Met behulp van kwantitatieve real-time PCR voor donorcel Engraftment bepalen in een concurrerende Murine beenmergtransplantatie Model

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van een op PCR gebaseerde techniek om de engraftment van donorcellen te kwantificeren in een competitief muismodel voor beenmergtransplantatie; dit wordt bereikt door eerst beenmergtransplantaties uit te voeren in vrouwelijke recipiëntmuizen met behulp van donorcellen van mannetjes. Vervolgens wordt perifeer bloed verzameld van recipiëntmuizen op verschillende tijdstippen en wordt het genomische DNA geïsoleerd. De monsters worden voorbereid voor een standaardcurve.

Ten slotte wordt real-time PCR uitgevoerd met standaardmonsters en testmonsters. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de transplantatie van cellen afkomstig van mannelijke donoren in de vrouwelijke ontvanger-muizen aantonen, door berekening aan de hand van een standaardcurve met een bekend percentage mannelijk versus vrouwelijk DNA. Het voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals een methode gebaseerd op flowcytometrie, is dat deze gevoeliger is, economischer is en dat monsters gedurende lange tijd bewaard kunnen worden.

Het belangrijkste is dat onze techniek volledig onafhankelijk is van de gebruikte stam en kan worden toegepast op elke genomische achtergrond van muizen, zoals bij goed gedefinieerde celoppervlaktemarkers om de donorcel van de recipientcellen te onderscheiden. Na het euthanaseren van FVB nj, mannelijke donor- en vrouwelijke muizen onder een laminaire flowkap, worden met een klein schaartje en een pincet het dijbeen (femur) en het scheenbeen (tibia) gedissecteerd en geplaatst in een weefkweekschaal van 60 millimeter met zes milliliter ijskoude RPMI 1640 met 5% hitte-geïnactiveerd FBS. Gebruik een Kimwipe om spierweefsel en andere weefsels te verwijderen en snijd beide uiteinden van elke schacht van het bot in de schaal af. Verbind vervolgens het uiteinde van de botten met een naald van 23 gauge, bevestigd aan een spuit van drie cc gevuld met RPMI 1640 met 5% hitte-geïnactiveerd FBS, en spoel het merg eruit.

Gebruik dezelfde naald om het beenmergweefsel te disaggregeren door middel van herhaalde aspiraties. Breng de celsuspensie over naar een centrifugebuis van 15 milliliter en centrifugeer deze vijf minuten bij 400 G. Na het verwijderen van het supernatant worden de cellen geresuspendeerd in één milliliter lysisbuffer voor rode bloedcellen op kamertemperatuur en vijf minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd, waarna vijf tot 10 milliliter RPMI 1640 met 5% hitte-geïnactiveerd FBS wordt toegevoegd; breng de cellen vervolgens door een celzeef en verzamel het filtraat in een nieuwe buis. Na het centrifugeren van de cellen gedurende vijf minuten bij 400 G en het verwijderen van het supernatant, mag de pellet geen rode kleur vertonen, wat duidt op de volledige verwijdering van rode bloedcellen. Resuspendeer de cellen in 10 milliliter RPMI 1640 met 5% hitte-geïnactiveerd FBS en voeg na voorzichtig vortexen een kleine aliquot toe aan een hemocytometer om de cellen te tellen.

Bereken het volume cellen dat nodig is om te mengen met concurrerende vrouwelijke cellen in een verhouding van vijf tot twee voor beenmergtransplantatie. Als laatste stap om de cellen voor injectie voor te bereiden, mengt u de donor- en concurrerende cellen, pelletteert u de cellen, wast u deze met PBS en resuspendeert u ze in PBS tot een uiteindelijke concentratie van 5 × 10⁶ per milliliter donorcellen en 2 × 10⁶ per milliliter voor concurrerende cellen, vier tot zes uur voor de beenmergtransplantatie. Bestraal vrouwelijke recipientmuizen met cesium-137 gammastraling met een enkele dosis van 11 grays.

