Name: Metabole Labeling van Nieuw Transcribed RNA voor hoge resolutie genexpressieprofilering van RNA synthese, verwerking en Decay in Cell Culture (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Leer metabolische labeling van nieuw getranscribeerd RNA met 4-thiouridine voor genexpressieprofilering in eukaryote celculturen. Deze methode verhoogt de gevoeligheid tienfold voor het detecteren van korte-termijn veranderingen in genexpressie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij willen Amie Regan bedanken voor zorgvuldige lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door NGFN Plus subsidie ​​# 01GS0801, MRC fellowship subsidie ​​G1002523 en NHSBT subsidie ​​WP11-05 op LD en DFG subsidie ​​FR2938/1-1 naar CCF

1. Metabole Labeling met 4-thiouridine Maak een gedetailleerd plan van de experimentele opstelling / schema, bijv. bij de 4SU toevoegen aan celkweek en wanneer de monsters te oogsten. Plan ten minste 5 minuten tussen elke conditie. Slechts behandelen cellen van een voorwaarde tegelijk. Handvat max. 3 - 5 gerechten op een gegeven moment. Behandel cellen zo snel mogelijk veranderingen in temperatuur en CO2 te minimaliseren. Vermijd blootstelling van de cellen aan fel licht na 4SU wordt toegevoegd, omdat dit kan leiden tot verknoping van 4SU-gelabelde RNA aan cellulaire eiwitten. Start van etikettering <ol><li> Dooi 4-thiouridine (4SU) vlak voor gebruik en pipet benodigde hoeveelheid 4SU voor elke aandoening in een steriele Falcon buis. </li><li> Neem de benodigde hoeveelheid celcultuurmedium (5 ml per 10 cm schaal) van de borden en voeg aan 4SU bevattende Falcon buis en meng. Verwijder de resterende medium uit de gerechten. </li> &lt;li&gt; Breng 4SU-bevattend medium terug naar de gerechten. </li></ol> Einde van de etikettering <ol start="4"><li> Verwijder celkweekmedium van cellen. Voeg 5 ml Trizol aan elke plaat. Voor complexe experimenten, inclusief verschillende tijdstippen of voorwaarden, wordt deze stap best gedaan door twee mensen, een verwijdering van het medium, de andere het toevoegen Trizol en het oogsten van de lysaat. </li><li> Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur volledige cellysis. </li><li> Gebruik een pipet 10 ml om de plaat af te spoelen met de toegevoegde Trizol. Dit helpt volledige cellysis en sample herstel. Voorzichtig behandelen als Trizol is zeer gevaarlijk bij contact met de huid of ogen! Hebben tegengif voor fenol brandwonden bij de hand (bv. polyethyleen glycol 300 of 400 in industriële spiritus (70:30)). Overdracht monsters polypropyleenbuizen. Houd er rekening mee dat standaard Falcon buizen niet deze hoge g krachten te weerstaan). Monsters kunnen bij -20 ° C gedurende ten minste een maand bewaard tot totale RNA is bereid. </li></ol> 2. RNA Voorbereiding behulp Gewijzigd Trizol Protocol <ol><li> Voeg 1 ml chloroform (0,2 ml per ml Trizol) en schud krachtig gedurende 15 sec. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2-3 minuten. </li><li> Centrifugeer bij 13.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. </li><li> Breng waterige bovenste fase (die het RNA) een nieuwe 15 ml polypropyleen buis. </li><li> Voeg ½ het reactievolume van beide RNA neerslag buffer en isopropanol (bijv. 3 ml supernatant voeg 1,5 ml RNA neerslag buffer en 1,5 ml isopropanol). </li><li> Meng goed. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. </li><li> Centrifugeer bij 13.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Gooi supernatant. </li><li> Kort spin down (5000 g gedurende 30 seconden) en verwijder resterende isopropanol met 200 ul pipet. </li><li> Voeg een gelijk volume van 75% ethanol en schud buis totdat de pellet loskomt. Vermijd breken in vele kleine stukjes als deze kunnen maken verwijdering van residuenl ethanol moeilijk. </li><li> Centrifugeer bij 13.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Gooi supernatant. </li><li> Spin down RNA kort en verwijder resterende ethanol met een 200 ul pipet. Herhaal stap en verwijder de resterende ethanol met een 20 ul pipet. Na deze twee stappen is nadere drogen van de pellet wordt uitgevoerd. </li><li> Voeg 100 ui H2O per 100 ug verwachte RNA opbrengst en meng goed door en neer te pipetteren 5-6 keer om te helpen bij het ​​oplossen van het RNA. </li><li> Oplossen en denatureren RNA door verwarming tot 65 ° C gedurende 10 min (shaker) normaal en plaats op ijs. </li><li> Meet RNA concentratie bij 260 nm met behulp van een NanoDrop spectrofotometer, volgens de instructies van de fabrikant. Dit RNA kan bij -80 ° C gedurende ten minste een maand worden bewaard. </li></ol> 3. Thiol specifieke Biotinylatie van Newly Transcribed RNA <ol><li> Begin met 60 - 80 ug totaal cellulair RNA. </li><li> Vormen etikettering reactie. Pipetteer in de volgendeOm (per ug RNA): <ol class="lalpha"><li> 1 pi 10x Buffer Biotinylering </li><li> 7 pl RNA (met 1 ug RNA verdund in nuclease-vrij H2O) </li><li> 2 ui biotine-HPDP (1 mg / ml DMF) </li></ol></li></ol> Voeg altijd de biotine-HPDP laatste en meng onmiddellijk door pipetteren. In geval precipiteert het biotine, kan DMF inhoud worden verhoogd tot een eindconcentratie van 40%. <ol start="3"><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1,5 uur met rotatie. </li><li> Voeg een gelijk volume chloroform. Meng krachtig. Incubeer gedurende 2-3 minuten totdat de fasen te scheiden en beginnen bellen beginnen te verdwijnen. </li><li> Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Breng de bovenste waterige fase naar een nieuwe buis zorgvuldig. </li><li> Herhaal de stappen 3.4 en 3.5 keer. Misschien wilt u deze stap uit te voeren in 2 ml Phase Lock Gel Zware buizen om het verlies van RNA te verminderen. </li><li> RNA neerslag: voeg 1/10 van het volume 5 M NaCl en een gelijk volumeisopropanol aan de waterfase. </li><li> Centrifugeer bij 20.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Gooi supernatant. </li><li> Voeg een gelijk volume van 75% ethanol, centrifugeer bij 20.