Evaluatie van de spierfunctie van de m. extensor digitorum longus Ex vivo En Voorste scheenbeenspier Spier In situ In Muizen
9 februari 2013
Veranderingen in de ledematen spieren contractiele en passieve mechanische eigenschappen zijn belangrijk biomarkers voor spierziekten. Dit manuscript beschrijft fysiologische tests om deze eigenschappen te meten in het muizen extensor digitorum longus en m. tibialis anterior.
Het algemene doel van deze procedure is om de mechanische eigenschappen van de ledemaatspieren van muizen nauwkeurig te bepalen. Dit wordt bereikt door het meten van de contractiele en passieve eigenschappen van de extensor digitorum longus spier ex evo, of door het meten van de contractiele eigenschappen van de tibialis anterior spier in situ, waardoor uiteindelijk resultaten kunnen worden verkregen die een beter begrip mogelijk maken van de fysiologische veranderingen bij verschillende spierziekten en of experimentele interventies de spierfunctie verbeteren. Deze methode biedt een volledige evaluatie van de contractiele en passieve eigenschappen van de skeletspier, die twee onafhankelijke aspecten zijn van de mechanische functie van de skeletspier die nodig zijn voor lichaamsbeweging.
Daarom is een visuele demonstratie van de spierdissectieprocedure van cruciaal belang omdat het veel vaardigheden en manipulatie vereist. Ook is het grootste voordeel van de NC twee evaluatie van de contractiele eigenschappen van grote spieren ten opzichte van bestaande methoden zoals de in vitro SA, dat deze benadering de normale bloedstroom en oxygenatie niet verstoort. Een belangrijke zorg in de spierfysiologiestudie is de oxygenatie van de doelspier.
Bij een in vitro SA voor grote spieren, zoals de TA-spier, kan zuurstofdiffusie mogelijk niet het centrum van de spier bereiken. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot een therapie voor spierziekten omdat de nauwkeurige meting van de mechanische functie van de skeletspier ook kan worden gebruikt om de progressie van spierziekten te evalueren en de therapeutische werkzaamheid van nieuwe gencel- en farmacologische interventies te bepalen. Alle dierprocedures die hier worden gepresenteerd, zijn goedgekeurd door het institutionele dierenverzorgingscomité.
Dit is een niet-overlevensoperatie om het spiertestsysteem op te zetten voor de ex vivo-experimenten. Begin met het samenstellen van het weefselbad door de zuurstofbuis te bevestigen aan de watermantel weefselbad. Bevestig het samengestelde bad aan het apparatuur voor het bevestigen van spieren en plaats de naaldklep in de badafvoer.
Verbind de gasleiding en de watercirculatieleidingen met het bad. Laat 30 graden Celsius water circuleren in de jaskamer en laat vijf PSI gas door de zuurstofbuis stromen. Vul het bad met ringerbuffer en breng het in evenwicht met een gelijkmatige gasstroom.
Schakel de instrumenten in en laad de DMC-software om de EDL-spier te disseceren na anesthesie en het plaatsen van de muis op een verwarmingskussen. Scheer de achterpoot en controleer de sedatie door een teenprik uit te voeren. Plaats de muis op het dissectiebord en verwijder de huid van het been.
Gebruik twee naaiknoppen om de achterpoot en de gracilis-spier vast te zetten. Plaats een verwarmingslamp boven de muis om de kernlichaamstemperatuur op 37 graden Celsius te houden en superfuseer continu alle blootgestelde spieren met warme ringerbuffer onder een stereomicroscoop, disseceer de huid om de distale TA-pees en het extensorband te onthullen en verwijder voorzichtig de fascia die de TA-spier bedekt. Snijd het extensorband om de distale TA-pees vrij te maken.
Snijd de distale TA-pees door en gebruik deze om de TA-spier te verwijderen met een dun stuk ringerbuffer doordrenkt katoen. Stop het bloeden veroorzaakt door ruptuur van de TA-spiervaten. Vervolgens maakt u met een broodzijde naald een dubbele vierkante knoop gevolgd door een lusknoop op de distale pees van de EDL-spier.
