Evaluatie van polymere Gene Delivery Nanodeeltjes door Nanodeeltje Tracking Analyse en High-throughput Flow cytometrie

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren en evalueren van genoverdrachtsexperimenten met behulp van niet-virale polymere nanodeeltjes. Dit wordt bereikt door cellen eerst te transfecteren met genoverdrachtspartikels. De transfectie-efficiëntie wordt vervolgens geëvalueerd middels microscopie en high-throughput flowcytometrie-analyse.

Vervolgens worden de grootteverdeling van de nanodeeltjes, de concentratie en het aantal plasmiden per deeltje bepaald met een instrument voor nanodeeltjes-trackinganalyse. Uiteindelijk maakt deze methode de karakterisering van de grootte van de nanodeeltjes en de transfectie-efficiëntie met gebruik van nanodeeltjes mogelijk. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van biologisch afbreekbare polymere nanodeeltjes voor genoverdracht is dat ze veiliger en effectiever kunnen zijn dan andere methoden voor gentransfer.

Het primaire voordeel van nanoparticle tracking analysis ten opzichte van bestaande methoden zoals dynamic light scattering is dat nanoparticle tracking analysis direct de getalsgemiddelde verdeling en de partikelconcentratie geeft. Deze methode helpt bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van non-virale gentherapie, zoals het aantal plasmiden per partikel, wat belangrijk is voor co-expressiestudies. Het volgende protocol wordt gedemonstreerd met behulp van menselijke retinale endotheelcellen of hre als modelcellen en poly bèta-aminoesters of PBA AEs als modelpolymeren.

Let op dat de kweekcondities en oplosmiddelen mogelijk moeten worden aangepast, afhankelijk van de gebruikte cellen en polymeren, 24 uur vóór de transfectie. Gebruik een meerkanaals pipette om de cellen uit te zaaien in doorzichtige, voor weefselkweek behandelde vlakke bodem 96-wells platen bij een concentratie van 25 tot 50 cellen per µL.

Dit zal resulteren in een confluentie van 70 tot 80% op de dag van transfectie. Bereid en label heldere 96-wells platen die niet behandeld zijn voor weefselkweek, om te dienen als masterplaten voor het bereiden en verdunnen van het PBA en DNA. Er zullen twee identieke platen worden voorbereid.

Eén voor het evalueren van de toxiciteit en één voor het evalueren van de transfectie-efficiëntie. Volg de poly beta amino ester of PVAE-polymeer en P-E-G-F-P-N 1D NA-voorraadoplossingen bij kamertemperatuur. Zodra deze zijn ontdooid, gebruikt u een 12-kanaals pipet om voor elke conditie een well voor te bereiden met 50 µL DNA van 0,06 mg/mL in 25 mM natriumacetaatbuffer.

Verdun vervolgens op dezelfde plaat de PBAE-polymeren tot 10 mg/mL in natriumacetaatbuffer. Verdun de PBAE-polymeren daarna verder tot polymeergewicht-DNA-gewichtsverhoudingen van 30 en 60 in 50 µL natriumacetaatbuffer. Voor de vorming van nanodeeltjes combineert u de 50 µL verdunde PBA met de 50 µL verdund plasma-DNA met een 12-kanaals pipet, waarbij u krachtig mengt door herhaaldelijk op en neer te pipetteren.

Laat het mengsel vervolgens 10 minuten incuberen bij kamertemperatuur om zelfassemblage mogelijk te maken. Gebruik na de zelfassemblage een 12-kanaals pipet om 20 µL van de nanodeeltjesoplossing druppelsgewijs toe te voegen aan elke put met gezaaide cellen die medium bevat; transfect vier putten per conditie, zoals weergegeven in dit diagram. Reserveer voor elke plaat ten minste vier putten voor zowel de negatieve als de positieve controles.

De negatieve controle bestaat uit onbehandelde cellen en de positieve controles bestaan uit cellen die zijn getransfecteerd met een commercieel beschikbaar reagens zoals lipo 2000 of Fuge hd. Incubeer de platen met de getransfecteerde cellen gedurende vier uur bij 37 °C. Verwijder na de incubatie het medium van de cellen met een 12-kanaals pipet en vervang dit door 100 µL vers hre-medium per well. Incubeer dit gedurende nog eens 24 tot 48 uur.

Verwijder de volgende dag één plaat uit de incubator. Beoordeel de celtransfectie en toxiciteit via fluorescentiemicroscopie en kwantificeer de celtoxiciteit met de cell titer 96 aqueous one-assay zoals beschreven in de begeleidende tekst. Verwijder na 48 uur de andere plaat uit de incubator.

