Name: Mitochondriën-geassocieerde ER Membranen (eigen MTM) en glycosfingolipiden Verrijkt microdomeinen (GEM): Isolatie van Mouse Brain (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-04T12:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Leer de isolatie van mitochondriën-geassocieerde ER-membranen (MAMs) en glycosfingolipiden-verrijkte microdomeinen (GEMs) uit muizenhersenen. Deze methode omvat dissectie, homogenisatie en centrifugatie voor zuivere fracties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij erkennen de bijdrage van Renata Sano in het concipiëren van het eerste protocol. Ad&#39;A. houdt de Juweliers For Children (JFC) leerstoel in de genetica en gentherapie. Dit werk werd deels gefinancierd door NIH subsidie ​​GM60905, DK52025 en CA021764, en de Amerikaanse Libanese Syrische Associated Charities (ALSAC).

<html> Het volgende protocol is bedoeld voor de isolatie en zuivering van Mams en parels van muizenhersenen Oplossingen die nodig zijn voor Isolatie van mitochondriën, Mams en GEM Fractionering van ruwe mitochondriale preparaat te verkrijgen: Oplossing A: 0,32 M sucrose, 1 mM NaHCO 3, 1 mM MgCl2, 0,5 mM CaCl2 + proteaseremmers (vers toevoegen indien nodig) Oplossing B: 0,32 M sucrose, 1 mM NaHCO 3 + proteaseremmers (vers toevoegen indien nodig) Eigen MTM Isolatie: Isolatie Medium: 250 mM Mannitol, 5 mM HEPES pH 7,4, 0,5 mM EGTA, 0,1% BSA Gradient Buffer: 225 mM Mannitol, 25 mM HEPES pH 7,5, 1 mM EGTA, 0,1% BSA (eindconcentratie) GEM Isolatie: content &quot;&gt; GEM extractiebuffer: 25 mM HEPES pH 7,5, 0,15 M NaCl, 1% Triton X-100 + proteaseremmers (vers toevoegen indien nodig) GEM oplosbaar Buffer: 50 mM Tris-HCl, pH 8,8, 5 mM EDTA, 1% SDS + proteaseremmers (voeg verse, indien nodig). 1. Eerste stap subcellulaire fractionering: Verwijdering van Kernen, niet-gelyseerde cellen en cellulaire puin <ol><li> Euthanaseren muis in CO 2 kamer. </li><li> Verwijder onmiddellijk hersenen, te halveren, te plaatsen in 2 ml buisjes op ijs en weeg. </li></ol> Opmerking: Bewaar hersenhelften gescheiden gedurende de gehele procedure. Geldt voor de behandeling van een hersenhelft. <ol start="3"><li> Place half hersenen in een voorgekoeld 2 ml glazen Dounce weefsel molen met 1 ml koude oplossing A. gehomogeniseerd met 15 slagen van een totale grote ruimte stamper. </li><li> Naar een 15 ml falcon-buis, op ijs en verdundhomogenaten tot 10 volumes w / v, bijvoorbeeld 0,225 tot 2,25 g ml. </li><li> Centrifugeer monster bij 1400 g gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant overgebracht in een 30 ml rondbodem glazen centrifugebuis, op ijs. Zorg ervoor dat u de pellet te verstoren. </li><li> Resuspendeer de pellet in dezelfde 10 volumedelen oplossing A. Homogeniseer in dezelfde molen, met 3-6 slagen van een kleine speling stamper, 1 ml per keer. </li><li> Naar een vers 15 ml falcon-buis en centrifugeer bij 710 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Dit resulteert in een pellet van kernen en celafval. </li><li> Verwijder voorzichtig het supernatant en het zwembad met de bovenstaande vloeistof opgeslagen in stap 1.6. </li></ol> 2. Tweede stap: Ruwe Mitochondria Isolatie <ol><li> Centrifugeer supernatanten bij 13.800 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Overdracht supernatant aan een Ultra-Clear Beckman Centrifuge Tube, op ijs </li><li> Hersuspendeer pellet in 10 volumes oplossing A. Homogeniseer in dezelfde molen, met 3-6 slagen van een kleine speling stamper, 1 ml per keer. </li><li> Centrifuge als stap 2.1. </li><li> Herhaal de stappen 2,2-2.4. </li><li> De resulterende pellet is een verrijkte mitochondriale fractie. De supernatants (cytosol en ER), dek af met parafilm en blijf op