Name: Evaluatie van de spierfunctie van de m. extensor digitorum longus Ex vivo En Voorste scheenbeenspier Spier In situ In Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 36 s
Description: Leer de mechanische eigenschappen van muisspieren meten met ex vivo en in situ technieken voor de extensor digitorum longus en tibialis anterior. Deze methode helpt onderzoekers spierziekten en therapeutische interventies evalueren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (AR-49419, DD), Muscular Dystrophy Association (DD), en NIH opleiding subsidie ​​T90DK70105 (CH).

1. Evaluatie van de contractiele en passieve eigenschappen van de EDL Muscle Ex vivo De contractiele en passieve eigenschappen van de EDL spier worden gemeten ex vivo met behulp van de Aurora Wetenschappelijk in vitro spiertest systeem. Zie Tabel 1 voor materialen en apparatuur. 1,1 Apparatuur voorbereiding <ol><li> Monteer de weefsel-orgaan-bad door zich te verzekeren van de oxytube om het water-jacket weefsel bad. Bevestig de geassembleerde bad om de spier montageonderdelen. Sluit de gasleiding aan de oxytube. Bevestig de watercirculatie lijnen naar de water-jacket weefsel bad en plaats de naald ventiel in het bad drainage. </li><li> Zet de circulerende waterbad en de temperatuur op 30 ° C 7. Toestaan ​​5 PSI (pounds per square inch) van 95% O 2 -5% CO2 stromen door de oxytube. Vul het bad met buffer Ringer&#39;s. Equilibreren de buffer minstens10 min met een constante gasstroom door instelling van de klep oxytube. </li><li> Zet de instrumenten (stimulator, dual-mode hendel systeem, en signaal-interface). Laad de dynamische spiercontrole (DMC) software volgens de instructies van de fabrikant. </li></ol> 1,2 EDL spier dissectie Alle dierlijke studies moeten worden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite. <ol><li> Verdoven de muis met intraperitoneale injectie van 2,5 ul / g lichaamsgewicht van het verdovingsmiddel cocktail (zie materialen sectie). Gedurende de chirurgische procedure, is de diepte van sedatie gecontroleerd door het uitvoeren van een pinch toe. Een supplement van 10% van de initiële dosis anestheticum wordt toegediend als nodig is om het dier onder verdoving te houden. Scheer het achterste lidmaat. Handhaven van het lichaam kerntemperatuur bij 37 ° C voorafgaand aan dissectie procedure door de muis op een verwarmingskussen. De lichaamstemperatuur bewaakt door voortdurend meten van de rectale temperature met een thermische probe. </li><li> Plaats de muis rug op de dissectie board (figuur 1). Verwijder het been huid om de achterste ledematen spieren bloot te leggen. Bevestig het been op de Sylgard blok met twee naaister pennen, een in de voet en de andere in de gracilis spier. Plaats een warmtelamp boven de muis lichaam de lichaamstemperatuur te handhaven op 37 ° C. Voortdurend superfuse alle zichtbare spieren met buffer Ringer&#39;s. Giet het overtollige buffer door middel van een vacuüm lijn. </li><li> Maak de distale TA pees en de extensor ligament onder een stereomicroscoop bij het ontleden van de huid in de richting van de voet. Verwijder voorzichtig de fascia over de TA spier. Snijd de extensoren ligament aan de distale TA pees los te laten. </li><li> Snijd de distale TA pees en gebruik deze om losraken van de TA spier. Verwijder voorzichtig de TA spier aan het proximale bevestiging. Plaats een dun stuk buffer Ringer&#39;s gedrenkte katoenen naast de EDL spier te bloeden veroorzaakt door de breuk van de TA spier vaatstelsel te absorberen. Gebruik de vacuümleiding om overtollige buffer en bloed te verwijderen. </li><li> Maak een dubbele vierkante knopen gevolgd door een lus knoop met een brood zijden hechtdraad in de spier pees knooppunt (MTJ) van het distale EDL spier (figuur 2). Een insnijding in het distale deel van de m. biceps femoris het proximale EDL spier bloot. Herhaal dezelfde reeks knopen (figuur 2) op MTJ van de proximale EDL pees. Bevestig de hefboom haak om ofwel de proximale of de distale knopen met een dubbele platte knoop met dezelfde hechtdraad lijn. Snijd de resterende hechting. </li><li> Snij de proximale EDL pees boven de proximale hechtdraad knoop. Til de EDL spier met de haak en snijd het vaatstelsel onder de spier. Snijd de distale EDL pees inferieur aan de distale hechtdraad knoop om de EDL spier te verwijderen uit het achterste lidmaat. Bedek de blootgestelde achterste ledematen met een stuk buffer Ringer&#39;s gedrenkte katoen. </li><li> Bevestig de haak als de hendel. Verticaal uitlijnen de spiertussen twee elektroden. Bevestig de distale hechting aan de vaste post. Til het weefsel bad onder te dompelen de spier in de buffer Ringer&#39;s. Stel de rustplaats spanning tot 1,0 g met de dubbele grof / fijn translatietafel en laat de spier equilibreren ten minste 10 minuten. </li></ol> 1,3 Het meten van de contractiele en passieve eigenschappen van de EDL spier Tabel 2 gebruikt om de parameters in de DMC software voor elk van de volgende metingen. Analyseer de gegevens met behulp van de dynamische spier-analyse (DMA) software. 