+independent+of+nanoparticle+physical+and+chemical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties.</a> Mol. Pharm. , (2012).</li>
<li>Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+nanoparticles+specific+for+human+microvasculature+and+macrovasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology%2C+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).</li>
<li>Bhise, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+terminal+functionalization+and+molecular+weight+of+a+gene+delivery+polymer+and+transfection+efficacy+in+mammary+epithelial+2-D+cultures+and+3-D+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures.</a> Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).</li>
<li>Tzeng, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+gene+delivery+nanoparticles+based+on+poly%28beta-amino+esters%29+for+treatment+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma.</a> Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).</li>
<li>Sunshine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-Molecule+End-Groups+of+Linear+Polymer+Determine+Cell-Type+Gene-Delivery+Efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy.</a> Adv. Mater. 21, 4947(2009).</li>
<li>Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+quantifying+the+number+of+plasmids+encapsulated+by+polymer+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles.</a> Small. 8, 367-373 (2012).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li>
<li>Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+intracellular+stability+and+unpacking+of+DNA+nanocomplexes+by+quantum+dots-FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%3A+Official+journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET.</a> Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).</li>
<li>Kreiss, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid+DNA+size+does+not+affect+the+physicochemical+properties+of+lipoplexes+but+modulates+gene+transfer+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency.</a> Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).</li>
<li>Pitard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-sized+self-assembling+lamellar+complexes+between+plasmid+DNA+and+cationic+micelles+promote+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).</li>
<li>Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+solution+of+%28Lys%29%2816%29-containing+bifunctional+synthetic+peptide%2FDNA+nanoparticles+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).</li>
<li>Green, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+polymeric+vectors+for+gene+delivery+to+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells.</a> Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).</li>
</ol>

De auteurs melden geen belangenconflicten.

De protocollen hierboven beschreven methoden voor de transfectie efficiëntie van nanodeeltjes formuleringen, alsmede een manier om de deeltjesgrootte en DNA laden van de nanodeeltjes te karakteriseren. Het aantal plasmiden per deeltje is een belangrijke parameter die kan helpen bij het voorspellen van de effectiviteit van het deeltje en kan ook worden gebruikt voor dosisbepaling. Nanodeeltjes tracking analyse kan worden uitgevoerd in een aantal verschillende waterige oplossingen, zoals verschillen in zoutconcentratie. V...

De bepaling van het aantal plasmiden gecomplexeerd per nanodeeltjes belangrijk te ontwerpen effectieve nanodeeltjes gebaseerde gentherapie strategieën, vooral voor co-levering van meerdere plasmiden in dezelfde cel doel, zoals vaak vereist in stamcellen herprogrammering studies 12. Verschillende manieren om het aantal plasmiden geassocieerd met een nanodeeltje bepalen zijn beschreven, en elke benadering heeft nadelen in de technieken voor schatting 13-16. Quantum dot (QD) labeling gecombineerd met TEM wordt gebruikt om plasmiden per deeltje schatten chitosan gebaseerde nanopartikels. Deze schatting QD techniek gecompliceerd door de noodzaak om de DNA dat daarvan kunnen veranderen zelfassemblage labelen, de mogelijkheid dat ingekapselde ongelabelde DNA niet direct gedetecteerd; mogelijke overlap plasmiden en QDs in de 2D TEM beelden van deeltjes en andere vereenvoudigende veronderstellingen 13. Een alternatieve benadering is dat eenpplicable besteld microdomeinen aanwezig in de deeltjes is gebruikt om Lipopolyamine-DNA complexen via cryo-transmissie-elektronenmicroscopie (cryo-TEM), X-ray scattering en dynamische lichtverstrooiing (DLS) 14,15 bestuderen. Helaas materialen zoals de polymere nanodeeltjes hier onderzochte niet van toepassing bij deze methode. . In een andere studie, Collins et al gebruikt een stroom deeltjes beeldanalysetechniek bestuderen (Lys) 16 bevattend peptide / DNA complexen, maar de methode kan alleen beoordelen grotere micron-deeltjes 16. Zo hebben we onlangs een nieuwe en flexibele bepaling van het aantal plasmiden nanodeeltjes 11 kwantificeren.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> Fosfaat gebufferde zoutoplossing, 1x (PBS) </td><td> Invitrogen </td><td> 10010 </td><td></td></tr><tr><td> EGM-2mV BulletKit </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> Invitrogen </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumacetaatbuffer </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7899 </td><td> Verdun tot 25 mM in gedeïoniseerd water </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 276855 </td><td></td></tr><tr><td> pEGFP DNA </td><td> Elim Biopharmaceuticals </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> DsRed DNA </td><td> Addgene </td><td> 21718 </td><td></td></tr><tr><td> PEI, vertakte </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 408727 </td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td> CellTiter 96 Waterige Een </td><td> Promega </td><td> G3580 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Materieel </td></tr><tr><td> Duidelijke platte bodem 96-well plaat, steriele </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1581.001 </td><td></td></tr><tr><td> Foutloos bodem 96-well plaat, steriele </td><td> Sarstedt </td><td> 82.1582.001 </td><td></td></tr><tr><td> 12-kanaals Finnpipette </td><td> Thermo Scientific </td><td> NA </td><td> 5 tot 50 en 50 tot 300 ul </td></tr><tr><td> Fluorescentiemicroscoop </td><td> Zeiss </td><td> NA </td><td> Model nummer: AX10 </td></tr><tr><td> C6 Accuri flowcytometer </td><td> BD Biosciences </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> HyperCyt bevestiging </td><td> Intellicyt </td><td> NA </td><td></td></tr><tr><td> NS500</td><td> NanoSight </td><td> NA </td><td></td></tr></tbody></table>