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C, gooi supernatant. </li><li> Spin kort en verwijder de resterende ethanol met 200 ul pipet. </li><li> Spin kort en verwijder de resterende ethanol met 20 ul pipet. </li><li> Sta niet toe dat RNA om te drogen. Resuspendeer in 50 - 100 ul H 2 O (~ 1 ui per 1 pg ingang RNA). Meng goed door en neer te pipetteren 5-6 keer. </li><li> Controleer RNA kwaliteit door elektroforetische analyse om RNA degradatie te sluiten. </li></ol> 4. Dot Blot Analyse van 4SU-opname (optioneel) 4SU ​​opname kan gemakkelijk worden bepaald door dot blot analyse van gebiotinyleerd RNA. Dit is een optionele stap die trouble shooting en de schatting van 4SU bijmengingspercentages ten opzichte van een gebiotinyleerd DNA-oligo-controle mogelijk maakt. Voor deze test we recommend met joodacetyl-biotine in plaats van biotine-HPDP voor biotinylering van 4SU-gelabelde RNA in stap 3.2. Dit leidt tot een onomkeerbare biotinylering van 4SU-RNA. Daarom kolom-gebaseerde methoden (bijv. RNeasy) kan worden gebruikt voor het herstel van veel kleinere hoeveelheden gebiotinyleerd RNA (bijvoorbeeld 5 ug). Terwijl RNA gebiotinyleerd met biotine-HPDP is ook geschikt voor deze test, het resulterende signaal zwakker en de signaal-ruis-verhouding ongunstiger (figuur 3). <ol><li> Volg het protocol voor 4SU-etikettering en de isolatie van totaal cellulair RNA, zoals beschreven in de paragrafen 1 en 2. </li><li> Biotinyleren 4SU-gelabelde RNA zoals beschreven in paragraaf 3 vervangen biotine-HPDP met joodacetyl-biotine en voeren twee chloroformextracties aan overmatige joodacetyl-biotine resten volledig te verwijderen. </li><li> Recover gebiotinyleerd RNA door isopropanol / ethanol precipitatie zoals beschreven of met behulp van een kolom-gebaseerde benadering (bijv. RNeasy) bij kleine hoeveelheden RNA (&lt;10 ug) Gebruikt. </li><li> Incubeer de Zeta membraan in nuclease-vrij water met rockende gedurende 10 minuten. </li><li> Neem het membraan uit de nuclease-vrij water en verwijder overmatig vocht door het plaatsen membraan tussen twee schone papieren handdoeken en stevig te drukken. Lucht-drogen van het membraan gedurende 5 min leidt tot mooier dots. </li><li> Voor elk monster bereid 20 pi 200 ng / ul RNA met ijskoud dot blot bindingsbuffer (10 mM NaOH, 1 mM EDTA). Breng 5 ul van deze verdunning (dus 1 ug RNA) en drie verdere 10-voudige verdunningen (bijvoorbeeld 100, 10 en 1 ng RNA respectievelijk) de Zeta membraan door pipetteren. Pipetteren door een leeg rek van pipet tips kunnen worden om gelijkmatig verdeeld afstand bieden. Alternatief, een dot blot apparaat volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Breng 5 ul van de biotine-gelabelde DNA oligo bij concentraties variërend van 20 ng / ul tot 20 pg / pl (ie 100-0,1 ng oligo) als positieve control het membraan door pipetteren. Gebruik een gebiotinyleerd, 4SU-naïeve sample als negatieve controle. </li><li> Lucht-drogen van het membraan gedurende 5 minuten. </li><li> Incubeer het membraan gedurende 30 minuten in 40 ml blokkeringsbuffer met schommelen. </li><li> Incubeer het membraan met 10 ml 1:1000 streptavidine-mierikswortel peroxidase gedurende 15 min. (5 ml PBS + 5 ml 20% SDS + 10 ul streptavidine-mierikswortel peroxidase) </li><li> Was tweemaal membraan in 40 ml PBS + 10% SDS (20 ml PBS + 20 ml 20% SDS) gedurende 5 minuten. </li><li> Was tweemaal membraan in 40 ml PBS + 1% SDS (38 ml PBS + 2 ml 20% SDS) gedurende 5 minuten. </li><li> Was tweemaal membraan in 40 ml PBS + 0,1% SDS (40 ml PBS + 200 ul 20% SDS) gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder overmatig vocht door het plaatsen membraan tussen twee schone papieren handdoeken en drukken op hen stevig. </li><li> Visualiseer membraangebonden HRP met ECL per instructies van de fabrikant. </li><li> Plaats het membraan in plastic folie / zak, verwijdert luchtbellen en incubeer gedurende 2 min in het donker. </li><li> Expose membraan naarfilm voor 1-5 minuten. </li></ol> 5. Scheiding van gelabelde of niet gelabelde RNA Met streptavidine beklede magnetische korrels <ol><li> Heat wasbuffer (3 ml per monster) tot 65 C in een waterbad. </li><li> Bereid verse 100 mM dithiothreitol (DTT) in nuclease-free H 2 O. Doen dat door decanteren 15-30 mg DTT poeder in een schone 50 ml Falcon buis geplaatst op de ultrafijne schaal. Weeg en voeg vereiste hoeveelheid nuclease-vrij H2O </li><li> Heat gebiotinyleerd RNA monsters tot 65 ° C gedurende 10 min denatureren en onmiddellijk plaats op ijs. </li><li> Plaats μMacs kolommen in de magnetische stand. Wij adviseren om niet meer dan 12 monsters tegelijk (6 - 8 monsters zijn optimaal) te verwerken. </li><li> Pre-evenwicht Miltenyi zuilen met 1 ml kamertemperatuur wasbuffer. Dit zal ongeveer 15 minuten duren. </li><li> Ondertussen, voeg 100 ul van streptavidine kralen 50-100 pl gebiotinyleerd RNA. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten met rotatie. </li> &lt;<html> li&gt; Als een van de kolommen heeft ingeleid aftappen inmiddels kan dit worden vergemakkelijkt door voorzichtig drukken op de top van de kolom met een gehandschoende vinger. Zodra de stroom is begonnen met de kolommen goed leeglopen. </li><li> Breng de RNA / beads aan de kolommen. Gooi de doorstroom tenzij je wilt het niet-gemerkte RNA-fractie (zie paragraaf 7) herstellen. </li><li> Was driemaal met 0,9 ml 65 ° C wasbuffer (1 ml pipet tips krimpen bij het pipetteren buffers bij 65 ° C). </li><li> Spoel driemaal met 0,9 ml kamertemperatuur wasbuffer. </li><li> Pipetteer 700 ul Buffer RLT (RNeasy MinElute Cleanup Kit, Qiagen) in nieuwe 2 ml buisjes en leg ze onder de kolommen. </li><li> Elueer het nieuw getranscribeerde RNA in de buffer RLT met toevoeging van 100 ul 100 mM DTT aan de kolommen. </li><li> Voer een tweede elutie ronde 3 min later in hetzelfde buisje toevoegen van een 100 pi 100 mM DTT. </li></ol> 6. Terugwinning van opnieuw opgeschreven RNA nhoud &quot;&gt; Ga verder met de RNeasy MinElute Cleanup (Qiagen) protocol volgens de instructies van de fabrikant. Elute in 25 ul nuclease-free H 2 O. Meet RNA-concentraties met een Nanodrop spectrofotometer. Om de behoefte te ontdooien en opnieuw invriezen RNA voorkomen voordat het indienen aan een high-throughput assay aanbevolen bereiden cDNA direct na de nieuw getranscribeerde RNA gezuiverd. gebruik 2.5 ul van de nieuw getranscribeerde RNA in 20 pi cDNA synthese mix voor cDNA-synthese volgens de instructies van de fabrikant. Voer qRT-PCR controles met 1 : 10 verdunningen van cDNA mengsel WINKEL RNA bij -80 ° C.. 7. Herstel van Ongelabelde, geconsolideerd RNA (optioneel) Indien het ongebonden RNA moet worden hersteld, verzamel en combineren de doorstroming (na toevoeging van het RNA-streptavidineparels oplossing voor de kolommen) en de eerste wasbeurt voor daaropvolgende precipitatie. Gewoonlijk volstaat het om slechts 50% van het ongebonden RNA precipiteren als this zal bevatten&gt; 80% van het uitgangsmateriaal. <ol><li> Voeg een gelijk volume isopropanol (geen zout toegevoegd moet worden als de wasbuffer bevat reeds 1 M NaCl). </li><li> Centrifugeer bij 20.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Gooi supernatant. </li><li> Voeg een gelijk volume van 75% ethanol, centrifugeer bij 20.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C, gooi supernatant. </li><li> Spin kort en verwijder de resterende ethanol met 200 ul pipet. </li><li> Spin kort en verwijder de resterende ethanol met 20 ul pipet. </li><li> Sta niet toe dat RNA om te drogen. Resuspendeer in 100 pi H2O Meng goed door en neer te pipetteren 5-6 keer. Incubeer bij 65 ° C gedurende 10 min onder schudden en rechtstreeks over ijs. </li><li> Controleer RNA kwaliteit door elektroforetische analyse om RNA degradatie te sluiten. </li></ol>