Maak vervolgens een incisie in de biceps femoris spier om de proximale pees te onthullen en bind dezelfde set knopen op de proximale pees van de spier. Gebruik dezelfde draad om een dubbele vierkante knoop te maken. Om de hefbomenhaak aan de proximale of distale knoop te bevestigen.
Om de EDL-spier voorzichtig uit de achterpoot te disseceren. Snijd eerst de proximale pees boven de knoop en snij de vaten onder de spier door. Snijd vervolgens de distale pees onder de knoop door.
Bedek de blootgestelde achterpoot met een stuk ringerbuffer doordrenkt katoen. Bevestig vervolgens de haak aan de hefboom en lijn de spieren verticaal tussen de elektroden uit. Bevestig de distale draad aan de vaste post.
Dompel de spier onder in ringerbuffer en pas de rustspanning aan op 1,0 gram. Laat de spier minimaal 10 minuten gelijkmaken. Om de contractiele eigenschappen van de EDL-spier te meten, stelt u de parameters in voor elk van de volgende protocollen in de DMC-software zoals hier gepresenteerd.
Voor het eerste protocol stabiliseert u de EDL-spier door deze drie keer te stimuleren met 150 hertz en een 62e rust tussen de stimulaties. Laat voor het tweede protocol de spieren twee minuten ontspannen en bepaal vervolgens de optimale lengte of LN door de EDL-spier bij verschillende rustspanningen te stimuleren. Gebruik de digitale schuifmaat om de optimale spierlengte tussen de distale en proximale knopen te meten.
Laat de spier twee minuten ontspannen. Voor protocol drie past u de rustspanning aan op L naught en meet u de spierkracht bij een enkele twitch-stimulatie. Bepaal de Twitch-spanning of pt de tijd tot piekspanning of TPT en de halve ontspanningstijd van de pt.
Laat de spier twee minuten ontspannen. Om het vierde protocol uit te voeren, past u de rustspanning aan op LN en meet u de testic spierkracht die bij verschillende stimulatiefrequenties wordt gegenereerd. Meet de P NAUGH waarbij de spierkracht de maximale titanische kracht bereikt.
Meet de tijd tot piekspanning en halve ontspanningstijd voor de p naugh. Begin protocol vijf door de spier vijf minuten te laten ontspannen, pas de rustspanning aan op L Naugh en pas 10 cycli van excentrische contracties toe met twee minuten rust tussen de cycli. Bereken het relatieve krachtverlies van de PN na elke cyclus van excentrische contractie.
Los tenslotte de EDL-spier los van het apparaat en snijd de pezen bij de hechting. Bepaal het natte spiergewicht en bereken de spierdoorsnede. Om de passieve eigenschappen van de EDL-spier te meten, disseceer de contralaterale EDL-spier en bevestig deze aan het apparaat zoals
Overzicht
Deze studie beschrijft een methode voor het beoordelen van de mechanische eigenschappen van muislimbspieren, specifiek de extensor digitorum longus en tibialis anterior spieren. Door zowel contractiele als passieve eigenschappen te meten, kunnen onderzoekers inzicht krijgen in spierziekten en de effecten van experimentele interventies.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Spierfysiologie
- Biomechaniek
- Experimentele interventies
Achtergrond
- Veranderingen in spierregen zijn biomarkers voor spierziekten.
- Het begrijpen van deze eigenschappen is cruciaal voor het evalueren van spierfunctie.
- Bestaande methoden kunnen de normale bloedstroom en oxygenatie verstoren.
- Nauwkeurige metingen kunnen de therapeutische werkzaamheid van interventies informeren.
Doel van het onderzoek
- Om de mechanische eigenschappen van muislimbspieren nauwkeurig te bepalen.
- Om de fysiologische veranderingen bij spierziekten te evalueren.