evaluatie van polymere gene delivery nanodeeltjes door nanodeeltje tracking analyse en high-throughput flow cytometrie

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Niet-virale gen-levering met gebruik van polymere nanodeeltjes heeft zich ontpopt als een aantrekkelijke aanpak voor gentherapie voor de behandeling van genetische ziekten 1 en als een technologie voor regeneratieve geneeskunde 2. In tegenstelling tot virussen die aanzienlijke veiligheidsproblemen hebben, kunnen polymère nanodeeltjes worden ontworpen als zijnde niet-toxisch, niet-immunogeen, niet-mutageen, gemakkelijker te synthetiseren, chemisch veelzijdig, die in staat groter nucleïnezuur lading en biologisch afbreekbare en / of ecologisch reageren. Kationische polymeren zelf-assembleren met negatief geladen DNA via elektrostatische interactie complexen in de orde van 100 nm die vaak worden genoemd polymère nanodeeltjes vormen. Voorbeelden van biomaterialen gebruikt nanoschaal polykationische genafgifte nanodeeltjes vormen omvatten polylysine, polyphosphoesters, poly (amidoamines) s en polyethyleenimine (PEI), een niet-afbreekbare off-the-shelf kationische polymeer gebruikt voor nucleïnezuurafleverende 1,3. Poly (beta-aminoester) s (PBAEs) zijn een nieuwe klasse van kationische polymeren die hydrolytisch 4 afbreekbaar 5,6 en zijn effectief gebleken bij genoverdracht naar moeilijk te transfecteren celtypes zoals humane endotheelcellen retinale (HRECs) 7, muizen mammaire epitheelcellen 8, menselijk hersenkankercellen 9 en macrovasculaire (humane navelstreng, HUVECs) endotheelcellen 10. Een nieuw protocol bij polymere nanodeeltjes gebruik te maken van nanodeeltjes tracking analyse (NTA) te karakteriseren wordt beschreven. In deze benadering worden zowel de deeltjesgrootteverdeling en de verdeling van het aantal plasmiden per deeltje verkregen 11. Daarnaast wordt een high-throughput 96-well plaat transfectie assay voor snelle screening van de transfectie efficiëntie van polymeer nanodeeltjes gepresenteerd. In dit protocol, poly (beta-amino ester) s (PBAEs) worden gebruikt als model polymeren en menselijke retinale endotheelcellen (HRECs) worden gebruikt als model menselijke cellen. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan elk polymeer nanodeeltjes en elk celtype plaats in een multi-well plaat formaat evalueren.