<ol><li>Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+new+world+of+the+genome+with+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exploring the new world of the genome with DNA microarrays.</a> Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).</li>
<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li>
<li>Nagalakshmi, U., Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+landscape+of+the+yeast+genome+defined+by+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing.</a> Science. 320, 1344-1349 (2008).</li>
<li>Wilhelm, B. T., Marguerat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+repertoire+of+a+eukaryotic+transcriptome+surveyed+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic repertoire of a eukaryotic transcriptome surveyed at single-nucleotide resolution.</a> Nature. 453, 1239-U1239 (2008).</li>
<li>Dölken, L., Ruzsics, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+gene+expression+profiling+for+simultaneous+kinetic+parameter+analysis+of+RNA+synthesis+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay.</a> RNA. 14, 1959-1972 (2008).</li>
<li>Yang, E., van Nimwegen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decay+rates+of+human+mRNAs%3A+correlation+with+functional+characteristics+and+sequence+attributes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes.</a> Genome Res. 13, 1863-1872 (2003).</li>
<li>Friedel, C. C., Dölken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+principles+of+mammalian+transcriptional+regulation+revealed+by+RNA+half-life%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life.</a> Nucleic Acids Res. 37, e115(2009).</li>
<li>Nilsen, T. W., Graveley, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+the+eukaryotic+proteome+by+alternative+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing.</a> Nature. 463, 457-463 (2010).</li>
<li>Windhager, L., Bonfert, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+short+and+progressive+4sU-tagging+reveals+key+characteristics+of+RNA+processing+at+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Ultra short and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution.</a> Genome Res. , (2012).</li>
<li>Melvin, W. T., Milne, H. B., Slater, A. A., Allen, H. J., Keir, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+6-thioguanosine+and+4-thiouridine+into+RNA.+Application+to+isolation+of+newly+synthesised+RNA+by+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Incorporation of 6-thioguanosine and 4-thiouridine into RNA. Application to isolation of newly synthesised RNA by affinity chromatography.</a> Eur. J Biochem. 92, 373-379 (1978).</li>
<li>Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthetic+labeling+of+RNA+with+uracil+phosphoribosyltransferase+allows+cell-specific+microarray+analysis+of+mRNA+synthesis+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay.</a> Nature Biotechnology. 23, 232-237 (2005).</li>
<li>Kenzelmann, M., Maertens, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+newly+synthesized+RNA+in+cells+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 6164-6169 (2007).</li>
<li>Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (2011).</li>
<li>Rabani, M., Levin, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+labeling+of+RNA+uncovers+principles+of+RNA+production+and+degradation+dynamics+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. , (2011).</li>
<li>Miller, M. R., Robinson, K. J., Cleary, M. D., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TU-tagging%3A+cell+type-specific+RNA+isolation+from+intact+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">TU-tagging: cell type-specific RNA isolation from intact complex tissues.</a> Nat. Methods. 6, 439-441 (2009).</li>
<li>Miller, C., Schwalb, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+transcriptome+analysis+measures+rates+of+mRNA+synthesis+and+decay+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast.</a> Mol. Syst. Biol. 7, 458(2011).</li>
<li>Weintz, G., Olsen, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phosphoproteome+of+toll-like+receptor-activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">The phosphoproteome of toll-like receptor-activated macrophages.</a> Mol. Syst. Biol. 6, 371(2010).</li>
<li>Lipsett, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+of+4-thiouridylic+acid+from+the+soluble+ribonucleic+acid+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The isolation of 4-thiouridylic acid from the soluble ribonucleic acid of Escherichia coli.</a> Journal of Biological Chemistry. 240, 3975-3978 (1965).</li>
<li>Marcinowski, L., Liedschreiber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+Transcriptional+Profiling+of+Cellular+and+Viral+Gene+Expression+during+Lytic+Cytomegalovirus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Real-time Transcriptional Profiling of Cellular and Viral Gene Expression during Lytic Cytomegalovirus Infection.</a> PLoS Pathog. 8, e1002908(2012).</li>
<li>Chomczynski, P., Mackey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+technical+reports.+Modification+of+the+TRI+reagent+procedure+for+isolation+of+RNA+from+polysaccharide-+and+proteoglycan-rich+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide- and proteoglycan-rich sources.</a> Biotechniques. 19, 942-945 (1995).</li>
<li>Friedel, C. C., Dölken, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+tagging+and+purification+of+nascent+RNA%3A+implications+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics.</a> Mol. Biosyst. 5, 1271-1278 (2009).</li>
<li>Friedel, C. C., Kaufmann, S., Dölken, L., Zimmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HALO+-+A+Java+framework+for+precise+transcript+half-life+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">HALO - A Java framework for precise transcript half-life determination.</a> Bioinformatics. , (2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Metabole etikettering van nieuw getranscribeerde RNA aanzienlijk versterkt de kracht van high-throughput technologieën zoals microarrays en RNA-seq door meer geschikte templates om de biologische vraag van belang aan te pakken. Het huidige protocol werd na optimalisatie. Het maakt&gt; 1000-voudige verrijking van nieuw getranscribeerde RNA en biedt zeer reproduceerbare resultaten. Het experimentele ontwerp van een 4SU-tagging experiment is van cruciaal belang als nieuw getranscribeerde RNA za...

