Name: Chromosoom Voorbereiding Van gekweekte cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Leer chromosoomvoorbereiding uit gekweekte cellen voor cytogenetisch onderzoek met G-banding en FISH-technieken. Deze methode ondersteunt betrouwbare karyotypering en moleculaire analyses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Werk in dit manuscript beschreven werd mogelijk gemaakt door financiële steun van de Patrick F. Taylor Stichting.

1. Chromosoom oogsten van hechtende cellen <ol><li> Standaard Protocol <ol><li> Kweek cellen volgens bepaalde cel kweekomstandigheden. Wanneer de cellen logaritmische fase (80% confluentie) bereikt, voeg 10 ul / ml Colcemid de celkweek kolf. Een minimum van 2 x 10 6 cellen wordt aanbevolen. </li><li> Incubeer cellen bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator gedurende 45 minuten. Met behulp van een steriele pipet media uit cellen in een 15 ml conische buis. Zet opzij. </li><li> Voorzichtig wassen van de cellen door toevoeging van 2 ml HBSS buffer in de kolf. Swirl buffer en vervolgens verwijderen met behulp van een pipet. Gooi. </li><li> Voeg 1 ml trypsine, zodat zij het gehele oppervlak van de kolf omvat. Alleen laat de cellen in trypsine gedurende ongeveer 2 minuten. Als de meerderheid van de cellen losgemaakt, pipet de media in de conische buis weer op de cellen. </li><li> Breng de celsuspensie in 10 ml porties in 15 ml conische buizen.Centrifugeer bij 200 xg gedurende 10 minuten. Verwijder supernatant en resuspendeer de pellet. </li><li> Voeg 10 ml 0,075 M KCl die is voorverwarmd tot 37 ° C om de resterende pellet in de conische buis. Vortex buis op de middelste stand te mengen KCl en cellen. </li><li> Incubeer cellen bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten bij 25 ° C. Verwijder de bovenstaande vloeistof (tot ongeveer 0,5 ml resten) en resuspendeer pellet. </li><li> Voeg voorzichtig 5 ml verse Carnoy&#39;s fixatief (3:1 verhouding methanol: ijsazijn) om de cellen tijdens vortexen. Voeg vervolgens 5 ml meer fixeermiddel zonder te vortexen in totaal 10 ml. </li><li> Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant en resuspendeer cellen. Voeg 5 ml fixeermiddel aan elke buis. </li><li> Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant en resuspendeer cellen. Voeg 5 ml fixeermiddel aan elke buis. De cellen kunnen dan op 4 ° C worden bewaard gedurende maximaal een jaar. </li></ol></li><li> Wijziging van Protocol: Chromosome harvesting lymfoblastoïde cellijnen <ol><li> Kweek cellen volgens bepaalde cel kweekomstandigheden. (Gebruik de juiste kolf voor de hoeveelheid cellen wordt gekweekt). Wanneer de cellen logaritmische fase (ongeveer 2 dagen na cellen splitsing) bereikt, voeg 10 ul / ml Colcemid de celkweek kolf. </li></ol></li><li> Wijziging van Protocol: Chromosome oogsten uit volbloed Fytohemagglutinine (PHA), een lectine afkomstig van de rode bonen, is een krachtig mitogeen voor humane T-cellen 16. 72 uur na de toevoeging van PHA aan de cultuur, ongeveer 45% van de cellen in de S-fase. Dit vertegenwoordigt de piek mitotische activiteit en het optimale moment om oogsten voor chromosoom studies. Andere mitogenen zoals karmozijnbes (1-10 ug / ml) kan worden gebruikt bij de analyse van B-cellen 17,18. <ol><li> Vang minimaal 1 ml volbloed in een groene bovenkant natriumheparine buis. Binnen 3 dagen na de inzameling. Store bloed bij RT until klaar voor gebruik. </li><li> Aliquot 0,25 ml bloed in 10 ml compleet RPMI medium met L-glutamine (20% foetaal runderserum, 1% penicilline / streptomycine, 1% fungizone, en 1% PHA). Kweken bij 37 ° C met 5% CO2. </li></ol></li><li> Wijziging van Protocol: Chromosome oogsten uit beenmerg Cytogenetische analyse van beenmerg is nuttig in vele kwaadaardige hematologische aandoeningen zoals de waarneming van een chromosomaal abnormale kloon diagnostisch is voor een specifiek type van leukemie. Chromosoom studies worden ook gebruikt om ziekteprogressie, zoals het begin van blast crisis en respons op behandeling te beoordelen. Aangezien beenmergcellen actief delende, niet mitogeen stimulatie