Figuur 1 een fluorescentiemicroscopie beeld van een voorbeeld van een succesvolle transfectie van HRECs de EGFP plasmide. De helder veldbeeld is nuttig om te waarborgen dat cellen hun normale morfologie te behouden. Bovendien kan cellevensvatbaarheidsassays, zoals MTS of vergelijkbare testen worden gebruikt om de toxiciteit nanodeeltjes 7 beoordelen. Flowcytometrie, zoals beschreven, kan worden gebruikt om de transfectie-efficiëntie te kwantificeren. Bij gebruik van de HyperCyt multi-well pla...

Een protocol voor de nanodeeltjes tracking analyse (NTA) en high-throughput flowcytometrie om polymere genafgifte nanodeeltjes evalueren beschreven. NTA wordt gebruikt om de nanodeeltjes deeltjesgrootteverdeling en het plasmide per deeltjesverdeling karakteriseren. High-throughput flowcytometrie in staat stelt kwantitatieve transfectie efficiëntie evaluatie voor een bibliotheek van gen delivery biomaterialen.

Evaluatie van polymere Gene Delivery Nanodeeltjes door Nanodeeltje Tracking Analyse en High-throughput Flow cytometrie

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren en evalueren van genoverdrachtsexperimenten met behulp van niet-virale polymere nanodeeltjes. Dit wordt bereikt door cellen eerst te transfecteren met genoverdrachtspartikels. De transfectie-efficiëntie wordt vervolgens geëvalueerd middels microscopie en high-throughput flowcytometrie-analyse.Vervolgens worden de grootteverdeling van de nanodeeltjes, de concentratie en het aantal plasmiden per deeltje bepaald met een instrument voor nanodeeltjes-trackinganalyse. Uiteindelijk maakt deze methode de karakterisering van de grootte van de nanodeeltjes en de transfectie-efficiëntie met gebruik van nanodeeltjes mogelijk. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van biologisch afbreekbare polymere nanodeeltjes voor genoverdracht is dat ze veiliger en effectiever kunnen zijn dan andere methoden voor gentransfer.Het primaire voordeel van nanoparticle tracking analysis ten opzichte van bestaande methoden zoals dynamic light scattering is dat nanoparticle tracking analysis direct de getalsgemiddelde verdeling en de partikelconcentratie geeft. Deze methode helpt bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van non-virale gentherapie, zo

evaluation-polymeric-gene-delivery-nanoparticles-nanoparticle

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Dit artikel beschrijft een methode om nanoprecipitation op basis van polymeren nanodeeltjes door middel van diblok co-polymeren te synthetiseren. Bespreken we de synthese van diblok co-polymeren, de nanoprecipitation techniek en mogelijke toepassingen.

Formulering van diblok polymere nanodeeltjes door middel van Nanoprecipitation Techniek

Type B gelatine-based ontworpen nanovectors systeem (Gens) is ontwikkeld voor systemische genafgifte en transfectie in de behandeling van alvleesklierkanker. Door modificatie met epidermale groeifactor receptor (EGFR) specifieke peptide op het oppervlak van nanparticles, kunnen ze gericht zijn op de EGFR-receptor en laat plasmide onder reducerende omgeving, zoals een hoge intracellulaire glutathion-concentraties.

Gene Levering en Transfectie in Human alvleesklierkankercellen met epidermale groeifactor receptor-gerichte Gelatine-Based Engineered Nanovectors

In dit artikel beschrijven we een methode gebruik te maken van multi-spectraal imaging flowcytometrie om de internalisering van polyanhydride nanodeeltjes of bacteriën door RAW 264.7 cellen te kwantificeren.

Het analyseren van cellulaire internalisatie van nanodeeltjes en bacteriën door Multi-spectrale Imaging flowcytometrie

Plant virale nanodeeltjes (VNPs) zijn veelbelovend platform voor toepassingen in de medische biologie. Hier beschrijven we de procedures voor plantaardige VNP vermeerdering, zuivering, karakterisering, en bioconjugatie. Ten slotte tonen we de toepassing van VNPs voor tumor homing en beeldvorming met behulp van een muis xenograft model en fluorescentie beeldvorming.