Plaats de bestraalde vrouwelijke muizen in een muishouder en injecteer de gemengde donor- en competitorcellen via de staartвена in een totaal volume van 0,1 milliliter, zodanig dat elke muis vijf keer 10^5 donorcellen en twee keer 10^5 competitor-beenmergcellen ontvangt voor het afnemen van bloedmonsters. Na het anesthetiseren van de muizen wordt ongeveer 50 microliters bloed verzameld in EDTA-gecoate buisjes via retro-orbitale bloedafname. Verzamel tevens monsters van leeftijd-gematchte mannelijke en vrouwelijke muizen.

Vervolgens wordt genomisch DNA geïsoleerd uit de proefmuizen en muizen. Voeg voor de standaardcurve ongeveer 200 µL RBC-lysebuffer op kamertemperatuur toe aan elk bloedmonster en incubeer dit gedurende vijf minuten. Voeg 1 mL PBS toe en centrifugeer om het grootste deel van de gelyseerde RBC's te verwijderen.

Gebruik vervolgens een bloed-DNA-extractiekit om het DNA te isoleren, waarbij de elutiebuffer vooraf wordt opgewarmd tot 37 °C. Om de opbrengst te optimaliseren, wordt de DNA-concentratie van elk monster gemeten. Monsters met een OD 260/280-verhouding tussen 1,8 en 2,0 worden gebruikt voor verdere analyse.

Om een standaardcurve op te stellen, wordt het DNA van de mannetjes en vrouwtjes verdund tot een concentratie van 4 ng/µL en wordt het DNA-mengsel volgens deze richtlijnen bereid. Stel de PCR-reactieplaat op door Cyber Green Super Mix-reagens te mengen met de hier getoonde primers en genomisch DNA. Elke reactie van 20 µL bevat 400 nM van elke primer en 5 µL genomisch DNA uit bloedcellen, uitgevoerd in triplikaat.

Voer de PCR uit volgens de condities in het tekstprotocol en bepaal de cycle threshold of CT-waarden. Bereken delta CT maal de hoeveelheid CT tot de macht ZY 1 min CT tot de macht BCL 2 en de ZY 1-expressieniveaus of 2 tot de macht minus delta CT; genereer standaardcurves door het gemiddelde van de triplaat 2 tot de macht delta CT-waarden uit te zetten tegen het bekende percentage mannelijk DNA in het mengsel, met een weergegeven lineaire regressieaanpassing. Hier volgen voorbeelden van standaardcurves waarbij de gemiddelde waarden van 2 tot de macht delta CT zijn uitgezet tegen percentages mannelijk DNA.

Deze grafiek bevat een specifieke smelttemperatuur voor BCL2- en ZFY1-ampliconen, gelokaliseerd op respectievelijk 78,5 en 88,5 °C. BCL2 wordt gebruikt als referentiegen om de totale hoeveelheid geladen DNA in elke PCR-reactie te normaliseren. De BCL2-amplificatiecurven voor elk standaardmonster vloeien in elkaar over, onafhankelijk van de concentratie mannelijk DNA, wat duidt op gelijke hoeveelheden geladen DNA.

Echter, de amplificatiecurves van ZFY verschoven naar links bij toenemende hoeveelheden mannelijk DNA in de monster-hematopoëtische stamcellen; van PIM TKO-muizen vertonen defecten bij het reconstitueren van letaal bestraalde muizen, en zoals verwacht hadden recipientmuizen die getransplanteerd waren met PIM TKO-cellen een veel lager percentage mannelijke cellen in vergelijking met muizen die getransplanteerd waren met wild-type cellen. Om onze methode te valideren, hebben we de ingroei van mannelijke donorcellen getest in getransplanteerde vrouwelijke muizen die beenmergcellen ontvingen van wild-type versus PIM triple knockout of TKO-muizen op verschillende tijdstippen na transplantatie; zowel perifeer bloed na zes weken als beenmergmonsters na 16 weken werden geanalyseerd na het bekijken van deze video.

U dient een goede basiskennis te hebben over het gebruik van een PCR-gebaseerde methode om de transplantatie van donorcellen te kwantificeren in een competitief model voor marien beenmergtransplantatie.