nodig 9,19. Voor acute leukemie zijn ook 24 en 48 uur culturen opgezet. <ol><li> Vang minimaal 1 ml beenmerg in een groene bovenkant natriumheparine buis. Aliquot 0,25 ml beenmerg in 10 ml compleet RPMI medium met L-glutamine (20% foetaal runderserum, 1% penicilline / streptomycine, 1% fungizone). Kweken bij 37 ° C met 5% CO2. </li></ol></li></ol> 2. Slide Voorbereiding en Solid kleuring Een snelle evaluatie van een vertegenwoordiger dia zal informatie over de kwaliteit van de oogst te verstrekken voordat u verder om verdere procedures, zoals G-banding, FISH, CGH, of SKY. Sommige laboratoria de voorkeur aan vaste vlek de cellen voor een snelle oogst en chromosoom assessment. Alternatief kan een fase contrast microscoop gebruikt voor deze analyse. Dia&#39;s zijn het best voorbereid wanneer de luchtvochtigheid is ongeveer 50% en de omgevingstemperatuur (20-25 ° C). <ol><li> Centrifugeer de cellen bij 200 g gedurende 5 minuten bij 25 ° C. Verwijder de bovenstaande vloeistof tot er slechts 0,3-0,5 ml overblijft. </li><li> Na voorzichtig resuspenderen van de pellet, pipet drie druppels celsuspensie op een afstand van ongeveer 2 in op een slede die is gekanteld onder een hoek van ongeveer 45 ° en laat de suspensiete rollen over de glijbaan. Voeg een grote daling van verse Carnoy&#39;s Fixative aan de dia. </li><li> Droog de achterkant van de schuif op een papieren handdoek en dan zitten de schuif om te drogen gedurende minstens 10 minuten. De dia moet volledig droog zijn. </li><li> Bereid verse Giemsa Kleuroplossing (3:1 verhouding van Gurr Buffer en Giemsa Stain). Plaats de dia&#39;s op een kleuring rek. Bedek de hele dia in de Giemsa kleuring oplossing. Laat de dia&#39;s blijven in de kleuroplossing gedurende 5 minuten. Spoel dia&#39;s met gedestilleerd water, laat, en laat aan de lucht drogen. </li><li> 4 druppels Permount en een dekglas aan de dia. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen onder het dekglaasje. De overmaat Permount kunnen worden verwijderd met een papieren handdoek. </li><li> Analyseer cellen met een lichtmicroscoop onder 10X en 100X vergroting. Als de cellen in de metafase zijn er in overvloed en goed gespreid, kunnen de overige dia&#39;s worden gebruikt voor andere experimentele procedures. </li></ol> 3. G-Banding Met behulp van trypsine en Giemsa (GTG) &lt;p&gt; Trypsine is een proteolytisch enzym dat euchromatic histonen in gebieden van DNA denatureert hogere transcriptionele activiteit verkregen. Na Giemsa kleuring, zullen deze regio&#39;s zo licht bands. Zeer gecondenseerd chromatine met weinig of geen transcriptionele activiteit (heterochromatine) een groot deel van de histonen beschermd tegen trypsine en zal dus vlekken donker na Giemsa kleuring. Het is essentieel om aanvankelijk G-band een dia aan de voorwaarden te monitoren en de trypsine timing eventueel voor de volgende dia. <ol><li> Voeg de volgende oplossingen 4 Coplin potten. Jar # 1 = 30 ml 1 x HBSS en 4 ml 10X trypsine (0,5%) Pot # 2 = 50 ml 1x HBSS Jar # 3 = 45 ml 1 x HBSS en 5 ml foetaal runderserum Pot # 4 = 50 ml 1x HBSS </li><li> Dompel elke dia in Jar # 1 voor 5 sec, snelle spoelen in Jar # 2, laat elke dia in Jar # 3 minstens 30 sec, snelle spoelen in Jar # 4 laat vervolgens dia&#39;s te drogen. </li><li> Bereid fresh Giemsa Kleuroplossing (3:1 verhouding van Gurr Buffer en Giemsa Stain). Plaats de dia&#39;s op een kleuring rek. Bedek de hele dia in de Giemsa kleuring oplossing. Laat de dia&#39;s blijven in de kleuroplossing gedurende 5 minuten. </li><li> Spoel dia&#39;s in gedestilleerd water in dezelfde volgorde waarin ze werden gekleurd. Laat de dia drogen gedurende ongeveer 10 minuten. De dia moet volledig droog zijn. </li><li> 4 druppels Permount en een dekglas aan de dia. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen onder het dekglaasje. De overmaat Permount kunnen worden verwijderd met een papieren handdoek. </li><li> Analyseer cellen met een lichtmicroscoop onder 10X en 100X vergroting. Pas trypsine timing van de rest van de dia gebaseerd op de resultaten van de eerste dia. </li></ol>