1.3.1 Het meten van de contractiele eigenschappen van de EDL spier <ol><li> Stimuleren van de EDL spier drie keer bij 150 Hz met 60 sec uit elkaar om de spier 8 stabiliseren. </li><li> Stimuleren van de EDL spier op verschillende rust spanningen op de optimale lengte (Lo) te bepalen. De optimale lengte is de lengte waarbij spier ontwikkelt maximum twitch spanning. Laat de spierontspannen 2 min. </li><li> Pas de rust spanning naar Lo. Meet spierkracht op een twitch stimulatie. Bepaal de absolute twitch kracht (Pt), tijd tot piek spanning (TPT) en half relaxatietijd (½ RT) van het Pt. Laat de spieren te ontspannen gedurende 2 minuten. </li><li> Pas de rust spanning naar Lo. Meet tetanische spierkracht gegenereerd op verschillende stimulatie frequenties (50, 80, 100, 120, 150 en 200 Hz). Bepaal de absolute maximale tetanische spierkracht (Po), waar spierkracht bereikt de maximale. Meet de TPT en ½ RT van de Po 9. </li><li> Laat de spieren te ontspannen gedurende 5 minuten. Pas de rust spanning naar Lo. Breng 10 cycli van excentrische contracties met 2 min rust tussen de cycli. Bereken het relatieve kracht verlies van de Po na elke cyclus van excentrische contractie. </li><li> Maak de EDL spier van het apparaat en snijd de pezen aan de hechtdraad site. Bepaal de spier natte gewicht en bereken de spier dwarsdoorsnede (CSA)6,10. </li></ol> 1.3.2 Het meten van de passieve eigenschappen van de EDL spier <ol><li> Prepareer de contralaterale EDL spier en bevestig deze aan het apparaat, zoals beschreven in paragraaf 1.2, stap 2 tot 7. </li><li> Betreft de EDL spier om een ​​zes-stappen stretching protocol waar de spier wordt tot 160% Lo stress met een toename van 10% Lo. Analyseer de spanning-rek profiel 6. </li><li> Evalueer de viskeuze eigenschap van de EDL spier door het meten van de spanning relaxatiesnelheid (SRR) bij de volgende tijdsintervallen na rekken en houdt de spier 10% Lo: van piek tot 0,1 s post-piek (pp), 0,1 tot 0,2 s pp, 0,2 tot 0,5 s pp, 0,5 tot 1s pp en van 1 tot 1,5 s pp </li><li> Aan het einde van de studie euthanaseren de muis door cervicale dislocatie en / of onthoofding terwijl de muis nog onder narcose. Maak de EDL spier van het apparaat en snijd de pezen aan de hechtdraad site. Bepaal de spier natte gewicht en bereken de spier kruis sectional gebied (CSA) 6, 10. </li></ol> 2. Evaluatie van de contractiele eigenschappen van de TA spier in situ De contractiele eigenschappen van de TA spier worden gewaardeerd in de Aurora Wetenschappelijk in situ spiertest systeem. Zie Tabel 1 voor materialen en apparatuur. 2,1 Apparatuur voorbereiding <ol><li> Verwarm de thermo gecontroleerde dierlijke stadium tot 37 ° C met de circulerend waterbad. </li><li> Zet de instrumenten (stimulator, dual-mode hendel systeem, en signaal-interface). Laad de DMC-software volgens de instructies van de fabrikant. </li></ol> 2.2 Voorbereiding van de TA spier voor in situ krachtmeting <ol><li> Verdoof de muis, scheren het achterste lidmaat en bloot de TA spier zoals beschreven in stappen 1 tot 3 in paragraaf 1.2. </li><li> Maak een dubbele platte knoop rond de knieschijf ligament USIng een brood zijden hechtdraad. Maak een dubbele platte knoop, gevolgd door een lus knoop aan de MTJ van de distale TA spier (figuur 2), das nog een dubbele platte knoop het verlaten van een ~ 10 mm loop van het distale TA pees knoop met dezelfde hechtdraad lijn. Plaats de tweede dubbele platte knoop aan de zijkant van de lus. </li><li> Verwijder de pennen van het achterste lidmaat en plaats het dier vatbaar. Maak de m. biceps femoris. Maak een insnijding in de middellijn van de nervus zenuw te onthullen. Maak een dubbele platte knoop rond het proximale uiteinde van de nervus ischiadicus. Trim een ​​zijde van de sutuurlijnen en snijd de zenuw boven de knoop. Voorzichtig, trek de heupzenuw in de richting van de knie met behulp van de hechting en schakelt u het omliggende bindweefsel om gratis ~ 5 mm van de lengte. Laat de zenuw niet rekken tijdens deze procedure en voortdurend de zenuw superfuse met belsignaal buffer. </li><li> Bereid de contralaterale TA spier, zoals beschreven in de stappen 1 tot 3. Betrekking hebben op een van de achterste ledematen blootgesteld met een stuk Ringer de buffer geweekt katoen. Voortdurend superfuse beide achterpoten met voorverwarmd (37 ° C) buffer Ringer&#39;s. Verwijder het teveel aan buffer door middel van een vacuüm lijn. </li><li> Plaats het dier gevoelig op het dier platform. Bevestig de knie klemhouder om het dier platform en zet beide knieën naar de metalen pin met dubbele vierkante knopen met behulp van de patella ligament hechtdraad lijnen. Pin beide voeten op de Sylgard blok met behulp van naaister pinnen. Zet het dier platform op de thermo-gecontroleerde fase. Plaats de warmtelamp het dier kernlichaam temperatuur op 37 ° C. </li><li> Zet de elektrode houder om het dier platform en leg de heupzenuw op de elektrode met behulp van de hechting. Houd de elektrode uit de buurt van het achterste lidmaat spieren. Snijd de distale TA pees van de onbedekte achterste ledematen op de MTJ hechtdraad site. Bevestig de distale TA pees hechtdraad lus als de hendel haak. Bedek het blootgestelde achterste ledematen spieren met buffer een warme Ringer&#39;s gedrenkte katoen. </li></ol><ol><li> Gebruik Tabel 2 om de parameters in te stellen in de DMC-software. Volg hetzelfde protocol beschreven in paragraaf 1.3.1 van de contractiele eigenschappen van de TA spier te bepalen. Analyseer de gegevens met behulp van de DMA-software. </li><li> Na contractiele meten van de eigenschappen, maak de distale TA pees hechtdraad lus van de leveller arm haak. Verwijder de TA spier. Bepaal de spier natte gewicht en bereken de CSA 10. </li><li> Meet de contractiele eigenschappen van de contralaterale TA spier volgens stappen 1 tot 3 hierboven beschreven. Euthanaseren de muis volgens de institutionele richtlijnen aan het einde van de studie. </li></ol>