ijs. </li><li> Resuspendeer de pellet met 6 slagen van een kleine speling stamper, in 4,8 ml / g (g wordt verwezen naar de oorspronkelijke hersengewicht) oplossing B, in een nieuwe homogenisator. </li><li> Gebruik van glazen Pasteur pipetten, stelt een discontinue sucrosegradiënt in een Ultra-Clear Beckman centrifugebuis toevoegen vervolgens naar de bodem van de buis als volgt zorgvuldig, zodat er geen bellen gevormd: Resupended Pellet (0,32 M sucrose) 3 ml 850 mM Sucrose (in 1 mM NaHCO 3) 3 ml 1 M Sucrose (in 1 mM NaHCO 3) 3 ml 1,2 M Sucrose (in 1 mM NaHCO3) </li><li> Centrifugeer bij 82.500 xg gedurende 2 uur bij 4 ° C. De resulterende scheiding aan het einde van de gradiënt produceert drie banden en een pellet: 1) myeline en andere membraan verontreinigingen (0,32 M - 0,85 M interface), 2) ER, Golgi, plasmamembranen (0,85 M - 1 M interface); 3) synaptosomen (1 M - 1,2 M interface); 4) mitochondria ruwe (pellet) die wordt gebruikt voor de daaropvolgende zuiveringsstappen </li></ol> 3. Isolatie van mitochondriën-geassocieerde ER membraan, eigen MTM <ol><li> Resuspendeer de vers geïsoleerde ruwe mitochondriën van de ene hersenhelft, in 2 ml isolatiemedium voorzien van vers toegevoegde protease remmers. </li><li> Bereid een 30% Percoll verloop met Gradient Buffer 8 ml per half hersenen, en plaats in een Ultra-Clear Beckman centrifugebuis. </li></ol> * Opmerking: Zorg gradiëntbuffer meer geconcentreerd (1,43 keer) om de juiste uiteindelijke concentratie na d te bereikeniluting Percoll tot 30%. <ol start="3"><li> Layer mitochondriale schorsing op de top van bereide gradiënt LANGZAAM om luchtbelletjes te voorkomen. </li><li> Centrifugeer bij 95.000 xg gedurende 30 min, 4 ° C. </li><li><ol class="lroman"><li> Verwijder de zware fractie (onderste band) eerst met een glazen Pasteur pipet en over te dragen aan een nieuwe ronde bodem glazen buis, op ijs. </li><li> Verwijder de lichte fractie (bovenste band) TWEEDE met een ander glas Pasteur pipet en over te dragen aan een aparte nieuwe ronde bodem glazen buis, op ijs. </li></ol></li><li> Verdun beide fracties in stap 3.5 met 10 ml isolatiemedium en centrifugeer bij 6300 g gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Verwijder het supernatant van de zware fractie verkregen in stap 3.6, resuspendeer de pellet met nog eens 10 ml isolatiemedium en centrifugeer weer als punt 3.6. De resulterende pellet wordt het pure mitochondriale fractie zijn. </li><li> Decanteer het supernatans van het Licht Fractie verkregen in stap 3.6 tot een Ultra-Clear Beckman Centrifuge Tube, op ijs. Gooi de pellet. </li><li> Voeg voldoende isolatiemedium de supernatant verkregen in stap 3.8 de buis en centrifugeer bij 100.000 xg gedurende 1 uur vullen, 4 ° C. De resulterende pellet wordt de eigen MTM fractie zijn. Verwijder voorzichtig en gooi het supernatant. </li></ol> Let op: Bij deze stap, kunt u ook bij 100.000 xg gecentrifugeerd gedurende 1 uur, 4 ° C het supernatant opgeslagen bij stap 2.6. De pellet wordt het ER fractie zijn en de cytosolische fractie supernatant. 4. Extractie van glycosfingolipiden-verrijkt microdomeinen, GEM <ol><li> Lyse pure mitochondria en / of MAM fracties in 500 ul-1 ml extractiebuffer gedurende 20 minuten op ijs. </li><li> Centrifugeer lysaten bij 15.300 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. </li><li> Verzamel supernatanten (Triton X-100 oplosbaar materiaal) en re-centrifuge pelletsgedurende 2 minuten om de nog oplosbaar materiaal. (Triton X-100 geëxtraheerd Mitochondria en / of Triton X-100 geëxtraheerd eigen MTM). </li><li> Oplosbaar pellets in het oplosbaar maken Buffer. Dit oplosbaar materiaal vertegenwoordigt de GEM fracties en kan worden gebruikt voor verdere analyse. </li></ol>