Genexpressie is een belangrijk instrument dat wordt gebruikt om cellulaire processen en de bijbehorende complexe interactie netwerk bestuderen. Studies over mRNA overvloed hebben meestal al de methode van keuze voor fundamentele inzichten te krijgen in de onderliggende moleculaire mechanismen. De ontwikkeling van de hele-transcriptome microarrays 1 en, meer recentelijk, next-generation sequencing van RNA (RNA-seq) 2-4 aangewakkerd deze aanpak. Hoewel deze technologieën ons begrip van de complexiteit van de cellulaire genexpressie hebben een revolutie, waarmee zij worden geconfronteerd grote beperkingen als gevolg van de intrinsieke eigenschappen van hun template monster, dwz totaal cellulair RNA. Eerste, korte-termijn veranderingen in totaal RNA niet overeenkomen veranderingen in transcriptiesnelheden, maar inherent afhankelijk RNA halfwaardetijd van de respectievelijke transcripten. Terwijl een vijfvoudige inductie van een kortstondige transcript, bijv. coderend voor een transcriptiefactor, zal gemakkelijk detecteerbaar in totaal RNAbinnen een uur, dezelfde inductie van een langlevende transcript, bijv. codeert voor een metabolisch enzym, zal vrijwel onzichtbaar blijven. Bovendien, zelfs een complete shut-down (&gt; 1.000-voudig down-regulatie) in de transcriptie snelheid van een gemiddelde gen met een RNA halfwaardetijd van vijf uur zal nemen gewoon vijf uur om zijn totaal RNA niveaus dalen met slechts tweeledig . Daarom analyse van totaal RNA bevordert de detectie van opwaartse regulatie van kortlevende transcripten, waarvan vele coderen voor transcriptiefactoren en genen met regulerende functie 5. Daarnaast wordt de ware kinetische cascade van regulering verduisterd en primaire signalering evenementen kunnen niet worden onderscheiden van de secundaire. Beide zijn beurt kan leiden tot aanzienlijke vertekening in daaropvolgende bioinformatica analyses. Ten tweede, kunnen veranderingen in totaal RNA niveaus niet worden toegeschreven aan veranderingen in RNA synthese of verval. Metingen van de laatste eisen cel invasieve benaderingen, zoals het blokkeren van Transcriptiover het gebruik van actinomycine D 6, en uitgebreide monitoring van lopende RNA verval in de tijd. Met een gemiddelde mRNA halfwaardetijd in zoogdiercellen van 5-10 uur 5,7, wordt mRNA van de meeste genen slechts gedaald met minder dan twee keer na verscheidene uren van transcriptionele arrest. Deze vrij kleine verschillen leiden tot grove onnauwkeurige metingen van mRNA halfwaardetijden van de meeste cellulaire genen als gevolg van de exponentiële aard van de onderliggende wiskundige vergelijkingen. Tenslotte, terwijl de RNA-seq van totaal cellulair RNA bleek dat ongeveer de helft van onze genen kunnen alternatieve splicing gebeurtenissen 8, de onderliggende kinetiek en de dynamische mechanismen leidende weefsel-en context-specifieke regulatie van RNA processing blijven slecht begrepen. Bovendien is de bijdrage van RNA verwerking differentiële genexpressie, in het bijzonder voor niet-coderende RNA&#39;s, nog worden vastgesteld. Al met al, deze beperkingen vormen de belangrijkste obstakels voorbioinformatic kinetische modellering van de onderliggende moleculaire mechanismen. Onlangs hebben we een aanpak ontwikkeld, genaamd hoge resolutie genexpressieprofilering, om deze problemen te overwinnen 5,7,9. Het is gebaseerd op metabolisch merken van nieuw getranscribeerde RNA onder toepassing van 4-thiouridine (4SU-tagging), een natuurlijk voorkomende derivaat uridine en geeft direct toegang tot nieuw getranscribeerde transcripten met minimale tussenkomst in celgroei en genexpressie (zie figuur 1) 5, 10-12. Blootstelling van eukaryote cellen om 4SU resultaten in zijn snelle opname, fosforylering aan 4SU-trifosfaat, en incorporatie in nieuw getranscribeerde RNA. Na isolatie van totaal cellulair RNA, de 4SU-gelabelde RNA fractie thiol-specifiek gebiotinyleerd genereren van een disulfidebinding tussen de biotine en nieuw getranscribeerde RNA. &#39;Totaal cellulair RNA&#39; kan dan kwantitatief worden gescheiden in het label (&#39;nieuw getranscribeerd&#39;) en niet-gemerkte (&#39;pre-existing &#39;) RNA met hoge zuiverheid met streptavidine beklede magnetische korrels. Tenslotte wordt gelabeld RNA gewonnen uit de parels door het toevoegen van een reductiemiddel (bijvoorbeeld dithiothreitol) splitsen van het disulfide binding en het vrijgeven van de nieuw getranscribeerde RNA van de bolletjes. Nieuw getranscribeerd RNA toont de transcriptionele activiteit van elk gen in het tijdsbestek van 4SU blootstelling. 4SU-tagging in de tijdschaal van minuten verschaft dus een momentopname van eukaryote genexpressie en een ideale sjabloon voor downstream-bioinformatica analyses (bv promotor analyse). In gevallen waarin steady-state omstandigheden kan worden aangenomen, de verhoudingen van nieuw getranscribeerd / totaal, opnieuw opgeschreven / ongelabelde en ongelabelde / totaal RNA bieden niet-invasieve en toegang tot nauwkeurige RNA halfwaardetijden 7,13. Bovendien is het belangrijk op te merken dat nieuw getranscribeerde RNA gezuiverd na slechts 5 min 4SU-tagging (5 min 4SU-RNA) jonger dan 15 en 60 min 4SU-RNA.Bij het ​​uitvoeren van zowel de ultra-korte en progressief langere 4SU-tagging in een experimentele setting gecombineerd met RNA-seq, zijn de kinetiek van RNA processing onthuld op nucleotide resolutie 9. Tenslotte tijdsverloop analyses van nieuw getranscribeerd en totaal RNA gecombineerd met computermodellen laten een geïntegreerde analyse van RNA synthese en verval 14. Kortom, deze benadering maakt de directe analyse van de dynamica van RNA-synthese, verwerking en afbraak in eukaryote cellen. Het is in alle belangrijke modelorganismen zoals zoogdieren, insecten (Drosophila), amfibieën (Xenopus), en gist 5,15,16 toepassing. Het is direct compatibel met microarray analyse 5,17, RNA-seq 9,13,14, en is in vivo 12,15 toepassing. Hier hebben we detail de methodologie te labelen, te isoleren en te zuiveren nieuw getranscribeerd RNA in gekweekte zoogdiercellen. Bovendien, potentiometeral problemen en valkuilen worden besproken.

