Evaluatie van polymere Gene Delivery Nanodeeltjes door Nanodeeltje Tracking Analyse en High-throughput Flow cytometrie
1 maart 2013
Een protocol voor de nanodeeltjes tracking analyse (NTA) en high-throughput flowcytometrie om polymere genafgifte nanodeeltjes evalueren beschreven. NTA wordt gebruikt om de nanodeeltjes deeltjesgrootteverdeling en het plasmide per deeltjesverdeling karakteriseren. High-throughput flowcytometrie in staat stelt kwantitatieve transfectie efficiëntie evaluatie voor een bibliotheek van gen delivery biomaterialen.
Het algemene doel van deze procedure is om gentransportexperimenten uit te voeren en te evalueren met behulp van niet-virale polymere nanodeeltjes. Dit wordt bereikt door eerst cellen te doorsnijden met gentransportdeeltjes. De transfectie-efficiëntie wordt vervolgens beoordeeld door middel van microscopie en hoogdoorvoerige flowcytometrie-analyse.
Vervolgens worden de concentratie van de nanodeeltjesgrootteverdeling en de plasmiden per deeltje bepaald met behulp van een nanodeeltjesvolganalyse-instrument. Uiteindelijk stelt deze methode nanodeeltjesgroottekarakterisering en transfectie-efficiëntie met nanodeeltjes mogelijk. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van biodegradeerbare polymere nanodeeltjes voor gentransport is dat ze veiliger en effectiever kunnen zijn dan andere genoverdrachtsmethoden.
Het belangrijkste voordeel van nanodeeltjesvolganalyse boven bestaande methoden zoals dynamisch lichtverstrooiing is dat nanodeeltjesvolganalyse direct de gemiddelde getallenverdeling en deeltjesconcentratie geeft. Deze methode zou helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van niet-viraal gentransport, zoals het aantal plasmiden per deeltje, wat belangrijk is voor co-expressiestudies. Het volgende protocol wordt gedemonstreerd met behulp van menselijke retinale endotheelcellen of hre als modelcellen en poly bèta-amino-esters of PBA AE's als modelpolymeren.
Merk op dat de kweekcondities en oplosmiddelen mogelijk 24 uur eerder moeten worden aangepast, afhankelijk van de gebruikte cellen en polymeren. Transfectie. Gebruik een multikanaals pipet om hre in heldere weefselkweekbehandelde platte bodem 96-well platen met een concentratie van 25 tot 50 cellen per microliter te zaaien.
Dit zal 70 tot 80% co fluence opgeven op de dag van transfectie, bereid en label heldere niet-weefselkweekbehandelde. 96-well platen om te dienen als masterplaten om de PBA en DNA voor te bereiden en te verdunnen. Er worden twee identieke platen voorbereid.
Een voor het evalueren van toxiciteit en een voor het evalueren van de transfectie-efficiëntie. Volg de poly bèta-amino-ester of PVAE-polymeer- en P-E-G-F-P-N 1D NA-stamk oplossingen bij kamertemperatuur. Eenmaal ontdooid, gebruik een 12-kanaals pipet om een putje met 50 microliter 0,06 milligram per milliliter DNA in 25 millimolair natriumacetaatbuffer voor elke conditie voor te bereiden.
Verdun vervolgens op dezelfde plaat de PBAE-polymeren tot 10 milligram per milliliter in natriumacetaatbuffer. Verdun vervolgens de PBAE-polymeren verder tot polymeergewicht-naar-DNA-gewichtsverhoudingen van 30 en 60 en 50 microliter natriumacetaatbuffer. Voor nanodeeltjevorming gebruikt u een 12-kanaals pipet om de 50 microliter verdunde PBA te combineren met de 50 microliter verdund plasma-DNA, krachtig gemengd door omhoog en omlaag te pipetten.
Laat het mengsel vervolgens 10 minuten bij kamertemperatuur incuberen om zelfassemblage mogelijk te maken. Na zelfassemblage gebruikt u een 12-kanaals pipet om 20 microliter van de nanodeeltjesoplossing druppelsgewijs toe te voegen aan elke put van de gezaaide cellen die medium bevatten, transfecteer vier putjes per conditie zoals weergegeven in dit diagram. Reserveer voor elke plaat ten minste vier putjes voor elk van de negatieve en positieve controles.
Negatieve controle bestaat uit onbehandelde cellen en positieve controles, bestaan uit cellen die getransfecteerd zijn met een commercieel verkrijgbaar reagens zoals lipo 2000 of Fuge hd. Incubeer de platen met de getransfecteerde cellen gedurende vier uur bij 37 graden Celsius. Na de incubatie gebruikt u de 12-kanaals pipet om het medium van de cellen te verwijderen en het te vervangen door 100 microliter per putje vers hre. Medium incubeer gedurende nog eens 24 tot 48 uur.
De volgende dag verwijdert u één plaat uit de incubator. Evalueer celtransfectie en toxiciteit door middel van fluorescentiemicroscopie en kwantificeer de celtoxiciteit met behulp van de cell titer 96 eauweuze een assay zoals beschreven in de bijbehorende tekst. Verwijder na 48 uur de andere plaat uit de incubator.
Beoordeel de transfectie-efficiëntie door middel van fluorescentie, microscopie en flowcytometrie zoals beschreven in de bijbehorende tekst. Gebruik de toxiciteit en transfectiegegevens die hier zijn verkregen om de optimale concentraties PBA's te bepalen die u voor toekomstige experimenten kunt gebruiken. De nano site NS 500 is een nanodeeltjesvolganalyse-instrument dat informatie kan verstrekken over de grootteverdeling van een nanodeeltjesmonster door de diffusie van individuele nanodeeltjes te volgen. Voor gebruik primet u het vloeistofsysteem van de nano site in een microcentrifugebuis van 0,5 milliliter.