Virale nanopartikels voor<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

Analyse van nanodeeltjes interactie met gedefinieerde subpopulaties van immune cellen door flowcytometrie.

Detectie van TL Nanoparticle Interacties met Primary Immune celtypes door flowcytometrie

We beschrijven beeldvorming van het hele dier en op flowcytometrie gebaseerde technieken voor het bewaken van de uitbreiding van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen als reactie op immunisatie met nanodeeltjes in een muizenmodel voor vaccinatie.

Whole-dierlijke Imaging en Flowcytometrische technieken voor analyse van antigeen-specifieke CD8 + T cel reacties na Nanoparticle Vaccinatie

Dit manuscript beschrijft een nieuwe techniek die de detectie van intracellulaire genexpressie mogelijk maakt na endocytose van fluorescentie-gelabelde nanodeeltjes direct in levende cellen. De methode vereist geen manipulatie van de cellen en is niet beperkt met betrekking tot het doelgen of de soort.

Detectie van intracellulaire genexpressie in levende cellen van muizen, de mens en Porcine Origin Met behulp van fluorescentie-gelabelde Nanodeeltjes

Het slechte begrip van de in vivo prestaties van nanomedicijnen belemmert hun klinische translatie. Procedures om het in vivo gedrag van kanker nanomedicijnen op systemisch, weefsel-, enkelcellig en subcellulair niveau te evalueren bij tumordragende immuuncompetente muizen worden hier beschreven. Deze aanpak kan onderzoekers helpen om veelbelovende kanker nanomedicijnen te identificeren voor klinische translatie.

A Comprehensive Procedure voor het evalueren<em&gt; In Vivo</em&gt; Prestaties of Cancer Nanomedicines

In dit protocol beschrijven we de complete workflow voor snelle isolatie van extracellulaire blaasjes uit menselijk bloed en karakterisering van specifieke markers door fluorescentie-gebaseerde analyse van het nanoparticle-tracking. De gepresenteerde resultaten geven een hoge graad van reproduceerbaarheid en kunnen worden aangepast aan de cel cultuur supernatant.

Snelle fluorescentie gebaseerde karakterisering van één extracellulaire blaasjes in menselijk bloed met Nanoparticle-tracking analyse

Hier wordt een eenvoudig protocol gepresenteerd voor het produceren van mRNA-nanodeeltjes op basis van poly (bèta-aminoester) polymeren, eenvoudig op maat te maken door het ingekapselde mRNA te veranderen. De workflow voor het synthetiseren van de polymeren, de nanodeeltjes en hun in vitro essentiële karakterisering worden ook beschreven. Een proof-of-concept met betrekking tot immunisatie wordt ook toegevoegd.

Synthese en karakterisering van mRNA-geladen poly (bèta-aminoesters) nanodeeltjes voor vaccinatiedoeleinden

Dit protocol presenteert Rayleigh-opsplitsing als een mild proces voor het aerosoliseren van niet-virale mRNA-vectoren. Regionale afzetting voor aerosoliseerde mRNA-vectoren wordt geëvalueerd met het Alberta Idealized Nasal Inlet (AINI) model. Groene fluorescentieproteïne (GFP)-expressie in menselijke longcellen vertegenwoordigt het behoud van fysisch-chemische en biologische functies van post-aerosoliseerde mRNA-vectoren.

Intranasale afgifte van mRNA-polyplexen via Rayleigh-opbraakaerosolen: een in vitro methode voor neusafzetting en functioneel testen

Leer genoverdracht met niet-virale polymere nanodeeltjes te evalueren via nanodeeltje-trackinganalyse en high-throughput flowcytometrie. Deze methode karakteriseert deeltjesgrootte en transfectie-efficiëntie.

Evaluatie van polymere Gene Delivery Nanodeeltjes door Nanodeeltje Tracking Analyse en High-throughput Flow cytometrie

Meer video's verkennen