<table><tbody><tr><td>4-thiouridine</td><td>Carbosynth</td><td>T4509</td><td>Bereid een 50 mM stockoplossing in steriel H2O, bewaar bij -20 &deg;C in aliquots van 50-500 &mu;l, gooi ongebruikt reagens weg, bevries niet opnieuw.</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml)</td><td>WAARSCHUWING - CORROSIEF en GEVAARLIJK VOOR DE GEZONDHEID! Zorg voor onmiddellijke toegang tot Fenool antidotum (PEG-Methanol); Bewaar bij 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>372978</td><td>WAARSCHUWING - GEVAARLIJK VOOR DE GEZONDHEID</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitraat, nuclease-vrij</td><td>Sigma</td><td>C8532</td><td>Bereid 1,6 M stockoplossing met nuclease-vrij water.</td></tr><tr><td>5M nuclease-vrij NaCl</td><td>Sigma</td><td>71386</td><td>Stockoplossing</td></tr><tr><td>Nuclease-vrij H2O</td><td>Sigma</td><td>W4502</td><td>Maak 1 ml aliquots in nuclease-vrije buisjes.</td></tr><tr><td>RNA precipitatiebuffer</td><td></td><td></td><td>1,2 M NaCl, 0,8 M natriumcitraat in nuclease-vrij water. Bereid van tevoren onder strikt nuclease-vrije omstandigheden. Bewaar bij kamertemperatuur in 50 ml falconbuisjes.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td>Gebruik met nuclease-vrij water om 80% ethanol te bereiden, bewaar bij -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>1 M nuclease-vrij Tris Cl, pH 7,5</td><td>Lonza</td><td>51237</td><td>Stockoplossing</td></tr><tr><td>500 mM nuclease-vrij EDTA, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td>Stockoplossing</td></tr><tr><td>10x Biotinyleringsbuffer (BB)</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA in nuclease-vrij water, maak 1 ml aliquots.</td></tr><tr><td>Dimethylformamide (DMF)</td><td>Sigma</td><td>D4551</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link biotin-HPDP</td><td>Pierce</td><td>21341</td><td>Bereid een 1 mg/ml stockoplossing door 50 mg biotin-HPDP op te lossen in 50 ml DMF. Zacht verwarmen bevordert solubilisatie. Bewaar bij 4 &deg;C in 1 ml aliquots.</td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Heavy tubes 2,0 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0032 005.152</td><td>Optioneel voor de chloroform extractiestap.</td></tr><tr><td>Zeta membraan</td><td>BIORAD</td><td>162-0153</td><td></td></tr><tr><td>10x Dot blot bindingbuffer</td><td></td><td></td><td>100 mM NaOH, 10 mM EDTA</td></tr><tr><td>Biotin-oligo</td><td></td><td></td><td>5'-biotine, 25 nucleotiden, willekeurige sequentie</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat</td><td>Fisher</td><td>BPE9738</td><td>Voor 100 ml 20% stockoplossing, voeg 20 g SDS toe aan 80 ml PBS pH 7-8 en pas volume aan tot 100 ml. Houd alle hoge percentage SDS oplossingen boven de 20 &deg;C. Verwarm de oplossingen lichtjes als SDS precipiteert.</td></tr><tr><td>EZ-Link Iodoacetyl-LC-Biotin</td><td>Pierce</td><td>21333</td><td>Bereid een 1 mg/ml stockoplossing door 50 mg iodoacetyl-biotin op te lossen in 50 ml DMF. Zacht verwarmen bevordert solubilisatie. Bewaar bij 4 &deg;C in 1 ml aliquots. Genereert onomkeerbare, thiool-specifieke biotinylering.</td></tr><tr><td>Fosfaatbuffer saline</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Dot blot blokkeringsbuffer</td><td></td><td></td><td>Meng 20 ml 20% SDS met 20 ml 1 x PBS pH 7-8 en voeg EDTA toe tot de eindconcentratie van 1 mM.</td></tr><tr><td>Streptavidine-paardenradijs peroxidase </td><td>Vector Laboratories</td><td>SA5004</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C. Meng 10 ml 20% SDS met 10 ml 1 x PBS. Voeg 20 &mu;l Streptavidin-HRP toe voor gebruik. </td></tr><tr><td>ECL reagens</td><td>GE Healthcare</td><td>RNP2109</td><td>Gebruik volgens de instructies van de fabrikant.</td></tr><tr><td>Super RX, X-RA Film, 18x24 cm</td><td>Fujifilm</td><td>47410 19236</td><td></td></tr><tr><td>&mu;Macs Streptavidin Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-074-101</td><td>Bewaar de kralen bij 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Wasbuffer</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,1% Tween 20 in nuclease-vrij H2O.</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>43817</td><td>Bereid als 100 mM DTT in nuclease-vrij H2O, bereid altijd vers voor gebruik.</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Bewaar kolommen bij 4 &deg;C, resterende componenten van de kit bij kamertemperatuur.</td></tr><tr><td>1,5 ml schroefstoppolypropyleenbuisjes</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.005</td><td>Compatibel met Dimethylformamide</td></tr><tr><td>2,0 ml schroefstoppolypropyleenbuisjes</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.005</td><td>Compatibel met Dimethylformamide</td></tr><tr><td>15 ml buisjes</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Compatibel met Dimethylformamide</td></tr><tr><td>50 ml buisjes</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Compatibel met Dimethylformamide</td></tr><tr><td colspan="4">Alle oplossingen/reagens moeten bij kamertemperatuur worden bewaard, tenzij anders gespecificeerd.</td></tr><tr><td colspan="4">Apparatuur </td></tr><tr><td>UV/VIS spectrofotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 1000</td><td>Of equivalent. Gebruik laag volume (1-2 &mu;l) voor metingen van lage RNA concentraties om overmatige monsterverlies te voorkomen.</td></tr><tr><td>Polypropyleen 15 ml centrifugebuisjes</td><td>VWR International</td><td>525-0153</td><td>In tegenstelling tot standaard 15 ml buisjes, tolereren deze tot 15.000 &#215; g</td></tr><tr><td>Hogesnel