<ol><li>Huijing, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+as+a+collagen+fiber+reinforced+composite%3A+a+review+of+force+transmission+in+muscle+and+whole+limb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Muscle as a collagen fiber reinforced composite: a review of force transmission in muscle and whole limb.</a> J. Biomech. 32, 329-345 (1999).</li>
<li>Moss, R. L., Halpern, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+and+viscous+properties+of+resting+frog+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Elastic and viscous properties of resting frog skeletal muscle.</a> Biophys. J. 17, 213-228 (1977).</li>
<li>Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin%3A+the+protein+product+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus.</a> Cell. 51, 919-928 (1987).</li>
<li>Petrof, B. J., Shrager, J. B., Stedman, H. H., Kelly, A. M., Sweeney, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+protects+the+sarcolemma+from+stresses+developed+during+muscle+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 3710-3714 (1993).</li>
<li>Pastoret, C., Sebille, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mdx+mice+show+progressive+weakness+and+muscle+deterioration+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol.+Sci%22%5BJournal%5D)">mdx mice show progressive weakness and muscle deterioration with age.</a> J. Neurol. Sci. 129, 97-105 (1995).</li>
<li>Hakim, C. H., Grange, R. W., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+passive+mechanical+properties+of+the+extensor+digitorum+longus+muscle+are+compromised+in+2-+to+20-mo-old+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The passive mechanical properties of the extensor digitorum longus muscle are compromised in 2- to 20-mo-old mdx mice.</a> J. Appl. Physiol. 110, 1656-1663 (2011).</li>
<li>Segal, S. S., Faulkner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-dependent+physiological+stability+of+rat+skeletal+muscle+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Temperature-dependent physiological stability of rat skeletal muscle in vitro.</a> Am. J. Physiol. 248, 265-270 (1985).</li>
<li>Grange, R. W., Gainer, T. G., Marschner, K. M., Talmadge, R. J., Stull, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast-twitch+skeletal+muscles+of+dystrophic+mouse+pups+are+resistant+to+injury+from+acute+mechanical+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Fast-twitch skeletal muscles of dystrophic mouse pups are resistant to injury from acute mechanical stress.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, 1090-1101 (2002).</li>
<li>Hakim, C. H., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+differences+in+contractile+and+passive+properties+of+mdx+extensor+digitorum+longus+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Gender differences in contractile and passive properties of mdx extensor digitorum longus muscle.</a> Muscle Nerve. 45, 250-256 (2012).</li>
<li>Hakim, C. H., Li, D., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+murine+skeletal+muscle+function+for+muscle+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Monitoring murine skeletal muscle function for muscle gene therapy.</a> Methods Mol. Biol. 709, 75-89 (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

In dit protocol hebben we geïllustreerd fysiologische assays voor het meten van de contractiele eigenschappen en passieve EDL de spier en de contractiele eigenschappen van de spier TA. Een belangrijk punt van zorg in de spier fysiologie studies is de zuurstofvoorziening van de doelspier. Voor grote spieren (zoals TA spier), wordt het in situ benadering voorkeur omdat zuurstofdiffusie uit buffer Ringer&#39;s kan het midden van de spier niet bereiken in een in vitro assay. In situ aanpak niet normale bloedtoevoer en hypoxie-geassocieerde verstoren kunstmatige effecten worden vermeden. De EDL spier is een van de meest gebruikte spier in fysiologie studie. Voldoende zuurstof van de gehele spier kan worden bereikt in een in vitro systeem vanwege de kleine grootte van de spier. Verder het in vitro systeem biedt een gesloten milieu de concentraties van ionen (Ca 2 +, Na + en K +) en chemisch manipulerencals (ATP en glucose) die nodig zijn voor een optimale spierkracht generatie. Dit biedt een geweldige kans om het effect van deze variabelen op kracht productie te bestuderen. Nauwkeurige meting van de contractiele en passieve eigenschappen van het ledemaat spier is essentieel voor de skeletspier functie te bestuderen. Kenmerkende veranderingen van deze eigenschappen worden vaak beschouwd als de kenmerken van verschillende spierziekten. Veranderingen in deze parameters zijn belangrijk indicatoren te bepalen of een experimentele therapie effectief is of niet.