<ol><li>Driscoll, D., Gross, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+screening+for+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22New+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Prenatal screening for aneuploidy.</a> New Engl. J. Med. 360, 2556-2562 (2009).</li>
<li>Nussbuam, R., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNussbuam%2C+R+%22Genetics+in+Medicine%3A+7th+Edition%22">Genetics in Medicine: 7th Edition</a>. , Saunders/Elsevier. Philadelphia. 76 (2007).</li>
<li>Ljunger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+abnormalities+in+first-trimester+miscarriages%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Obstet.+Gynecol.+Scand%22%5BJournal%5D)">Chromosomal abnormalities in first-trimester miscarriages.</a> Acta Obstet. Gynecol. Scand. 84 (11), 1103-1107 (2005).</li>
<li>Kwinecka-Dmitri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+of+chromosomal+aberrations+in+material+from+abortions%5BTitle%5D)+AND+%22Ginecol.+Pol%22%5BJournal%5D)">Frequency of chromosomal aberrations in material from abortions.</a> Ginecol. Pol. 81 (12), 896-901 (2010).</li>
<li>Reddy, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stillbirth+classification%E2%80%94Developing+an+international+consensus+for+research%3A+Executive+summary+of+a+national+institute+of+child+health+and+human+development+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Obstet.+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Stillbirth classification—Developing an international consensus for research: Executive summary of a national institute of child health and human development workshop.</a> Obstet. Gynecol. 114 (4), 901-914 (2009).</li>
<li>Pierpoint, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+basis+for+congenital+heart+defects%3A+Current+knowledge%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Genetic basis for congenital heart defects: Current knowledge.</a> Circulation. 115 (23), 3015 (2007).</li>
<li>Kaneshiro, N., Zieve, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down+Syndrome%3A+Trisomy+21.%5BTitle%5D)+AND+%22PubMed+Health%22%5BJournal%5D)">Down Syndrome: Trisomy 21.</a> PubMed Health. , (2010).</li>
<li>Cin, P. D. Current Protocols in Human Genetics. , (2003).</li>
<li>Wang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+in+cancer+cytogenetics+and+molecular+cytogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Methodologies in cancer cytogenetics and molecular cytogenetics.</a> Am. J. Med. Genet. 115 (3), 118-124 (2002).</li>
<li>Miura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulated+Chromosomal+Instability+in+Murine+Bone+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells+Leads+to+Malignant+Transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Accumulated Chromosomal Instability in Murine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Leads to Malignant Transformation.</a> Stem Cells. 24 (4), 1095-1103 (2006).</li>
<li>Izadpanah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+In+vitro+Expansion+Alters+the+Biology+of+Adult+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Long-term In vitro Expansion Alters the Biology of Adult Mesenchymal Stem Cells.</a> Cancer Res. 68 (11), 4229-4238 (2008).</li>
<li>Dekel-Naftali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+human+pluripotent+stem+cells+using+CGH+and+FISH+reveals+low-grade+mosaic+aneuploidy+and+a+recurrent+amplification+of+chromosome+1q%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Screening of human pluripotent stem cells using CGH and FISH reveals low-grade mosaic aneuploidy and a recurrent amplification of chromosome 1q.</a> Eur. J. Hum. Genet. 20 (12), 1248-1255 (2012).</li>
<li>Moralli, D., Yusuf, M., Mandegar, M., Khoja, S., Monaco, Z. L., Volpi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Improved+Technique+for+Chromosomal+Analysis+of+Human+ES+and+iPS+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev.+Rep%22%5BJournal%5D)">An Improved Technique for Chromosomal Analysis of Human ES and iPS Cells.</a> Stem Cell Rev. Rep. 7 (2), 471-477 (2011).</li>