<ol><li>Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organellar+junctions+promote+targeted+Ca2%2B+signaling+in+smooth+muscle%3A+why+two+membranes+are+better+than+one%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one.</a> Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).</li>
<li>Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+rafts+determine+clustering+of+STIM1+in+endoplasmic+reticulum-plasma+membrane+junctions+and+regulation+of+store-operated+Ca2%2B+entry+%28SOCE%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE.</a> J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).</li>
<li>Levine, T., Rabouille, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum%3A+one+continuous+network+compartmentalized+by+extrinsic+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).</li>
<li>Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d'Azzo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM1-ganglioside+accumulation+at+the+mitochondria-associated+ER+membranes+links+ER+stress+to+Ca%282%2B%29-dependent+mitochondrial+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis.</a> Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).</li>
<li>Raturi, A., Simmen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Where+the+endoplasmic+reticulum+and+the+mitochondrion+tie+the+knot%3A+The+mitochondria-associated+membrane+%28MAM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM).</a> Biochim. Biophys. Acta. , (2012).</li>
<li>Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+link+between+the+mitochondrial+network+and+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).</li>
<li>d'Azzo, A., Tessitore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sano+Gangliosides+as+apoptotic+signals+in+ER+stress+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response.</a> Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).</li>
<li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+permeabilization+in+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane permeabilization in cell death.</a> Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).</li>
<li>Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdomains+with+high+Ca2%2B+close+to+IP3-sensitive+channels+that+are+sensed+by+neighboring+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria.</a> Science. 262, 744-747 (1993).</li>
<li>Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylated+TMX+and+calnexin+target+to+the+mitochondria-associated+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane.</a> EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).</li>
<li>Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cholesterol+in+the+association+of+endoplasmic+reticulum+membranes+with+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).</li>
<li>Grimm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ER-mitochondria+interface%3A+the+social+network+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The ER-mitochondria interface: the social network of cell death.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).</li>
<li>Vance, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+synthesis+in+a+membrane+fraction+associated+with+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).</li>
<li>Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria-associated+membranes+and+mitochondria+from+animal+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells.</a> Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).</li>
<li>Pizzo, P., Viola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+lipid+rafts%3A+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte lipid rafts: structure and function.</a> Curr. Opin. Immunol. 15 (3), 255-260 (2003).</li>
</ol>

Geen van de auteurs hebben belangenconflicten te verklaren.