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiaal </td><td> Fabrikant </td><td></td><td> Specificaties en opmerkingen </td></tr><tr><td> Tissue-orgaanbad </td><td> Radnoti LLC, CA, USA </td><td></td><td> Water-jacket weefsel bad (Cat # 158351-LL), Zuurstof dispergeerinrichting buis (Cat # 160192), Luer klep (Cat # 120722) </td></tr><tr><td> Circulerend waterbad </td><td> Fisher Scientific, Waltham, MA, Verenigde Staten </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gasmengsel </td><td> Airgas National, Charlotte, NC, USA </td><td></td><td> 95% O2 en 5% CO2 </td></tr><tr><td> In vitro assay inrichting spierfunctie </td><td> Aurora Wetenschappelijk, Aurora, ON, Canada </td><td></td><td> Het systeem bestaat uit een stimulator (Model # 701A), een dual-mode hefsysteem (Model # 300C of 305C), een signaal interface (Model # 604B) en een test apParatus (Model # 800A) om verticaal te monteren weefsel orgaanbad </td></tr><tr><td> In vitro assay software spierfunctie </td><td></td><td></td><td> Dynamic spiercontrole (DMC) software en dynamische spiercontrole data analyse (DMA) software </td></tr><tr><td> Muis anesthesie cocktail gemengd in 0,9% NaCl </td><td> Raadpleeg de institutionele richtlijnen </td><td></td><td> Ketamine (25 mg / ml), xylazine (2,5 mg / ml) en acepromazine (0,5 mg / ml). Gedurende de chirurgische procedure, kan een supplement van 10% van de initiële dosis nodig moeten dierlijke onder verdoving. </td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Wereld Precision Instrument </td><td> Cat # SYLG184 </td><td></td></tr><tr><td> Een op maat gemaakte plexiglas dissectie boord </td><td> In ontworpen huis </td><td></td><td> Zie Figuur 1 </td></tr><tr><td> Warmtelamp </td><td> Tensor Lighting Company,Boston, MA, USA </td><td></td><td> 15 Watt lamp om de muis te warm te houden tijdens dissectie </td></tr><tr><td> Ringer-Buffer </td><td> Chemische stoffen worden ingekocht bij Fisher Scientific, Waltham, MA, Verenigde Staten </td><td></td><td> Samenstelling in mM: 1,2 NaH 2PO 4 (Cat # S369), 1 MgSO4 (Cat # M63), 4,83 KCl (Cat # P217), 137 NaCl (Cat # 217), 24 NaHCO3 (Cat # S233), 2 CaCl2 (Cat # C79) en 10 glucose (Cat # D16). Individueel Los chemicaliën en mengen in de volgorde zoals hierboven aangegeven. Bewaar bij 4 ° C. </td></tr><tr><td> Stereo dissectiemicroscoop </td><td> Nikon, Melville, NY, USA </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissectie-instrumenten </td><td> Fine Science Tools, Foster City, CA, USA </td><td></td><td> Grof tang, grof scharen, fijn pincet (recht en hoek van 45 °) </td></tr><tr><td> Gevlochten zijden hechtdraad # 4-0 </td><td> SofSilk USSC Suturen, Norwalk, CT, Verenigde Staten </td><td> Cat # SP116 </td><td></td></tr><tr><td> Een op maat gemaakte RVS haak </td><td> Kleine onderdelen, Inc </td><td></td><td> 2&#39;&#39; lange S / S 304V (0,18&#39;&#39; diameter) voor krachtopnemer 305C of 2,5&#39;&#39; lange S / S 304V (0,012&#39;&#39; diameter) voor transducer 300C (Cat # ASTM A313) </td></tr><tr><td> In situ spierfunctie testsysteem </td><td> Aurora Wetenschappelijk, Aurora, ON, Canada </td><td></td><td> Het systeem (809B, in situ muis toestellen) bestaat uit een stimulator (Model # 701B), een dual-mode hefboomsysteem (Model # 305C), een signaal interface (Model # 604A) en een thermo gecontroleerde voetplaat inrichting (Model # 809A ) </td></tr><tr><td> In vitro assay software spierfunctie </td><td> Aurora Wetenschappelijk, Aurora, ON, Canada </td><td></td><td> Dynamic spiercontrole (DMC) software en dynamische spiercontrole data analyse (DMA) software </td></tr><tr><td> Een op maat gemaakte TA test dier-platform </td><td> In ontworpen huis </td><td></td><td> Zie Afbeelding 2 </td></tr><tr><td> Een op maat gemaakte RVS haak </td><td> Kleine onderdelen, Inc </td><td> Cat # ASTM A313 </td><td> 0,5&#39;&#39; lange S / S 304V (0,18&#39;&#39; diameter) </td></tr><tr><td> Custom-made 25G platina-elektroden </td><td> Chalgren Enterprises, Gilroy, CA </td><td></td><td> Soldeer twee 0,016&#39;&#39; dik platina draden twee elektrische draden 24G </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Materialen en apparatuur.

evaluatie van de spierfunctie van de m. extensor digitorum longus<em&gt; ex vivo</em&gt; en voorste scheenbeenspier spier<em&gt; in situ</em&gt; in muizen

Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice

Bewegingen van het lichaam worden voornamelijk geleverd door de mechanische werking van de skeletspieren. Skeletspier bestaat uit verschillende bundels myovezels die ommanteld door intramusculaire bindweefsel. Elke myofiber bevat vele myofibrillen die in de lengte langs de lengte van de myofiber. Myofibrillen zijn het contractiele apparaat van spieren en zij bestaan ​​uit herhaalde eenheden bekend als contractiele sarcomeren. Een sarcomeer eenheid bevat actine en myosine filamenten die zijn verdeeld door de schijven en Z titin eiwit. Mechanische functie van skeletspier wordt bepaald door de contractiele en passieve eigenschappen van de spier. De contractiele eigenschappen worden gebruikt om de hoeveelheid kracht die tijdens spiercontractie tijd troepenmacht en tijd van spierontspanning karakteriseren. Elke factor die spiercontractie (zoals interactie tussen actine en myosine filamenten, homeostase van calcium, ATP / ADP verhouding, etc.) beïnvloedt beïnvloedt de contractiele properties. De passieve eigenschappen verwijzen de elastische en visceuze eigenschappen (stijfheid en viscositeit) van de spier in afwezigheid van krimp. Deze eigenschappen worden bepaald door de extracellulaire en intracellulaire structurele componenten (zoals titin) en bindweefsel (vooral collageen) 1-2. De contractiele en passieve woningen zijn twee onafscheidelijke aspecten van spierfunctie. Zo wordt flexie bereikt door samentrekking van spieren in het voorste compartiment van de bovenarm en passieve rek van de spieren in het achterste compartiment van de bovenarm. Om echt te begrijpen spierfunctie, moeten zowel contractiele en passieve eigenschappen worden bestudeerd. De contractie en / of passieve mechanische eigenschappen van de spier worden vaak gecompromitteerd in spierziekten. Een goed voorbeeld is de ziekte van Duchenne (DMD), een ernstige spier slopende ziekte veroorzaakt door tekort aan dystrofine 3. Dystrofine een cytoskelet protein dat stabiliseert de spiercelmembraan (sarcolemma) tijdens spiercontractie 4. In afwezigheid van dystrofine, wordt de sarcolemma beschadigd door de afschuifkracht gegenereerd tijdens overbrenging. Dit membraan scheuren start een kettingreactie die leidt tot spier-celdood en verlies van contractiele machines. Bijgevolg wordt spierkracht verminderd en dode myovezels vervangen door fibrotisch weefsel 5. Deze latere verandering is een verbetering spierstijfheid 6. Nauwkeurige meting van deze veranderingen geeft belangrijke leidraad voor progressie van de ziekte te evalueren en om de therapeutische werkzaamheid van nieuwe genen / cel / farmacologische interventies te bepalen. Hier presenteren we twee methodes om zowel de contractiele en passieve mechanische eigenschappen van de m. extensor digitorum longus (EDL) spier en de contractiele eigenschappen van de tibialis anterior (TA) spier te evalueren.