<li>Bayani, J., Squire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+banding+of+chromosomes+for+cytogenetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Traditional banding of chromosomes for cytogenetic analysis.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. 22, (2004).</li>
<li>Speicher, M. R., Carter, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+cytogenetics%3A+blurring+the+boundaries+with+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology.</a> Nat. Rev. Genet. 6 (10), 782-792 (2005).</li>
<li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Lymphocyte+Culture+and+Chromosome+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Human Lymphocyte Culture and Chromosome Analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2010).</li>
<li>Muul, L. M., Heine, G., Silvin, C., James, S. P., Candotti, F., Radbruch, A., Worm, M. Measurement of Proliferative Responses of Cultured Lymphocytes, Curr. Protoc. Immunol. , (2011).</li>
<li>Barch, M. J., Knutsen, T., Spurbeck, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarch%2C+MJ+%22The+Association+of+Genetic+Technologists+Cytogenetics+Laboratory+Manual.+San+Francisco%3A+3rd+edition%22">The Association of Genetic Technologists Cytogenetics Laboratory Manual. San Francisco: 3rd edition</a>. , ACT. Houston, TX. (1997).</li>
<li>Dewald, G. W., Ketterling, R. P., Wyatt, W. A., Stupca, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+studies+in+neoplastic+hematologic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22In+Clinical+Laboratory+Medicine%2C+2nd+edition%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic studies in neoplastic hematologic disorders.</a> In Clinical Laboratory Medicine, 2nd edition. McClatchey, K. D. , Williams & Wilkens. Baltimore. 658-685 (2002).</li>
<li>Kibe, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7R%CE%B1+deficiency+in+p53%28null%29+mice+exacerbates+thymocyte+telomere+erosion+and+lymphomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Different%22%5BJournal%5D)">IL-7Rα deficiency in p53(null) mice exacerbates thymocyte telomere erosion and lymphomagenesis.</a> Cell Death Different. 19 (7), 1139-1151 (2012).</li>
<li>Tsien, F., Morava, E., Talarski, A., Marble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+features+of+a+boy+with+trisomy+of+16q22--%3Eqter+due+to+paternal+Y%3B+16+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Dysmorphol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic features of a boy with trisomy of 16q22-->qter due to paternal Y; 16 translocation.</a> Clin. Dysmorphol. 4 (4), 177-181 (2005).</li>
<li>Tsien, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+culture+of+normal+chorionic+villus+cells+yields+ICF+syndrome-like+chromatin+decondensation+and+rearrangements%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet.+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Prolonged culture of normal chorionic villus cells yields ICF syndrome-like chromatin decondensation and rearrangements.</a> Cytogenet. Genome Res. 8 (1), 13-21 (2002).</li>
<li>McGrattan, P., Campbell, S., Cuthbert, R., Jones, F., McMullin, M., Humphreys, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+conventional+cytogenetics+%28G-banding%29%2C+comparative+genomic+hybridization+%28CGH%29+and+interphase+fluorescence+in+situ+hybridization+%28i-FISH%29+for+the+detection+of+genomic+rearrangements+in+acute+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Integration of conventional cytogenetics (G-banding), comparative genomic hybridization (CGH) and interphase fluorescence in situ hybridization (i-FISH) for the detection of genomic rearrangements in acute leukemia.</a> J. Clin. Pathol. 61 (8), 903-908 (2008).</li>
</ol>