De sites van contact tussen intracellulaire membranen of tussen organellen en het plasmamembraan van cellen vertegenwoordigen dynamische signalering platforms voor basale cellulaire processen. De nauwkeurige karakterisering van hun functie en de samenstelling zowel onder fysiologische en pathologische condities vereist betrouwbare en reproduceerbare zuivering protocollen. De hier beschreven methoden zijn specifiek geoptimaliseerd door ons laboratorium voor de isolatie en zuivering van de Mams en hun overeenkomstige pare...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Materiaal </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> REAGENTIA </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Fractionering </td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> Fisher Scientific </td><td> S5-500 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumbicarbonaat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S-5761 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesium Chloride, Hexahydraat </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> Calcium Chloride, dihydraat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C-5080 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> MAM </td></tr><tr><td> D-mannitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9546-250G </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP310-500 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E4378-250G </td><td></td></tr><tr><td> BSA, fractie V, Heat Shock, gevriesdroogde </td><td> Roche </td><td> 03-116-964-001 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE </td><td> 17-0891-02 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> GEM </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9284-500 ml </td><td></td></tr><tr><td> Natriumchloride </td><td> Fisher Scientific </td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> Roche </td><td> 03-118-142-001 </td><td></td></tr><tr><td> HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144S-500 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> EDTA </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfaat (SDS) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP166-500 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Gemeen </td></tr><tr><td> Protease remmers Tabletten, Complete EDTA-vrij </td><td> Roche </td><td> 11-873-580-001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> APPARATUUR </td></tr><tr><td> 2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders </td><td> Kimble Chase </td><td> 885300-0002 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml polypropyleen Conische centrifugebuizen, BD Falcon </td><td> BD </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 30 ml ronde bodem Glazen centrifugebuizen </td><td> Kimble Chase </td><td> 45.500-30 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml ronde bodem Glas CentriFuge Tubes </td><td> Kimble Chase </td><td> 45.500-15 </td><td></td></tr><tr><td> Ultracentrifuge buizen, Ultra-Clear, dunwandige, 14x89 mm </td><td> Beckman Coulter- </td><td> 344059 </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Cole-Parmer </td><td> PM996 </td><td></td></tr><tr><td> Wegwerp Borosilicaatglas Pasteur pipetten, 9 &quot; </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678 20C- </td><td></td></tr></tbody></table>

mitochondriën-geassocieerde er membranen (eigen mtm) en glycosfingolipiden verrijkt microdomeinen (gem): isolatie van mouse brain

Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain

Intracellulaire organellen zijn zeer dynamische structuren met verschillende vorm en samenstelling, die onderworpen zijn aan celspecifieke intrinsieke en extrinsieke signalen. De membranen zijn vaak naast elkaar op gedefinieerde contact sites die worden hubs voor de uitwisseling van signaalmoleculen en membranen 1,2,3,4. De inter-organellen membraan microdomeinen die gevormd tussen het endoplasmatisch reticulum (ER) en de mitochondriën in de opening van de IP3-gevoelige Ca 2 + kanaal staan ​​bekend als de mitochondria bijbehorende ER-membranen of 4,5,6 eigen MTM. Het eiwit / lipiden en biochemische eigenschappen van deze membraan contactplaatsen zijn uitgebreid bestudeerd met name wat betreft hun rol bij het ​​reguleren van intracellulaire Ca2 + 4,5,6. De ER dient als de primaire opslag van intracellulaire Ca 2 +, en in die hoedanigheid regelt een groot aantal cellulaire processen stroomafwaarts van Ca 2 + signalering, inclUding post-translationele vouwing van eiwitten en eiwit maturation7. Mitochondria, anderzijds, behouden Ca2 + homeostase, door buffering cytosolische Ca2 + concentratie waardoor ze de inleiding van apoptotische routes stroomafwaarts van Ca 2 + 4,8 onbalans. Het dynamische karakter van de eigen MTM maakt ze ideaal sites te ontleden elementaire cellulaire mechanismen, met inbegrip van Ca 2 + signalisatie en regulatie van mitochondriale Ca 2 + concentratie, lipide biosynthese en het transport-, energie-metabolisme en celoverleving 4,9,10,11,12. Verschillende protocollen zijn beschreven voor de zuivering van deze microdomeinen van leverweefsel en gekweekte cellen 13,14. Eerder gepubliceerde werkwijzen waarbij rekening hebben we een aangepast protocol voor de isolatie van mitochondria en eigen MTM van de volwassen muizenhersenen. Deze procedure hebben we een extra zuiveringsstap, namelijk een Triton X100 extractie, dat enables het isolement van de glycosfingolipiden verrijkte microdomain (GEM) fractie van de eigen MTM. Deze preparaten GEM delen verschillende eiwitcomponenten met caveolae en lipide rafts, afkomstig van het plasmamembraan of andere intracellulaire membranen en voorgesteld om als verzamelen punten voor de clustering van receptor eiwitten en eiwit-eiwit interacties 4,15.