metabole labeling van nieuw transcribed rna voor hoge resolutie genexpressieprofilering van rna synthese, verwerking en decay in cell culture

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

De ontwikkeling van de hele-transcriptome microarrays en next-generation sequencing heeft een revolutie ons begrip van de complexiteit van de cellulaire genexpressie. Naast een beter begrip van de moleculaire mechanismen betrokken zijn nauwkeurige metingen van de onderliggende kinetiek steeds belangrijker geworden. Hier, deze krachtige methodieken staan ​​voor grote beperkingen als gevolg van intrinsieke eigenschappen van de sjabloon monsters ze studeren, dwz totaal cellulair RNA. In veel gevallen optreden veranderingen in totaal cellulair RNA ofwel te langzaam of te snel om de onderliggende moleculaire gebeurtenissen en hun kinetiek vertegenwoordigen voldoende resolutie. Daarnaast wordt de bijdrage van veranderingen in RNA synthese, verwerking en verval niet gemakkelijk onderscheiden. We hebben onlangs ontwikkelde hoge-resolutie genexpressieprofilering om deze beperkingen te overwinnen. Er wordt gebruik gemaakt van metabolisch merken van nieuw getranscribeerde RNA met 4-thiouridine (dus ook wel 4SU-tagging) gevolgd door strenge zuivering van nieuw RNA getranscribeerd met thiol-specifieke biotinylering en streptavidine beklede magnetische korrels. Het is toepasbaar op een breed scala aan organismen, waaronder gewervelden, Drosophila en gist. Wij hebben met succes 4SU-tagging toegepast om te studeren real-time kinetiek van transcriptiefactor activiteiten, nauwkeurige metingen van RNA halfwaardetijden, en het verkrijgen van nieuwe inzichten in de kinetiek van RNA processing. Tenslotte kunnen computermodellen worden gebruikt om een ​​geïntegreerde, alomvattende analyse van de onderliggende moleculaire mechanismen te genereren.

1. Uitgangsmateriaal en verwachte rendementen Na 1 uur (hr) van 4SU-exposure nieuw getranscribeerde RNA vertegenwoordigt ongeveer 1-4% van de totale cellulaire RNA. Dit zal lager zijn in de groei-gearresteerd cellen als ze niet langer RNA te synthetiseren om rekening te houden voor de celgroei / replicatie. Bij etikettering voor 1 uur, raden wij het starten van de test met 60 - 80 ug totaal RNA. Beginnend met minder dan 30 ug totaal RNA resulteert in kleine RNA pellets die moeilijk te zien na d...

Totaal cellulair RNA verschaft een slechte template voor het bestuderen korte termijn veranderingen in RNA synthese en verval en de kinetiek van RNA processing. We beschrijven hier metabolisch merken van nieuw getranscribeerde RNA met 4-thiouridine gevolgd door thiol-specifieke biotinylering en zuivering van nieuw getranscribeerde RNA waardoor deze beperkingen te overwinnen.

Metabole Labeling van Nieuw Transcribed RNA voor hoge resolutie genexpressieprofilering van RNA synthese, verwerking en Decay in Cell Culture