De volgende resultaten zijn een weergave van onze vorige rapporten 6,9. Gegevens zijn weergegeven als gemiddelde ± standaardfout van gemiddelde. Tabel 3 toont de eigenschappen van de morfometrische EDL spier in normale BL10 en dystrofine-deficiënte (mdx) muizen van 4 tot 6 maanden. Figuur 4 toont representatieve contractiele en passieve eigenschappen van de EDL spier van BL10 en mdx muizen. De contractiele eigenschappen van de EDL spier worden beschreven door de volgende bepalingen, met inbegrip van de specifieke (absolute kracht gedeeld door de CSA) twitch kracht (Figuur 4A), specifieke maximale tetanische kracht (Figuur 4B), TPT en ½ RT van de absolute maximale tetanische kracht (Figuur 4C en D). De TPT en ½ RT kan ook berekenen worden van de absolute twitch kracht. De spanning-rek profiel (Figuur 4E) en SRR (figuur 4F) eenopnieuw gebruikt om de passieve eigenschappen van de EDL spier te beschrijven. Afwezigheid van dystrofine heeft een grote invloed op de contractiele en passieve eigenschappen van de EDL spier 6,9. Specifieke twitch en tetanische krachten aanzienlijk verminderd in de mdx EDL spier. Het TPT is aanzienlijk sneller, terwijl de ½ RT is significant langzamer in de mdx EDL spier. De spanning-rek profiel suggereert dat stijfheid wordt significant verhoogd in de mdx EDL spier. De mdx EDL spier levert ook een aanzienlijk veel hoger weerstandskracht (passieve stress) vóór het bereiken van de piek stress, terwijl de post-piek spanningen leidt dit veel sneller. Verder is de SRR significant hoger in de mdx EDL spier vergeleken met die van de BL10 EDL spier. Statistische analyse Statistische significantie tussen twee groepen wordt geanalyseerd door de Student t-test. Voor statistical belang tussen meerdere groepen, One-way of twee-weg ANOVA-analyse, gevolgd door Bonferroni post hoc analyse is aan te bevelen het gebruik van de SAS-software (SAS Institute Inc, Cary, NC). Verschil significant beschouwd bij p &lt;0,05. Tabel 1. Materialen en apparatuur. <table border="1"><tbody><tr><td class="jove_content_small"> Experiment </td><td class="jove_content_small"> Resting spanning (gram) </td><td class="jove_content_small"> Puls frequentie (Hz) </td><td class="jove_content_small"> Pulsbreedte (ms) </td><td class="jove_content_small"> Stimulatie duur (ms) </td><td class="jove_content_small"> Stretch lengte </td><td class="jove_content_small"> Stretch duur (ms) </td><td class="jove_content_small"> Stretch tarief </td><td class="jove_content_small"> Reacties </td></tr><tr><td colspan="9"> 1. Evaluatie van de contractiele en passieve eigenschappen van de EDL spier ex vivo </td></tr><tr><td colspan="9"> 1.3.1 Het meten van de contractiele eigenschappen van de EDL spier </td></tr><tr><td> 1. Opwarmen </td><td> 1,0 </td><td> 150 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Rest de spier gedurende 60 sec tussen elke stimulus. Deze voorlopige tetanische contracties stabiliseren van de spieren voor de volgende metingen. </td></tr><tr><td> 2. Optimale spierlengte (Lo) </td><td> 0,5, 1,0, 1,5 en 2,0 </td><td> 1 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Laat de spieren te ontspannen gedurende 30 seconden tussen elke stimulus. Meet de spier optimale lengte met behulp van een digitale schuifmaat. </td></tr><tr><td> 3. Single TWItch kracht (Pt) </td><td> Stel rustplaats spanning naar Lo </td><td> 1 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 4. Tetanische spierkracht </td><td> Stel rustplaats spanning naar Lo </td><td> 50, 80, 100, 120, 150 en 200 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Laat de spieren te ontspannen gedurende 1 minuut tussen elke stimulus. Bepaal de frequentie die de maximale absolute tetanische kracht (Po) genereren. </td></tr><tr><td> 5. Excentrische contractie </td><td> Stel rustplaats spanning naar Lo </td><td> Gebruik de frequentie die de maximale tetanische kracht (Po) genereert </td><td> 0,2 </td><td> 700 </td><td> 10% Lo </td><td> laatste 200 ms van de stimulatie duur </td><td> 0,5 Lo / sec </td><td> Herhaal de excentrische contractie gedurende 10 cycli met 2 min rust tussen de cycli. </td></tr><tr><td> 6. CSA van de EDL spier </td&gt; <td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> CSA = (spiermassa (g) / [1,06 g / cm 3 x (Lo x 0,44)]. 1,06 g / cm 3 is de spier dichtheid en 0,44 is EDL spiervezels lengte verhouding Lo. </td></tr><tr><td colspan="9"> 1.3.2 Het meten van de passieve eigenschappen van de EDL spier </td></tr><tr><td> 1. Zes stappen stretching protocol </td><td> Stel rustplaats spanning naar Lo </td><td></td><td></td><td></td><td> 10% Lo </td><td></td><td> 2 cm / sec </td><td> Herhaal de stretching-protocol met een toename van 10% Lo tot 160% Lo is bereikt. Alow 1,5 sec tussen stretch cycli. </td></tr><tr><td> 2. SRR </td><td> Stel rustplaats spanning naar Lo </td><td></td><td></td><td></td><td> 10% Lo </td><td></td><td> 2 cm / sec </td><td> SSR wordt berekend door het verschil in de spanning met de time verstreken tussen twee tijdstippen in een tijdsbestek. </td></tr><tr><td colspan="9"> 2,3 Het meten van de contractiele eigenschappen van de TA spier </td></tr><tr><td> 1. Opwarmen </td><td> 4,0 </td><td> 150 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Rest de spier gedurende 60 sec tussen elke stimulus. </td></tr><tr><td> 2. Optimale spierlengte (Lo) </td><td> 3.0, 4.0, 5.0, 6.0 en 7.0 </td><td> 1 </td><td> 0,2 </td><td> 300 </td><td></td><td></td><td></td><td> Laat de spieren te ontspannen gedurende 30 seconden tussen elke stimulus. Meet de spier optimale lengte met behulp van een digitale schuifmaat. </td></tr><tr><td> 3. CSA van de TA spier </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> CSA = (spiermassa (g) / [1,06 g / cm 3 x (Lo x 0,6)]. 0,6 is TA spiervezels lengte Lo ratio. </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Parameters voor de evaluatie van de mechanische eigenschappen van de EDL en TA spieren. <table border="1"><tbody><tr><td> Spannen </td><td> Leeftijd (maand) </td><td> Lichaamsgewicht (g) </td><td> EDL gewicht (mg) </td><td> EDL Lo (mm) </td><td> EDL CSA (mm 2) </td></tr><tr><td> BL10 </td><td> 6 </td><td> 32,03 ± 0,57 </td><td> 13,90 ± 0,77 </td><td> 14,09 ± 0,04 </td><td> 2,12 ± 0,12 </td></tr><tr><td> mdx </td><td> 6 </td><td> 35,44 ± 0,42 * </td><td> 16,73 ± 0,42 * </td><td> 13,93 ± 0,05 * </td><td> 2,57 ± 0,07 * </td></tr></tbody></table> Tabel 3. Morfometrische eigenschappen van de EDL spier. *, De waarde in mdx muizen significant verschilt van die van vergelijkbare leeftijd BL10 muizen. <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig1.jpg" alt="Figuur 1" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig1highres.jpg" fo:content-width="5.5in"/> Figuur 1. Een schematische weergave van de op maat gemaakte muis dissectie boord. De dissectie board is gemaakt van een ½ cm dik plexiglas en werd vervaardigd bij de institutionele winkel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50183/50183fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig2.jpg" alt="Figuur 2" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig2highres.jpg" fo:content-width="4in"/> /&gt; Figuur 2. Een reeks van digitale beelden die de stappen van het leggen van een dubbele platte knoop gevolgd door een lus knoop aan het MTJ. Asterisk deEDL spier, Pijl, de distale pees van de EDL spier. <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig3.jpg" alt="Figuur 3" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig3highres.jpg" fo:content-width="6in"/> /&gt; Figuur 3. Een schematisch diagram van de maat platform in situ TA spierfunctie assay. Plexiglas dier platform en de roestvrijstalen houder knie ontworpen voor montage op de 809B in situ muis inrichting. *, Roestvrijstalen stang (Cat # MPR-2.0 , Siskiyou, Grants Pass, OR), #, Universele elektrode houder (Cat # MXB, Siskiyou, Grants Pass, OR), §, elektrode bevestiging stang (Cat # MPR-3.0, Siskiyou, Grants Pass, OR); **, Sylgard blok. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50183/50183fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;altijd&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50183/50183fig4.jpg" alt="Figuur 4" fo:src="/files/ftp_upload/50183/50183fig4highres.jpg" fo:content-width="4in"/> /&gt; Figuur 4. Representatieve resultaten voor de contractiele en passieve eigenschappen van de EDL spier. De contractiele eigenschappen van de EDL spier worden gekenmerkt door de specifieke werking twitch (A), de specifieke tetanische kracht (B) de tijd tot maximale spanning (C) en de half relaxatietijd (D). De passieve eigenschappen van de EDL spier worden beoordeeld door de stress stam profiel (E) en de SSR. *, Mdx muizen zijn significant verschillend van BL10 muizen leeftijd gematchte.

Veranderingen in de ledematen spieren contractiele en passieve mechanische eigenschappen zijn belangrijk biomarkers voor spierziekten. Dit manuscript beschrijft fysiologische tests om deze eigenschappen te meten in het muizen extensor digitorum longus en m. tibialis anterior.