Op basis van onze ervaring met het gebruik van dit protocol kunnen we veilig het aanraden voor de isolatie en zuivering van Mams, edelstenen en mitochondriale fracties van hersenen van muizen. De procedure als aangegeven is zeer reproduceerbaar en consistent. In figuur 1 tonen we een representatief beeld van de manier waarop pure mitochondria en eigen MTM laag op een Percoll gradiënt (stap 3.4). Een gedefinieerde, melkachtig band die gezuiverde mitochondria (Mito-P) scheidt onderaan de ultracentrifuge b...

Deze procedure laat zien hoe u te isoleren van de volwassen hersenen van muizen de mitochondriën-geassocieerde ER membranen of Mams en de glycosfingolipiden verrijkte microdomain fracties uit Mams en mitochondriale preparaten.

Mitochondriën-geassocieerde ER Membranen (eigen MTM) en glycosfingolipiden Verrijkt microdomeinen (GEM): Isolatie van Mouse Brain

Intracellular organelles are highly dynamic structures with varying shape and composition, which are subjected to cell-specific intrinsic and extrinsic ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van de mitochondriën, het endoplasmatisch reticulummembraan, microdomeinen of MAMs uit de muizenhersenen. De gezuiverde MAMs worden vervolgens verder geëxtraheerd om de glyco-finger lipiderijke microdomeenfracties of gems te verkrijgen. Dit wordt bereikt door eerst de muizenhersenen te dissekeren, waarna deze in een specifieke buffer worden gehomogeniseerd met een Dounce-homogenisator. Het resulterende homogenaat wordt bij lage snelheid gecentrifugeerd om kernen, ongebroken cellen en celdebris te verwijderen.De tweede stap is het voorbereiden van een ruwe mitochondriale fractie. Door verdere centrifugatie van het supernatant wordt het resulterende pellet geresuspendeerd en verder gescheiden met behulp van een discontinue sucrosegradiënt. Vervolgens wordt de ruwe mitochondriale fractie aangebracht op een Percoll-gradiënt.Na centrifugatie en verschillende wasstappen worden de pure mitochondriale fractie en de MAMs verkregen. De laatste stap is het behandelen van de MAMs met een oplossing die TRITTON X 100 bevat om de glyco finger lipid-verrijkte microdomeinfractie gem te extraheren. Ten slotte wordt de zuiverheid van de fracties gevalideerd via western blot-analyses met behulp van antilichamen tegen eiwitmarkers die kenmerkend zijn voor de verschillende organelfracties.Het belangrijkste voordeel van deze procedure ten opzichte van bestaande methoden is dat deze is aangepast voor de isolatie van mitochondriale MAM- en GEM-fracties uit de hersenen van volwassen muizen met gebruik van een relatief kleine hoeveelheid studiemateriaal. Deze geoptimaliseerde procedure is zeer reproduceerbaar en maakt de isolatie mogelijk van voldoende hoeveelheden van de verschillende organelfracties voor gebruik door onderzoekers, in het bijzonder in het veld van de neurobiologie. Ter analyse van hun eiwitten van belang zal de procedure worden gedemonstreerd door een technicus uit mijn laboratorium.Nadat de hersenen zijn verwijderd uit een met kooldioxide geëuthanaseerde muis, begint u deze procedure door de hersenen door te snijden. Plaats elke helft in een aparte buis van twee milliliter op ijs. Weeg de buizen door een lege, vooraf gekoelde buis van twee milliliter te gebruiken om de balans op nul te stellen en bewaar ze op ijs.Breng de helft van de hersenen over naar een vooraf gekoelde glazen weefselmaler van 2 mL die 1 mL koude fractioneringsoplossing bevat. Homogeniseer met in totaal 15 slagen van een stamper met een grote speling. Plaats het homogenaat in een steriele Falcon-buis van 15 mL op ijs en verdun dit met tot 10 volumes koude fractioneringsoplossing A op basis van het gewicht van het monster.Centrifugeer het monster vervolgens 10 minuten bij 1.400 ×g bij 4 °C. Verwijder voorzichtig de supernatant, waarbij u erop let het pellet niet te verstoren, en breng deze over in een glazen centrifugebuis met ronde bodem van 30 milliliter op ijs. Resuspendeer het pellet vervolgens in 10 volumes van dezelfde fractioneringsoplossing.Homogeniseer het改めて gesuspendeerde pellet in dezelfde vijzel, telkens één milliliter per keer. Gebruik dit keer drie tot zes slagen met een stamper met kleine speling. Breng het homogenaat over in een Falcon-buis van 15 milliliter en centrifugeer 10 minuten bij 710 ×g bij vier °C.Dit resulteert in celkernen en celdebris. Verwijder voorzichtig het supernatant en voeg dit samen met het eerder bewaarde supernatant van de voorgaande centrifugatie. Om te beginnen met de isolatie van mitochondriën, centrifugeert u de supernatants bij 13.800 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Draag het supernatant vervolgens over naar een UltraClear Beckman centrifugebuis op ijs.Resuspendeer de pellets die de mitochondriale fractie bevatten in 10 volumes fractioneringsoplossing