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Deze methode is erop gericht om de kinetiek van RNA-synthese, processing en afbraak in eukaryote celculturen direct en nauwkeurig te meten. De cellen worden blootgesteld aan 4-thiouridine om het nieuw getranscribeerde RNA metabolisch te labelen; vervolgens worden de gelabelde cellen gelyseerd en wordt het totale cellulaire RNA gezuiverd. Er wordt een thiol-specifieke biotinylering uitgevoerd om de nieuw getranscribeerde RNA-moleculen selectief te biotinyleren. Daarna worden met streptavidine-gecoate magnetische kralen gebruikt om de met 4-thiouridine gelabelde nieuw getranscribeerde transcripten te scheiden van het reeds aanwezige RNA, resulterend in RNA-fracties die het totale, nieuw getranscribeerde en niet-gelabelde (reeds aanwezige) RNA bevatten.Het RNA kan vervolgens worden onderworpen aan downstream-analyse, waaronder Q-R-T-P-C-R, microarrays of next generation sequencing. In vergelijking met studies naar de analyse van totaal cellulair RNA, biedt de analyse van recent getranscribeerd RNA een ongeveer tienvoudige toename in gevoeligheid voor het detecteren van kortetermijnveranderingen in genexpressie. Bovendien faciliteert het nauwkeurige metingen van RNA-halfwaardetijden en onthult het voor het eerst daadwerkelijk de kinetiek van RNA-processing. Metabole labeling van recent gesynthetiseerde transcripten kan succesvol worden toegepast om de regulerende moleculaire mechanismen van genexpressie te ontleden.Het kan ook worden toegepast op andere modelorganismen zoals ops, oph en gist. Begin met een gedetailleerd plan voor het experiment, waarbij minstens vijf minuten tussen elke conditie wordt gelaten. Ontdooi de vier thio uridine-label vlak voor gebruik en verdeel de benodigde hoeveelheid voor elke conditie over steriele falcon-buisjes.Breng voor elke behandelconditie vijf milliliter van het celkweekmedium van elke 10 centimeter kweekschaal over naar de buis die vier thiopurine bevat en meng dit grondig; aspireer het resterende medium van de culturen. Voeg vervolgens het gelabelde medium terug toe aan de cellen en incubeer gedurende de experimenteel vastgestelde tijd. Voeg na het verwijderen van het celkweekmedium vijf milliliter triol toe aan elke plaat.Incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur voor volledige cellysis. Spoel de plaat voorzichtig met het toegevoegde triol en breng de monsters over in polypropyleenbuisjes die bestand zijn tegen centrifugatie bij 13, 000 G. De monsters kunnen vervolgens worden bewaard bij -20 °C of direct worden gebruikt voor de preparatie van totaal cellulair RNA volgens het triol-protocol. Begin met monsters van 60 tot 80 µg totaal cellulair RNA. Voeg voor de labelingsreactie 1 µL 10 x biotinebuffer toe aan 1 µg RNA verdund in 7 µL nucleasevrij water.Voeg vervolgens twee µL biotin HPDP (1 mg/mL in DMF) toe per 1 µg RNA en meng onmiddellijk door te pipetteren. Als biotin neerslaat, kan het DMF-gehalte worden verhoogd tot een eindconcentratie van 40%. Incubeer de reactie 1,5 uur bij kamertemperatuur onder rotatie.Voeg vervolgens een gelijk volume chloroform toe, meng krachtig en incubeer gedurende twee tot drie minuten tot de fasen beginnen te scheiden en de bellen beginnen te verdwijnen. Centrifugeer de monsters en breng vervolgens voorzichtig de bovenste waterige fase over naar een nieuwe buis. Na een tweede chloroformextractie voegt u één tiende van het volume vijf molar natriumchloride en een gelijk volume isopropanol toe.Om het RNA uit de waterige fase te precipiteren, wordt het RNA door centrifugatie gepellet. Verwijder de supernatant en was het pellet één keer met een gelijk volume 75%ethanol; verwijder na centrifugatie opnieuw de supernatant. Centrifugeer kort en verwijder het resterende ethanol met een 200 microliter pipette.Centrifuge opnieuw en verwijder het resterende ethanol met een 20 µL pipette; resuspendeer het RNA in 50 tot 100 µL water en meng dit goed door te pipetteren. Evalueer de RNA-kwaliteit via elektroforese om RNA-degradatie uit te sluiten.Equilibreer drie milliliters wasbuffer per monster op 65 °C in een waterbad. Denatureer daarnaast de gebiotinyleerde RNA-monsters gedurende 10 minuten bij 65 °C. Plaats ze vervolgens onmiddellijk op ijs.Plaats de Microm Max-kolommen in het magnetische statief. Pre-equilibreer de Milton e-kolommen met één milliliter wasbuffer op kamertemperatuur. Voeg ondertussen 100 µL streptavidinekraaltjes toe aan het gebiotinyleerde RNA en laat dit 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen onder rotatie.Als een van de kolommen niet is begonnen met draineren, druk dan voorzichtig met een gehandschoende vinger op de bovenkant van de kolom. Zodra de stroom begint, draineren de kolommen gemakkelijk. Breng de RNA-beadmengsels aan op de kolommen. Indien het ongelabelde RNA moet worden geanalyseerd, verzamel dan de doorstroom van de ongelabelde RNA-fractie, was vervolgens drie keer met 0,9 milliliters wasbuffer van 65 degrees Celsius, gevolgd door drie keer 0,9 milliliters wasbuffer op omgevingstemperatuur.Pipetteer vervolgens 700 µL buffer RLT in nieuwe buisjes van 2 mL en plaats deze onder de kolommen. Voeg 100 µL vers bereid 100 mM DTT toe aan de kolommen om het nieuw getranscribeerde RNA in de RLT-buffer te elueren. Voeg na drie minuten nogmaals 100 µL 100 mM DTT toe aan de kolom en vang het EENT op in hetzelfde buisje.Zet het RNeasy Mini elution protocol voort zoals beschreven in de instructies van de fabrikant, voeg 25 µL nucleasevrij water toe aan de kolommen en plaats de kolommen in buisjes in een centrifuge. Na een centrifugatieronde van één minuut worden de kolommen uit de buisjes verwijderd en wordt de RNA-concentratie bepaald met een NanoDrop spectrophotometer. Houd er rekening mee dat spectrophotometrische metingen van nieuw getranscribeerd RNA niet erg betrouwbaar zijn en de werkelijke RNA-inhoud hebben de neiging te overschatten.Om te voorkomen dat RNA ontdooid en opnieuw ingevroren moet worden voordat het aan een high-throughput assay wordt onderworpen, raden wij aan om cDNA onmiddellijk na de zuivering van het nieuw getranscribeerde RNA voor te bereiden. Gebruik 2,5 µL van de nieuw getranscribeerde RNA-template in een cDNA-synthesiereactie van 20 µL volgens de instructies van de fabrikant. Verdun de cDNA-monsters 1:10 en analyseer 5 µL van de cDNA-verdunning via Q-R-T-P-C-R.Bewaar de CD NA-monsters bij -80 °C om de minimale 4-SU-concentratie te bepalen die vereist is voor een efficiënte terugwinning van nieuw getranscribeerd RNA. Zuiver het nieuw getranscribeerd RNA na 4-SU-markering met toenemende concentraties 4-SU en analyseer dit via elektroforese. Hierbij nam de terugwinning van nieuw getranscribeerd RNA, gedurende één uur gemarkeerd in primaire menselijke fibroblasten, aanzienlijk toe van 50 naar 200 µM 4-SU, waarna een plateau werd bereikt. Meet alternatief de 4-SU-incorporatie via dot blot-analyse van het gebiotineerde RNA met behulp van een streptavidine-mierikwortelperoxidase-conjugaat.De biotinyleringsefficiëntie van biotinine-HPDP is ongeveer drie keer lager dan die van oto-acetylbiotine. Hierdoor wordt slechts één van de drie of vier su-residuen in nieuw getranscribeerdeRNA wordt feitelijk gebiotinyleerd met biotin HPDP. De signaalintensiteiten kunnen ook worden gekwantificeerd door vergelijking met de gebiotinyleerde controle. Het herstel van DNA-oligos van nieuw getranscribeerd RNA is zeer kwantitatief.Deze gegevens, afkomstig van de Agilent Bioanalyzer, laten zien dat het nieuw getranscribeerde RNA aanzienlijk grotere hoeveelheden grote, niet-gekapte transcripten bevat. Tot slot kunnen de incorporatiesnelheden van vier su in nieuw getranscribeerd RNA zelfs direct worden gekwantificeerd door middel van spectrofotometrische analyse. Hiervoor is het nodig om het nieuw getranscribeerde RNA neer te slaan met glycogeen, isopropanol en ethanol.De extra piek bij 330 nanometer weerspiegelt de incorporatiesnelheid van vier SU in nieuw getranscribeerd RNA. Vergeet niet dat werken met tril uiterst gevaarlijk kan zijn. Daarom moet een tegengif voor fenolbrandwonden, bestaande uit polyethyleenglycol 300 gemengd met industriële methylalcohol in een verhouding van 70 op 30, direct beschikbaar zijn.Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u nieuw getranscribeerd RNA metabolisch kunt labelen en zuiveren, wat in totaal ongeveer acht uur in beslag neemt voor zes tot 12 monsters.