- Om de impact van experimentele interventies op spierfunctie te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Dissectie van de extensor digitorum longus en tibialis anterior spieren.
- Meting van contractiele eigenschappen met behulp van in situ en ex vivo technieken.
- Beoordeling van passieve eigenschappen door middel van gecontroleerde rekprotocollen.
- Gebruik van gespecialiseerde software voor dataverzameling en -analyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle meting van zowel contractiele als passieve eigenschappen.
- Opstellen van protocollen voor het evalueren van spierfunctie.
- Inzichten in de effecten van oxygenatie op spierfysiologie.
- Mogelijke toepassingen bij het evalueren van therapieën voor spierziekten.
Conclusies
- De methode biedt een uitgebreide evaluatie van spierregen.
- Het verbetert het begrip van spierziekten en interventies.
- Toekomstige studies kunnen op deze bevindingen voortbouwen om therapeutische strategieën te verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accurate assessment of skeletal muscle contractile and passive properties is critical for evaluating disease mechanisms and therapeutic efficacy in preclinical muscle disease models. This method enables direct measurement of force generation, twitch kinetics, and passive stiffness in mouse limb muscles, providing quantitative endpoints for target validation and mechanistic de-risking. By preserving physiological conditions such as oxygenation and blood flow, the approach supports reliable preclinical data generation for go/no-go decisions in neuromuscular and dystrophy-focused discovery programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying changes in twitch force, titanic force, and time-to-peak tension in disease models.
- Operational Value: Provides functional readouts that clarify pathway involvement and support biological de-risking of targets affecting calcium handling, ATP turnover, or sarcolemma integrity.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking molecular interventions to measurable improvements in contractile and passive muscle properties.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible measurements of muscle force and relaxation kinetics suitable for compound screening campaigns.
- Quantitative Output: Delivers normalized force values (e.g., specific twitch and titanic force) and kinetic parameters (TPT, 1/2RT) for cross-study comparison.
- Scalability: Supports evaluation of contralateral muscles and repeated testing cycles to assess fatigue resistance and recovery profiles.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly models pathophysiological changes seen in Duchenne muscular dystrophy, including reduced force output and increased passive stiffness.
- Translational Continuity: Enables longitudinal assessment from discovery through preclinical validation by tracking functional decline and rescue.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes between contractile deficits and fibrosis-driven stiffness, informing mechanism-based therapeutic strategies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation to preclinical efficacy testing, offering a functional bridge between molecular phenotypes and whole-muscle physiology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring how genetic or pharmacological manipulations affect force generation and relaxation dynamics in intact muscle preparations.
- Screening: Enables assay standardization through controlled stimulation protocols and equilibration periods, ensuring reliable compound evaluation.
- Analytics: Generates key performance indicators including peak force, time-to-peak tension, half-relaxation time, and stress-strain profiles for comparative analysis.
- Translational Research: Connects in vitro findings to tissue-level function by assessing both active and passive properties in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating multiple muscle groups (EDL, TA) and disease models, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in muscle function assessment.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized dissection, mounting, and stimulation protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of ineffective candidates, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted advancement decisions based on functional rescue in validated preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse muscle dissection, suture techniques, and physiological monitoring under sterile conditions.
- Dependent on specialized hardware including tissue baths, lever arm systems, stimulators, and DMC-compatible data acquisition software.
- Necessitates cross-team standardization of protocols for stimulation frequency, tension adjustment, and data analysis to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different muscle types or disease models with altered morphology or contractility.
- Limited by tissue viability duration, necessitating timely execution of protocols post-dissection to maintain physiological fidelity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:57
Equipment Preparation and Extensor Digitorum Longus Muscle Dissection
5:50
Measuring the Contractile and Passive Properties of the EDL Muscle
8:44
Evaluation of the Contractile Properties of the TA Muscle In situ
13:40
Conclusion
11:52
Representative Contractile and Passive Muscle Measurements