A en homogeniseer telkens één milliliter. Gebruik ditmaal drie tot zes slagen van een Pele met een kleine speling, waarbij de homogenaten worden gecombineerd in een nieuwe glazen centrifugebuis met ronde bodem van 30 milliliter op ijs. Zuiver het monster verder door deze stappen nogmaals te herhalen.Centrifugeer het homogenisaat. Neem de S-supernatanten af en homogeniseer het celpellet opnieuw, één milliliter per keer, nadat het is gesuspendeerd in 10 volumes van oplossing A. De volgende stap is om het pellet dat de verrijkte mitochondriale fractie bevat, opnieuw te suspenderen in 4,8 milliliter fractioneringsoplossing B per gram oorspronkelijk hersengewicht; homogeniseer dit met zes slagen van een stamper met kleine tolerantie in een nieuwe homogenisator en bewaar dit homogenisaat op ijs. Bereid vervolgens een discontinue sucrosegradiënt voor in een UltraClear Beckman centrifugebuis.Voeg eerst het resuspendeerde pellet toe, gevolgd door drie milliliter 850 millimolaire sucrose, drie milliliter één molaire sucrose en ten slotte drie milliliter 1,2 molaire sucrose. Zorg ervoor dat de oplossing langzaam vanaf de bodem wordt toegevoegd om te voorkomen dat er bellen ontstaan. Centrifugeer tot slot gedurende twee uur bij 82 500 ×g bij vier graden Celsius.De resulterende scheiding zal drie banden en een pellet opleveren. De pellet bevat de ruwe mitochondriën die zullen worden gebruikt in de daaropvolgende zuiveringsstappen. Resuspendeer de vers geïsoleerde ruwe mitochondriën van één hersenhelft in twee milliliters isolatiemedium.Voeg vervolgens acht milliliter van een 30% per core gradiënt toe aan een schone UltraClear Beckman centrifugebuis. Laag de mitochondriale suspensie zeer langzaam bovenop de voorbereide gradiënt om beluchtingsvorming te voorkomen. Centrifugeer daarna na gradiëntscheiding 30 minuten lang bij 95 000 ×g bij vier graden Celsius.Verwijder eerst de zware fractie, welke de onderste band is, met een glazen pasta-pipet en breng deze over naar een schone glazen kookbuis met ronde bodem. Bewaar de buis op ijs. Verwijder vervolgens de lichte fractie, welke de bovenste band is, met een nieuwe glazen pasta-pipet en breng deze over naar een aparte schone glazen kookbuis met ronde bodem.Plaats deze buis ook op ijs. Verdun beide fracties met 10 milliliters isolatiemedium en centrifugeer bij 6.300 ×g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Verwijder het supernatant van de zware fractie en resuspendeer de pellet met nog eens 10 milliliters isolatiemedium.Centrifugeer het monster opnieuw onder dezelfde omstandigheden. De resulterende pellet is de zuivere mitochondriale fractie. Breng vervolgens het supernatant van de lichte fractie op ijs over naar een UltraClear Beckman centrifugebuis.Het pellet van deze fractie wordt weggegooid omdat het verontreinigende mitochondriën bevat. Voeg voldoende isolatiemedium toe aan het supernatant van de lichte fractie om de buis te vullen en centrifugeer bij 100, 000 ×g gedurende één uur bij vier graden Celsius. Het resulterende pellet zal de met mitochondriën geassocieerde ER-membranen of MAMs bevatten.Verwijder voorzichtig de supernatant en gooi deze weg. Begin de extractie van de glyco finger lipiderijke microdomeinen of gems door de MAM-fractie 20 minuten op ijs te homogeniseren in 500 µL tot 1 mL extractiebuffer. Centrifugeer het lysaat vervolgens 15.300 ×g gedurende twee minuten bij 4 °C.Verzamel het supernatant en centrifugeer het pellet gedurende twee minuten om al het overgebleven Triton X-100-oplosbare materiaal te verwijderen, en resuspendeer vervolgens het pellet met de solubilisatiebuffer. Dit gesolubiliseerde materiaal vertegenwoordigt de GEM-fracties en kan worden gebruikt voor verdere analyse. Er zijn Western blots uitgevoerd om de zuiverheid en distributie van markers voor het endoplasmatisch reticulum, cytosolische eiwitten en mitochondriale markers in de cytosolische fractie te controleren.De fractie van het endoplasmatisch reticulum, de zuivere mitochondriale fractie en de MAMs-fractie. Western blots toonden ook aan dat de gems positief waren voor cavi in one, een marker voor cli, en negatief voor eiwitten van het endoplasmatisch reticulum en de mitochondriën. Aan de andere kant waren de met Triton X 100 geëxtraheerde MAMs positief voor markers van het endoplasmatisch reticulum en de mitochondriën en vertoonden ze weinig cavi in one tijdens het uitvoeren van deze procedure.Het is belangrijk om te onthouden dat er vers gedissecteerd hersenweefsel moet worden gebruikt en dat alle oplossingen, monsters en buizen vervolgens op ijs moeten worden bewaard. Daarnaast wordt aanbevolen om van elke stap van de fractionering een kleine hoeveelheid monster te bewaren, zodat via immunoblotting het algemene succes van de zuiveringsprocedure kan worden bepaald.