metabolic-labeling-newly-transcribed-rna-for-high-resolution-gene

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een techniek voor de analyse van globale RNA synthese in hypoxie met beeldvorming. Instructies-chemische kenmerken van RNA niet eerder is uitgevoerd onder hypoxie en maakt visualisatie van globale RNA veranderingen op enkele cel. Deze aanpak vormt een aanvulling op de bestaande gemiddelde RNA-technieken, waardoor directe visualisatie van cel-naar-cel veranderingen in de wereldwijde RNA synthese.

Analyse van Global RNA synthese in de Single Cell Level volgende Hypoxie

Ratiometrische bimoleculaire bakens (RBMBs) kan worden gebruikt om het interne gemanipuleerde RNA-transcripten in levende cellen. Hier beschrijven we de bereiding en zuivering van RBMBs, levering van RBMBs in cellen van microporatie en fluorescentie beeldvorming van afzonderlijke RNA transcripten in real-time.

Real-time beeldvorming van Single Engineered RNA-transcripten in levende cellen door gebruik Ratiometrische Bimoleculaire Beacons

Dit manuscript beschrijft een methode voor het labelen van individuele boodschapper-RNA (mRNA) afschriften met fluorescently-geëtiketteerden DNA sondes, voor gebruik in single-molecuul fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) proeven in E. coli. smFISH is een visualisatie methode waarmee de simultane detectie-, lokalisatie- en kwantificering van afzonderlijke mRNA moleculen in vaste afzonderlijke cellen.

Methode voor het labelen van afschriften in individuele Escherichia coli cellen voor Single-molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie experimenten

Dit protocol beschrijft het combinatorische gebruik van ChIP-seq, 4sU-seq en totaal RNA-seq ribosoom profilering voor cellijnen en primaire cellen. Hierdoor wijzigingen bijhouden in transcriptiefactor bindend, DOVO transcriptie, RNA-verwerking, omzet en vertaling na verloop van tijd, en de algemene gang van zaken in geactiveerd en/of snel veranderende cellen weer te geven.

Real-time analyse van transcriptiefactor bindend, transcriptie, vertaling en omzet globale u gebeurtenissen wilt weergeven tijdens de activatie van de cellulaire

We beschrijven een originele transfer-RNA analyse platform genaamd SPOt (gestroomlijnde Platform voor de waarneming van tRNA). Ter plaatse gelijktijdig maatregelen cellulaire niveaus van alle tRNAs in biologische monsters, in slechts drie stappen en in minder dan 24 uur.

Metabole Labeling en profilering van overdracht RNAs met behulp van Macroarrays

Deze methode kan worden gebruikt voor het meten van RNA-synthese. 5-Bromouridine is toegevoegd aan de cellen en opgenomen in gesynthetiseerde RNA. RNA-synthese wordt gemeten door RNA extractie onmiddellijk na de etikettering, gevolgd door 5-Bromouridine-gerichte immunoprecipitation van gelabelde RNA en analyse door omgekeerde transcriptie en kwantitatieve polymerase-kettingreactie.

Onderzoek van RNA-synthese met behulp van de 5-Bromouridine etikettering en Immunoprecipitation

Het protocol hier beschreven is gebaseerd op het genoom-brede kwantificeren van nieuw samengestelde mRNA gezuiverd van gistcellen aangeduid met 4-thiouracil. Deze methode maakt het mogelijk om het meten van de mRNA-synthese rekken van mRNA verval en biedt dus een nauwkeurige meting van RNA polymerase II transcriptie.

Saccharomyces cerevisiae Metabole labelen met 4-thiouracil en de kwantificering van gesynthetiseerd mRNA nieuw als een Proxy voor RNA Polymerase II activiteit

Het gebruik van gethioleerd uracil om gevoelig en specifiek zuivert nieuw Getranscribeerd RNA van de gist Saccharomyces cerevisiae.

Zeer snelle en specifieke metabolische etikettering van RNA in vivo met 4-thiouracil (Ers4tU)

We bieden gedetailleerde methoden om beginnende transcripten metabolisch te labelen en te zuiveren voor transcriptoomanalyse in vroege embryo's van Xenopus met behulp van 5-ethynyl-uridine (5-EU).

Metabole labeling van het ontluikende transcriptoom in de vroege embryogenese van Xenopus

Deze procedure wordt beschreven hoe de primaire hematopoietische celculturen te zetten vanaf knaagdier beenmerg en wordt gevolgd door transfectie met de Gene Puiser MXCell elektroporatie systeem.

De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie

Leer metabolische labeling van nieuw getranscribeerd RNA met 4-thiouridine voor genexpressieprofilering in eukaryote celculturen. Deze methode verhoogt de gevoeligheid tienfold voor het detecteren van korte-termijn veranderingen in genexpressie.

Metabole Labeling van Nieuw Transcribed RNA voor hoge resolutie genexpressieprofilering van RNA synthese, verwerking en Decay in Cell Culture (Video) | JoVE Journal

Metabole Labeling van Nieuw Transcribed RNA voor hoge resolutie genexpressieprofilering van RNA synthese, verwerking en Decay in Cell Culture

Meer video's verkennen