Evaluatie van de spierfunctie van de m. extensor digitorum longus<em&gt; Ex vivo</em&gt; En Voorste scheenbeenspier Spier<em&gt; In situ</em&gt; In Muizen

Body  movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal  muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are ...

Het algemene doel van deze procedure is om de mechanische eigenschappen van de ledemaatspieren van muizen nauwkeurig te bepalen. Dit wordt bereikt door het meten van de contractiele en passieve eigenschappen van de extensor digitorum longus spier ex evo, of door het meten van de contractiele eigenschappen van de tibialis anterior spier in situ, waardoor uiteindelijk resultaten kunnen worden verkregen die een beter begrip mogelijk maken van de fysiologische veranderingen bij verschillende spierziekten en of experimentele interventies de spierfunctie verbeteren. Deze methode biedt een volledige evaluatie van de contractiele en passieve eigenschappen van de skeletspier, die twee onafhankelijke aspecten zijn van de mechanische functie van de skeletspier die nodig zijn voor lichaamsbeweging.Daarom is een visuele demonstratie van de spierdissectieprocedure van cruciaal belang omdat het veel vaardigheden en manipulatie vereist. Ook is het grootste voordeel van de NC twee evaluatie van de contractiele eigenschappen van grote spieren ten opzichte van bestaande methoden zoals de in vitro SA, dat deze benadering de normale bloedstroom en oxygenatie niet verstoort. Een belangrijke zorg in de spierfysiologiestudie is de oxygenatie van de doelspier.Bij een in vitro SA voor grote spieren, zoals de TA-spier, kan zuurstofdiffusie mogelijk niet het centrum van de spier bereiken. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot een therapie voor spierziekten omdat de nauwkeurige meting van de mechanische functie van de skeletspier ook kan worden gebruikt om de progressie van spierziekten te evalueren en de therapeutische werkzaamheid van nieuwe gencel- en farmacologische interventies te bepalen. Alle dierprocedures die hier worden gepresenteerd, zijn goedgekeurd door het institutionele dierenverzorgingscomité.Dit is een niet-overlevensoperatie om het spiertestsysteem op te zetten voor de ex vivo-experimenten. Begin met het samenstellen van het weefselbad door de zuurstofbuis te bevestigen aan de watermantel weefselbad. Bevestig het samengestelde bad aan het apparatuur voor het bevestigen van spieren en plaats de naaldklep in de badafvoer.Verbind de gasleiding en de watercirculatieleidingen met het bad. Laat 30 graden Celsius water circuleren in de jaskamer en laat vijf PSI gas door de zuurstofbuis stromen. Vul het bad met ringerbuffer en breng het in evenwicht met een gelijkmatige gasstroom.Schakel de instrumenten in en laad de DMC-software om de EDL-spier te disseceren na anesthesie en het plaatsen van de muis op een verwarmingskussen. Scheer de achterpoot en controleer de sedatie door een teenprik uit te voeren. Plaats de muis op het dissectiebord en verwijder de huid van het been.Gebruik twee naaiknoppen om de achterpoot en de gracilis-spier vast te zetten. Plaats een verwarmingslamp boven de muis om de kernlichaamstemperatuur op 37 graden Celsius te houden en superfuseer continu alle blootgestelde spieren met warme ringerbuffer onder een stereomicroscoop, disseceer de huid om de distale TA-pees en het extensorband te onthullen en verwijder voorzichtig de fascia die de TA-spier bedekt. Snijd het extensorband om de distale TA-pees vrij te maken.Snijd de distale TA-pees door en gebruik deze om de TA-spier te verwijderen met een dun stuk ringerbuffer doordrenkt katoen. Stop het bloeden veroorzaakt door ruptuur van de TA-spiervaten. Vervolgens maakt u met een broodzijde naald een dubbele vierkante knoop gevolgd door een lusknoop op de distale pees van de EDL-spier.Maak vervolgens een incisie in de biceps femoris spier om de proximale pees te onthullen en bind dezelfde set knopen op de proximale pees van de spier. Gebruik dezelfde draad om een dubbele vierkante knoop te maken. Om de hefbomenhaak aan de proximale of distale knoop te bevestigen.Om de EDL-spier voorzichtig uit de achterpoot te disseceren. Snijd eerst de proximale pees boven de knoop en snij de vaten onder de spier door. Snijd vervolgens de distale pees onder de knoop door.Bedek de blootgestelde achterpoot met een stuk ringerbuffer doordrenkt katoen. Bevestig vervolgens de haak aan de hefboom en lijn de spieren verticaal tussen de elektroden uit. Bevestig de distale draad aan de vaste post.Dompel de spier onder in ringerbuffer en pas de rustspanning aan op 1,0 gram. Laat de spier minimaal 10 minuten gelijkmaken. Om de contractiele eigenschappen van de EDL-spier te meten, stelt u de parameters in voor elk van de volgende protocollen in de DMC-software zoals hier gepresenteerd.Voor het eerste protocol stabiliseert u de EDL-spier door deze drie keer te stimuleren met 150 hertz en een 62e rust tussen de stimulaties. Laat voor het tweede protocol de spieren twee minuten ontspannen en bepaal vervolgens de optimale lengte of LN door de EDL-spier bij verschillende rustspanningen te stimuleren. Gebruik de digitale schuifmaat om de optimale spierlengte tussen de distale en proximale knopen te meten.Laat de spier twee minuten ontspannen. Voor protocol drie past u de rustspanning aan op L naught en meet u de spierkracht bij een enkele twitch-stimulatie. Bepaal de Twitch-spanning of pt de tijd tot piekspanning of TPT en de halve ontspanningstijd van de pt.Laat de spier twee minuten ontspannen. Om het vierde protocol uit te voeren, past u de rustspanning aan op LN en meet u de testic spierkracht die bij verschillende stimulatiefrequenties wordt gegenereerd. Meet de P NAUGH waarbij de spierkracht de maximale titanische kracht bereikt.Meet de tijd tot piekspanning en halve ontspanningstijd voor de p naugh. Begin protocol vijf door de spier vijf minuten te laten ontspannen, pas de rustspanning aan op L Naugh en pas 10 cycli van excentrische contracties toe met twee minuten rust tussen de cycli. Bereken het relatieve krachtverlies van de PN na elke cyclus van excentrische contractie.Los tenslotte de EDL-spier los van het apparaat en snijd de pezen bij de hechting. Bepaal het natte spiergewicht en bereken de spierdoorsnede. Om de passieve eigenschappen van de EDL-spier te meten, disseceer de contralaterale EDL-spier en bevestig deze aan het apparaat zoals