mitochondria-associated-er-membranes-mams-glycosphingolipid-enriched

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Het visualiseren en analyseren van mitochondriën uit hersenweefsel van zoogdieren is een uitdagende taak. Hier beschrijven we hoe driedimensionale (3D) reconstructie-analyse van de seriële blok-face scanning elektronenmicroscopie (SBFSEM) kan worden gebruikt om inzicht te krijgen in de morfologische en volumetrische analyse van dit cruciale energieproducerende orgaantje.

Analyse van de Brain Mitochondriën gebruik van Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Hier beschrijven we een werkwijze voor het visualiseren en kwantificeren gevoeligheid een endogene interacties tussen het endoplasmatisch reticulum en mitochondria in gefixeerde cellen. Het protocol is voorzien van een geoptimaliseerde in situ nabijheid ligation assay gericht op de inositol 1,4,5-trifosfaat receptor / glucose-gereguleerd eiwit 75 / voltage-afhankelijke anion kanaal / cyclofiline D-complex aan de mitochondria bijbehorende membraan interface.

Studie van endoplasmatisch reticulum en mitochondriën interacties door<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Ligatie Assay in gefixeerde cellen

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van geheel, intact muis borstklieren om te onderzoeken van de extracellulaire matrix (ECM) expressie en ductaal morfologie. Muis #4 abdominale klieren werden gehaald uit de 8-10 week oude vrouwelijke nullipaar muizen, vast in neutraal gebufferde formaline, gesegmenteerd en gekleurd met behulp van immunohistochemistry voor ECM eiwitten.