Beoordeel de transfectie-efficiëntie via fluorescentie, microscopie en flowcytometrie zoals beschreven in de bijbehorende tekst. Gebruik de hier verkregen toxiciteits- en transfectiegegevens om de optimale concentraties PBA's te bepalen voor gebruik in toekomstige experimenten. De nano site NS 500 is een instrument voor nanoparticle tracking analysis dat informatie kan verschaffen over de grootteverdeling van een nanodeeltjesmonster door de diffusie van individuele nanodeeltjes te volgen; prime vóór gebruik het vloeistofsysteem van de nano site in een 0,5 milliliter microcentrifugebuis.

Bereid de PBA en het plasma-DNA voor analyse voor zoals eerder beschreven, met dezelfde concentraties als in het vorige gedeelte van deze video. Verdun na de zelfassemblage de nanopartikeloplossing 100 maal in PBS in een nieuwe buis van 1,5 milliliter om een eindvolume van ten minste 500 microliters te verkrijgen. Dit resulteert in een nanopartikelconcentratie binnen het juiste bereik voor nanoparticle tracking analysis.

Laad vervolgens het monster in de nano site. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden geïntroduceerd en controleer visueel of er tussen de 20 en 100 deeltjes op het scherm zichtbaar zijn. Een ideaal aantal voor nanoparticle tracking is ongeveer 50 deeltjes.

Als er te veel of te weinig deeltjes zijn, spoel de NS 500 dan door, pas de verdunning in PBS aan en laad het monster opnieuw. Als het aantal deeltjes op het scherm tussen 20 en 100 ligt, kunnen video's worden opgenomen. Zodra de video's zijn opgenomen, volgt de verwerkingsfase door een videobestand in dezelfde software te openen.

Zodra het bestand is geopend, wordt de schermversterking verhoogd. Selecteer de automatische aanpassing voor de beeldparameters door op de betreffende vakjes te klikken. Als een partikel op het scherm door de software wordt herkend, wordt dit gemarkeerd met een rood kruis.

Zodra alle deeltjes zijn gemarkeerd, klikt u in de software op de verwerkingsknop om het videobestand te verwerken. De deeltjesgrootte, de gemiddelde distributiegrootte en de deeltjesconcentratie worden vervolgens weergegeven om te verifiëren of de deeltjestelling nauwkeurig is. Herhaal deze procedure met hetzelfde monster, verdund met factor twee x en vier.

Forex in PBS werden getransfecteerd met de E-G-F-P-P-B-A-E nanodeeltjes zoals getoond in deze video. Om de transfectie-efficiëntie visueel te beoordelen, werd fluorescentiemicroscopie uitgevoerd. Deze beelden tonen de fluorescentie-, brightfield- en samengevoegde beelden van de getransfecteerde cellen; zoals te zien is in het samengevoegde beeld, expresseren de meeste cellen EGFP en behouden zij een normale morfologie.

Om de transfectie-efficiëntie te kwantificeren, werd flowcytometrie uitgevoerd, zoals te zien is in deze figuur na gating op de levende populatie. De niet-gereseceerde populatie bevatte geen EGFP-positieve cellen. Echter, 71,6% van de behandelde cellen was positief voor EGFP. Vervolgens werd Nanoparticle Tracking Analysis gebruikt om de grootteverdeling en concentratie van de nanodeeltjes te bepalen.

Voor deze analyse is het belangrijk dat de deeltjesgrootteverdeling monodispers is. Met deze informatie kan het gemiddelde aantal plasmiden per deeltje worden berekend door de concentratie plasmiden in de oplossing te delen door de deeltjesconcentratie die met de NS 500 is bepaald. Het aantal plasmiden per deeltje is een verdeling die de deeltjesgrootteverdeling weerspiegelt.

Binnen het monster zullen grotere deeltjes aanwezig zijn met een waarde voor het aantal plasmiden per deeltje dat hoger is dan het gemiddelde, evenals kleinere deeltjes met een lagere waarde voor het aantal plasmiden per deeltje dan het gemiddelde. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken dat afbreekbare polymeren niet te lang in een waterig oplosmiddel mogen blijven voordat de nanodeeltjes aan de cellen worden toegevoegd; pas voor het gebruik van ncy de verdunning aan op basis van de grootte. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe adherente celtypen kunnen worden getransfecteerd met non-virale genoverdrachtpolymeren, en hoe de transfectie-efficiëntie en de deeltjesgrootteverdeling kunnen worden gemeten.

Vergeet niet dat het werken met menselijke cellen biologisch gevaarlijk is. Draag altijd persoonlijke beschermingsmiddelen en werk in een biologische veiligheidskabinet tijdens het uitvoeren van deze procedure.