Wij hebben de onderhavige procedure chromosoom isolatie van cellen van diverse organismen, waaronder verschillende soorten cellen verkregen uit menselijke, Rhesus makaken, ratten en muizen 11,20-22 gebruikt. Het standaardprotocol is voorzien, maar een aantal belangrijke stappen en variabelen moeten worden aangepast voor deze verschillende soorten cellen. Een aantal specifieke stappen zijn cruciaal in zowel de chromosomale voorbereiding en G-banding om de best mogelijke kwaliteit van de resultaten te garandere...

Chromosoom analyse is een conventionele techniek wereldwijd gebruikt om chromosomale instabiliteit en herschikkingen leiden tot genetische aandoeningen en maligniteit 1,2,8,9 diagnosticeren. Bovendien kan een hogere resolutie voor de diagnose en het onderzoek van constitutionele en kanker verworven genetische afwijkingen worden bereikt met de combinatie van de klassieke cytogenetische procedures en moleculaire cytogenetische methodes zoals fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), vergelijkende genomische hybridisatie (CGH) , en spectrale karyotypering (SKY) 14,15. Recenter zijn deze technieken zijn gebruikt voor het evalueren van chromosomale instabiliteit geassocieerd met stamcellen. Karyotypic afwijkingen zoals aneuploïdie langdurig gekweekte embryonale cellen (ES) en volwassen stamcellen van verschillende organismen zijn gerapporteerd door verschillende laboratoria. Recent bewijs ondersteunt dat sommige cellijnen zijn inherent meer geneigd om chromosoom instabiliteit ongeacht kweekomstandigheden. Om deze reden, bij het opzetten en / of onderhouden van mens, muis, of Rhesus stamcellijnen, wordt chromosoomanalyse aanbevolen als onderdeel van de kwaliteitscontrole. Veel rapporten beschrijven de toenemende belangstelling voor het gebruik van routine en moleculaire cytogenetica de chromosomale stabiliteit van stamcellen en kwaadaardige cellen of verschillende organismen in cultuur 10-13 volgen. Deze protocollen worden steeds vaker gebruikt door niet-genetische laboratoria voor snelle chromosomale beoordeling van hun gekweekte cellen 13. We presenteren onze basisprocedures voor chromosoom bereiding van verschillende celtypes, die kan worden toegepast zowel klinisch als onderzoeksdoeleinden en cellen afkomstig van verschillende organismen.

<table><tbody><tr><td>KaryoMAX Colcemid</td><td>Gibco</td><td>15212-012</td><td></td></tr><tr><td>HBSS Buffer</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Trypsin EDTA 10x</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Buffer Tablets "GURR"</td><td>Gibco</td><td>10580-013</td><td></td></tr><tr><td>Geimsa Stain</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3250-16</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Caledon Laboratory Chemicals</td><td>6700130</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Acetic Acid</td><td>Krackeler Scientific Inc.</td><td>11-9508-05</td><td></td></tr></tbody></table>

chromosoom voorbereiding van gekweekte cellen

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosoom (cytogenetische) analyse wordt veel gebruikt voor de detectie van chromosomale instabiliteit. Als gevolgd door G-banding en moleculaire technieken zoals fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), deze test is de krachtige mogelijkheid om individuele cellen te analyseren voor aberraties die winsten of verliezen van delen van het genoom en herschikkingen waarbij een of meer chromosomen betreffen. Bij de mens, chromosoomafwijkingen treden bij ongeveer 1 per 160 levendgeborenen 1,2, 60-80% van alle miskramen 3,4, 10% van de doodgeborenen 2,5, 13% van de personen met een aangeboren hartaandoening 6, 3-6% van onvruchtbaarheid gevallen 2, en bij veel patiënten met vertraging in de ontwikkeling en geboorteafwijkingen 7. Cytogenetische analyse van maligniteit routinematig gebruikt door onderzoekers en clinici, zoals observaties van klonale chromosomale afwijkingen is aangetoond dat zowel diagnostische en prognostische betekenis 8,9 hebben.60; Chromosoom isolatie is van onschatbare waarde voor gentherapie en stamcelonderzoek van organismen, waaronder niet-humane primaten en knaagdieren 10-13. Chromosomen kunnen worden geïsoleerd uit cellen van levende weefsels, zoals bloed lymfocyten, huidfibroblasten, amniocyten, placenta, beenmerg en tumormonsters. Chromosomen worden geanalyseerd op het metafase van de mitose, wanneer ze het meest gecondenseerd en daardoor beter zichtbaar. De eerste stap van het chromosoom isolatietechniek omvat de verstoring van de spindel vezels door incubatie met Colcemid, te voorkomen dat de cellen te gaan tot de volgende anafase stadium. De cellen worden vervolgens behandeld met een hypotone oplossing en bewaard in de gezwollen toestand met Carnoy fixeermiddel. De cellen worden vervolgens gedropt op slides en kan dan worden gebruikt voor een verscheidenheid aan procedures. G-banding gaat trypsine behandeling, gevolgd door kleuring met Giemsa om karakteristieke lichte en donkere banden te creëren. Dezelfde procedure chromosomen isoleren kan worden gebruikt voor de bereiding van cellen voor procedures zoals fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), vergelijkende genomische hybridisatie (CGH) en spectrale karyotypering (SKY) 14,15.