Bereid de PBA en het plasma-DNA voor op analyse zoals eerder bij dezelfde concentraties die in het vorige deel van deze video zijn gebruikt. Na zelfassemblage verdunt u de nanodeeltjesoplossing 100 keer in PBS in een nieuwe 1,5 milliliterbuis om een eindvolume van ten minste 500 microliter te verkrijgen. Dit levert een nanodeeltjesconcentratie op in het juiste bereik voor nanodeeltjesvolganalyse.
Laad vervolgens het monster in de nano site. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden geïntroduceerd, visueel gecontroleerd om ervoor te zorgen dat er tussen de 20 en 100 deeltjes op het scherm zijn. Een ideaal aantal voor nanodeeltjesvolganalyse is ongeveer 50 deeltjes.
Als er te veel of te weinig deeltjes zijn, spoelt u de NS 500 door, past u de verdunning in PBS aan en laadt u het monster opnieuw. Als het aantal deeltjes op het scherm tussen de 20 en 100 valt, moet u video's vastleggen. Zodra de video's zijn vastgelegd, gaat u verder naar de verwerkingsfase door een videobestand te openen in dezelfde software.
Verhoog vervolgens de schermversterking wanneer het bestand is geopend. Selecteer de automatische aanpassing voor de beeldparameters door op de juiste vakken te klikken. Als een deeltje op het scherm wordt herkend door de software, wordt het gemarkeerd met een rood kruis.
Zodra alle deeltjes zijn gemarkeerd, klikt
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor het evalueren van genoverdracht met behulp van niet-virale polymere nanodeeltjes. De methode omvat het transfecteren van cellen met genenoverdrachtdeeltjes en het beoordelen van de transfectie-efficiëntie door middel van microscopie en high-throughput flow cytometry.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Genoverdracht
- Nanodeeltjestechnologie
- Biomaterialen
Achtergrond
- Niet-virale methoden voor genoverdracht worden onderzocht op veiligheid en werkzaamheid.
- Polymere nanodeeltjes kunnen een biologisch afbreekbare optie voor genregelding bieden.
- Karakterisering van nanodeeltjes is cruciaal voor het begrijpen van hun afleveringscapaciteiten.
- High-throughput technieken verbeteren de evaluatie van de transfectie-efficiëntie.
Doel van het onderzoek
- Om de effectiviteit van polymere nanodeeltjes in genoverdracht te evalueren.
- Om de nanodeeltjegrootteverdeling en plasmidegehalte te karakteriseren.
- Om geavanceerde technieken te gebruiken voor het beoordelen van de transfectie-efficiëntie.
Gebruikte methoden
- Transfectie van cellen met polymere genoverdrachtnanodeeltjes.
- Microscopie voor visuele beoordeling van transfectie.
- High-throughput flow cytometry voor kwantitatieve analyse.
- Nanodeeltjestrackinganalyse voor grootte- en plasmideverdeling.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle transfectie van cellen met behulp van biologisch afbreekbare polymere nanodeeltjes.
- Karakterisering van nanodeeltjegrootteverdeling bereikt.
- Kwantitatieve transfectie-efficiëntie geëvalueerd over verschillende biomaterialen.
- Bewezen voordelen van het gebruik van polymere nanodeeltjes voor genregelding.
Conclusies
- Polymere nanodeeltjes zijn een veelbelovend hulpmiddel voor genregelding.
- De beschreven methoden staan een uitgebreide evaluatie van de prestaties van nanodeeltjes toe.
- Verder onderzoek kan de veiligheid en effectiviteit van genregeldingstechnieken verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Robust evaluation of polymeric gene delivery nanoparticles using nanoparticle tracking analysis and high-throughput flow cytometry addresses critical challenges in non-viral gene therapy development. This workflow enables precise characterization of particle size, plasmid loading, and transfection efficacy, supporting predictive confidence in early discovery and target validation. The approach enhances portfolio decision-making by enabling scalable, quantitative assessment of novel delivery systems across diverse cell types.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of gene delivery hypotheses using defined nanoparticle formulations.
- Supports mechanistic de-risking by correlating particle characteristics with functional transfection outcomes.
- Facilitates functional target validation through reproducible, high-content transfection data.
- Improves predictive confidence for advancing delivery platforms in the pipeline.
Screening & Assay Development
- Prepares validated nanoparticle systems for high-throughput screening of transfection efficacy.
- Standardizes assay conditions using 96-well plate formats for reproducibility and scalability.
- Generates quantitative outputs on transfection and toxicity for reliable compound evaluation.
- Enables rapid comparison of polymeric carriers and cell types for platform optimization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns nanoparticle characterization with disease-relevant cell models for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement by linking in vitro efficacy to preclinical model selection.
- Provides mechanistic insight into delivery efficiency and safety for preclinical de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through lead identification, supporting iterative optimization of gene delivery vehicles and their biological performance.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on nanoparticle-mediated gene transfer and pathway engagement.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative transfection and toxicity data for candidate prioritization.
- Analytics: Provides particle size, concentration, and plasmid loading metrics for cross-condition comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical model selection when disease-relevant cells are used.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable workflow for evaluating diverse nanoparticle and cell type combinations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene delivery studies.
- Operational Value: Standardizes nanoparticle and transfection assays for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by enabling early de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of delivery platforms and gene therapy candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanoparticle formulation, cell culture, and flow cytometry analysis.
- Needs access to nanoparticle tracking instruments and high-throughput flow cytometry platforms.
- Demands cross-team standardization of assay protocols and data analysis workflows.
- Adaptable to various polymer chemistries and cell types with protocol adjustments.
- Careful handling of degradable polymers and human cells is necessary for data integrity and safety.