Isolatie van Intact, hele muis borstklieren p.a. van extracellulaire Matrix expressie en klier morfologie

We presenteren een protocol voor het bestuderen van de verdeling van mitochondriën en endoplasmisch reticulum in hele cellen na genetische modificatie met behulp van correlatief licht en volume elektronenmicroscopie met inbegrip van ascorbaat peroxidase 2 en mierikswortelperoxidase kleuring, serie snijden van cellen met en zonder het doel gen in dezelfde sectie, en seriële beeldvorming via elektronenmicroscopie.

Mitochondriën en Endoplasmisch reticulum beeldvorming door Correlatief licht en volume elektronenmicroscopie

We bieden een protocol voor isolatie van Microglia uit verschillende ontleed gebieden van een volwassen muis hersen halfrond, gevolgd door semi-geautomatiseerde bibliotheek voorbereiding voor diepe eencellige RNA-sequencing van volledige lengte transcriptomes. Deze methode zal helpen om functionele heterogeniteit van Microglia in gezondheid en ziekte te verhelmaken.

Isolatie van regiospecifieke Microglia van één volwassen muis hersen halfrond voor diepe eencellige RNA-sequencing

We beschrijven een gedetailleerd protocol voor het genereren van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide hersenorganoïden en hun gebruik bij het modelleren van mitochondriale ziekten.

Generatie van organoïden in de menselijke hersenen voor mitochondriale ziektemodellering

We presenteren een tweestappenprotocol voor hoogwaardige mitochondrische isolatie dat compatibel is met eiwitontdekking en kwantificering op proteoomschaal. Ons protocol vereist geen genetische manipulatie en is dus geschikt voor het bestuderen van mitochondriën uit primaire cellen en weefsels.

Tweestaps tagvrije isolatie van mitochondriën voor verbeterde eiwitontdekking en kwantificering

Hier beschrijven we het meten van de axonale transportsnelheid van constitutieve stabilisatoren van mitochondriën-geassocieerde endoplasmatisch reticulum (ER) membranen (MAM's) door de neurotoxische β-amyloïde (Aβ) generatie van neuronen van de ziekte van Alzheimer (AD) in realtime te verhogen of te behouden om te dienen als een directe en kwantitatieve metriek om MAM-stabilisatie te meten en de ontwikkeling van AD-therapieën te ondersteunen.

Kwantitatieve analyse van mitochondriën-geassocieerde endoplasmatisch reticulummembraan (MAM) stabilisatie in een neuraal model van de ziekte van Alzheimer (AD) 

Dit protocol beschrijft een techniek voor de analyse van respiratoire supercomplexen wanneer slechts kleine hoeveelheden monsters beschikbaar zijn.

Isolatie van mitochondriën voor mitochondriale supercomplexanalyse uit kleine weefsel- en celcultuurmonsters 

Er werd een protocol ontwikkeld voor de bereiding van gezuiverde mitochondriën uit microgliacellen, isolatie van mitochondriale eiwitten voor de afgifte van N-glycanen en snelle detectie van subcellulaire, mitochondriale glycanen met behulp van infraroodmatrix-geassisteerde laserdesorptie elektrospray-ionisatie gekoppeld aan nauwkeurige massaspectrometrie met hoge resolutie.

Mitochondriaal preparaat uit microglia voor glycaananalyse

Leer de isolatie van mitochondriën-geassocieerde ER-membranen (MAMs) en glycosfingolipiden-verrijkte microdomeinen (GEMs) uit muizenhersenen. Deze methode omvat dissectie, homogenisatie en centrifugatie voor zuivere fracties.

Mitochondriën-geassocieerde ER Membranen (eigen MTM) en glycosfingolipiden Verrijkt microdomeinen (GEM): Isolatie van Mouse Brain (Video) | JoVE Journal

Mitochondriën-geassocieerde ER Membranen (eigen MTM) en glycosfingolipiden Verrijkt microdomeinen (GEM): Isolatie van Mouse Brain

Meer video's verkennen