Hoge kwaliteit metafase spreads zijn essentieel voor chromosoomonderzoek. Een succesvolle test levert chromosomen die goed verspreid en van geschikte chromosoom morfologie. Goed G-gestreepte chromosomen bevatten de karakteristieke lichte en donkere strepen patronen. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50203/50203fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50203/50203fig1.jpg" /> Figuur 1. Een succesvolle chromoso...

Chromosomen kunnen worden geïsoleerd uit levende cellen zoals lymfocyten of huidfibroblasten en organismen, met inbegrip van mensen of muizen. Deze chromosoom preparaten kunnen verder worden gebruikt voor routinematige G-banding en moleculaire cytogenetische procedures zoals fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), vergelijkende genomische hybridisatie (CGH) en spectrale karyotypering (SKY).

Chromosoom Voorbereiding Van gekweekte cellen

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Het algemene doel van deze procedure is het oogsten en prepareren van chromosomen voor GB-banding en moleculaire cytogenetische tests. Cultiveer eerst de cellen tot de logaritmische fase. Oogst vervolgens de chromosomen met smid, een hypotone oplossing en een fixatief.Breng de celsuspensie aan op objectglazen. Kleur één objectglas. Ter controle van de chromosomale preparatie worden de overige objectglazen gebruikt voor GB-banding of moleculaire technieken.Als laatste stap bij de GB-bandering worden de chromosomen geanalyseerd via lichtmicroscopie en karyotypering. Uiteindelijk zullen de chromosomen en kernen beschikbaar zijn voor karyotypering of FISH. Ik heb oorspronkelijk het idee gekregen om deze methode te publiceren vanwege de grote vraag van andere onderzoekers die hulp zochten bij het detecteren van chromosomale instabiliteit in verschillende celtypen van diverse organismen en voor daaropvolgende moleculair cytogenetische testen.Deze techniek is essentieel voor de diagnose en uiteindelijk de prognose van veel aangeboren genetische aandoeningen, waaronder kanker, omdat het de visualisatie mogelijk maakt van chromosoomherschikkingen, welke diagnostisch zijn. Voor deze aandoeningen kan deze methode inzicht bieden in de chromosoomherschikkingen die worden aangetroffen in diverse typen menselijke cellen. Het kan ook worden toegepast op cellen van andere organismen, zoals culturen van Resus Maca, ratten en muizen.2 miljoen adherente cellen tot 80% confluentie en voeg 10 µL van 10 µg/mL toe. Col per milliliter cellen. Incubeer de cellen bij 37 °C in een 5% CO2-incubator gedurende 45 minuten.Breng vervolgens met een steriele pipette het medium uit de kweek over in een conische buis van 15 milliliter en bewaar dit voor later gebruik. Om de cellen te wassen, voegt u twee milliliter HBSS toe aan de kolf, draait u deze rond en verwijdert u de buffer. Voeg daarna één milliliter trypsine toe, waarbij u erop let dat het gehele oppervlak van de kolf bedekt is. Zodra het grootste deel van de cellen is losgelaten, pipetteert u het medium uit de conische buis terug over de cellen. Verdeel aliquots van 10 milliliters van de celsuspensie in 15 milliliter conische buizen. Centrifugeer bij 200 Gs gedurende 10 minuten. Verwijder het supernatant.Resuspendeer het pellet in 10 milliliters 75 millimolars kaliumchloride, dat vooraf is opgewarmd tot 37 °C, na een incubatie van 10 minuten bij 37 °C. Centrifugeer bij 200 ×g gedurende vijf minuten. Verwijder bij 25 °C al het supernatant, behalve 0,5 milliliters, en resuspendeer het pellet voorzichtig.Voeg vijf milliliter verse car noise-fixeeroplossing toe aan de cellen. Voeg