evaluation-muscle-function-extensor-digitorum-longus-muscle-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Myo-mechanische analyse van geïsoleerde Skeletal Muscle

We beschrijven een methode om direct te meten spierkracht, spierkracht, contractiele kinetiek en vermoeidheid van geïsoleerde skeletspieren in...

Ex Vivo Beoordeling van contractiliteit, vermoeidheid en alternantie in geïsoleerde skeletspieren

Spierfunctie metingen bijdragen tot de evaluatie van potentiële therapeutische middelen voor spier pathologie, evenals de bepaling van mechanismen fysiologie van dit weefsel. We zullen aantonen de voorbereiding van de m. extensor digitorum longus en het middenrif spieren voor functionele testen. Protocollen voor isometrische en excentrische contracties zal worden getoond, evenals de verschillen in resultaten tussen dystrofische spieren, wat neerkomt op een pathologische toestand, en wildtype...

Isometrische en Excentrische troepenmacht Beoordeling van skeletspieren Geïsoleerd van muizenmodellen van spierdystrofieën

Muscle sensorische neuronen betrokken zijn bij proprioceptor signaleren en rapporteren over metabole toestand en verwondingen gerelateerde gebeurtenissen. We beschrijven een volwassen muis in vitro spier-zenuw voorbereiding op studies over-stretch geactiveerde spieren afferenten.

Een In Vitro Adult Mouse spier-zenuw Voorbereiding voor het bestuderen van de Firing Eigenschappen van Muscle afferenten

We beschrijven een in vivo protocol om dorsiflexie van de voet te meten na stimulatie van de peroneale zenuw en contractie van het anterieure crurale compartiment van de achterpoot van de rat. Dergelijke metingen zijn een onmisbaar translationeel hulpmiddel voor het evalueren van skeletspierpathologie en weefselengineeringbenaderingen voor spierreparatie en -regeneratie.

toepassingen van<em&gt; In Vivo</em&gt; Functioneel testen van de Rat tibialis anterior voor de evaluatie van Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Meting van knaagdier skeletspieren contractiele functie is een nuttig instrument dat kan worden gebruikt voor het bijhouden van de progressie van de ziekte, alsmede de werkzaamheid van de therapeutische interventie. Hier beschrijven we de niet-invasieve, in vivo beoordelingvan de releveurs spieren die na verloop van tijd in de dezelfde muis kan worden herhaald.

Niet-invasieve beoordelingvan releveurs spier functie in muizen

Intacte regulatie van spierglucoseopname is belangrijk voor het behoud van glucosehomeostase van het hele lichaam. Dit protocol presenteert een beoordeling van insuline- en contractie-gestimuleerde glucoseopname in geïsoleerde en geïncubeerde volwassen skeletspieren bij het afbakenen van de impact van verschillende fysiologische interventies op het glucosemetabolisme van het hele lichaam.

Meting van insuline- en contractie-gestimuleerde glucoseopname in geïsoleerde en geïncubeerde volwassen skeletspieren van muizen

Kwantificering van de maximale kracht van de knie-extensor is noodzakelijk om functionele aanpassingen aan veroudering, ziekte, letsel en revalidatie te begrijpen. We presenteren een nieuwe methode om herhaaldelijk in vivo knie-extensie isometrisch piek tetanisch koppel te meten.

In vivo meting van de spierfunctie van de knie-extensor bij muizen

Dit protocol beschrijft een methode voor morfometrische analyse van neuromusculaire juncties door gecombineerde confocale en STED-microscopie die wordt gebruikt om pathologische veranderingen in muismodellen van SMA- en ColQ-gerelateerd CMS te kwantificeren.

Karakterisering van neuromusculaire juncties bij muizen door gecombineerde confocale en superresolutiemicroscopie

Dit artikel beschrijft de methodologie voor het nabootsen van in vivo spierkrachtproductie tijdens ex vivo werklusexperimenten met behulp van een "avatar"-spier van een laboratoriumknaagdier om de bijdragen van spanningstransienten en activering aan het spierkrachtrespons te beoordelen.

"Avatar", een gewijzigd Ex vivo werklusexperiment met In vivo spanning en activering

We beschrijven een protocol om enzymatisch gedissocieerde vezels van verschillende lengtes en typen te verkrijgen uit zes spieren van volwassen muizen: drie daarvan zijn al beschreven (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) en drie van hen zijn voor het eerst met succes gedissocieerd (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Intacte korte, tussenliggende en lange skeletspiervezels verkregen door enzymatische dissociatie van zes achterpootspieren van muizen: voorbij flexor digitorum brevis

Leer de mechanische eigenschappen van muisspieren meten met ex vivo en in situ technieken voor de extensor digitorum longus en tibialis anterior. Deze methode helpt onderzoekers spierziekten en therapeutische interventies evalueren.

Evaluatie van de spierfunctie van de m. extensor digitorum longus

Meer video's verkennen