vervolgens nog eens vijf milliliter van de fixeeroplossing toe en centrifugeer met een vortex op 200 Gs gedurende vijf minuten. Resuspendeer elke celpellet in vijf milliliter fixeeroplossing.Bewaar de cellen bij vier graden gedurende maximaal één jaar. Centrifugeer de cellen bij 200 Gs gedurende vijf minuten. Bij 25 °C.Verwijder het supernatant totdat er nog slechts 0,3 tot 0,5 milliliters overblijft na het voorzichtig resuspenderen van het pellet. Pipetteer drie druppels van de celсусpensie vanaf een afstand van ongeveer twee inch op een objectglas dat onder een hoek van ongeveer 45 graden is gekanteld, en laat de suspensie over het objectglas vloeien.Voeg één grote druppel verse car noise-fixeerder toe aan het preparaatglas. Dep de achterkant van het glas droog met een papieren handdoek en laat het preparaatglas vervolgens volledig aan de lucht drogen. Bereid verse gim-onderhoudsolution voor.Plaats de objectglazen in een kleurrek. Bedek het gehele objectglas met de gim-onderhoudsoplossing. Spoel de objectglazen na vijf minuten af met gedestilleerd water, laat ze uitlekken en laat ze aan de lucht drogen.Voeg vier druppels perm mount toe aan het objectglas en plaats een dekglas, waarbij u er zorg voor draagt dat er geen luchtbellen onder het dekglas achterblijven. Verwijder het overtollige perm mount met een papieren handdoek. Analyseer de cellen met een lichtmicroscoop bij een vergroting van 10 x en 100 x.Als de metafasecellen overvloedig aanwezig en goed verspreid zijn, kunnen de resterende objectglaasjes voor andere experimentele procedures worden gebruikt. Voeg 50 milliliters van de behandelingsoplossingen toe aan vier Copeland-potten. Dompel elk objectglas vervolgens vijf seconden lang onder in pot nummer één.Spoel het preparaat snel af in pot nummer twee. Laat het minstens 30 seconden in pot nummer drie staan. Spoel af in pot nummer vier en laat de preparaten vervolgens drogen.Bereid verse GIM-onderhoudsoplossing toe. Plaats de objectglazen in een kleurrek. Bedek het gehele objectglas gedurende vijf minuten met de GIM-onderhoudsoplossing.Spoel de objectglazen af met gedestilleerd water in dezelfde volgorde waarin ze zijn gekleurd. Laat ze vervolgens gedurende ten minste 10 minuten drogen. Plaats een dekglas met perm mount, zoals eerder is getoond.Analyse vervolgens de cellen onder een lichtmicroscoop voor de overige slides. Pas de incubatietijd van de tripsine aan op basis van de resultaten van de eerste slide.Een succesvolle analyse resulteert in chromosomen die goed verspreid zijn en een geschikte chromosoommorfologie vertonen. Correct gebandeerde GB-chromosomen bevatten de karakteristieke lichte en donkere bandingspatronen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe chromosomen geoogst moeten worden voor GB-banding en verdere moleculaire cytogenetische testen ter vaststelling van chromosomale instabiliteit.Zodra deze oogsttechniek onder de knie is, kan deze in ongeveer drie uur worden voltooid mits correct uitgevoerd. Voor de GB-bandingsprocedure is het belangrijk om de incubatietijd met tripsine eerst op één objectglas te testen voordat men overgaat naar GB-banding van de overige objectglazen.

chromosome-preparation-from-cultured-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Karyotypering is een eenvoudige en nuttige techniek op grote schaal gebruikt voor het opsporen van genetische veranderingen. Hier beschrijven we een stap voor stap protocol voor het chromosoom verspreiden bereiding van menselijke embryonale stamcellen voor het toezicht op de chromosomale status van deze cellen behouden in cultuur.

Chromosomale Spread Voorbereiding van menselijke embryonale stamcellen voor Karyotypering

Een kwantitatieve methode voor de analyse van chromosoom replicatie timing beschreven. De werkwijze gebruikt BrdU opname in combinatie met...

Chromosoom repliceren Timing In combinatie met TL-<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

DNA herstelmechanismen zijn essentieel om de genomische integriteit en preventie mutatie en kanker. Het doel van dit protocol is om instabiliteit van het genoom te kwantificeren door middel van directe observatie van chromosoomafwijkingen in metafase verspreidt van de muis B-cellen met behulp van fluorescente in situ hybridisatie (FISH) voor telomeer DNA herhalingen.

Snelle analyse van chromosoomafwijkingen in Muis B-lymfocyten door PNA-FISH

De moleculaire mechanismen van de decondensatie van sterk gecompacteerde mitotische chromatine zijn slecht gedefinieerd. We presenteren een celvrije test op basis van mitotische chromatineclusters geïsoleerd uit HeLa-cellen en Xenopus laevis eierextract die het decondensatieproces in vitro getrouw reconstrueert.

Een Cell Gratis Assay om te studeren Chromatine decondensatie aan het eind van Mitosis

Er wordt een protocol beschreven voor de bereiding van hoogwaardige mitotische plantenchromosoomuitstrekkingen door een snelle luchtdroog-druppelmethode die geschikt is voor de FISH-detectie van enkele en hoge kopie-DNA-sondes.

Een Fast Air-droge Dropping Chromosome Bereidingswijze Geschikt voor vissen in planten

Dit protocol beschrijft technieken voor de kwantificatie en karakterisatie van chromosomale afwijkingen in vitro in RAW264.7 muis macrofagen na behandeling met de lucht zwevende deeltjes.

Analyse van de Ambient Particulate Matter-geïnduceerde chromosomale afwijkingen met behulp van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Systeem

Dit is een methode om nieuwe DNA-interactie eiwitten op specifieke doelgroep loci, afhankelijk van de volgorde-specifieke inname van kruisverwijzende chromatine voor latere proteomic analyses identificeren. Geen voorkennis vereist over potentiële bindende proteïnen, noch cel wijzigingen zijn vereist. In eerste instantie ontwikkeld voor gist, is de technologie inmiddels aangepast voor zoogdiercellen.

Aanpassing van hybridisatie inname van chromatine-geassocieerde eiwitten voor Proteomics op zoogdiercellen

Het combineren van DNA-halopreparaten met fluorescentie in situ hybridisatie maakt een analyse met hoge resolutie van genomische interacties met het nucleoskelet mogelijk. Bijgevoegd genoom leidt tot gehybridiseerde fluorescerende signalen die zich in de resterende geëxtraheerde kernen bevinden, terwijl het niet-gehechte genoom zich in de halo van DNA rond de resterende kernen bevindt.

Fluorescentie in situ hybridisatie op DNA-halopreparaten om hele chromosomen, telomeren en genloci te onthullen

Hi-C 3.0 is een verbeterd Hi-C protocol dat formaldehyde en disuccinimidylglutaraat crosslinkers combineert met een cocktail van DpnII en DdeI restrictie enzymen om de signaal-ruisverhouding en de resolutie van chromatine interactie detectie te verhogen.

Chromosoomconformatie vastleggen over lengteschalen

Dit protocol beschrijft de Capture Hi-C-methode die wordt gebruikt om de 3D-organisatie van megagebaseerde gerichte genomische regio's met hoge resolutie te karakteriseren, inclusief grenzen van topologisch associërende domeinen (TAD's) en chromatine-interacties op lange afstand tussen regulerende en andere DNA-sequentie-elementen.

Ontcijferen van 3D-chromatineorganisatie met hoge resolutie via Capture Hi-C

Leer chromosoomvoorbereiding uit gekweekte cellen voor cytogenetisch onderzoek met G-banding en FISH-technieken. Deze methode ondersteunt betrouwbare karyotypering en moleculaire analyses.

Chromosoom Voorbereiding Van gekweekte cellen

Meer video's verkennen