Name: Snelle Colorimetrische Testen om kwalitatief onderscheid RNA en DNA in Biomoleculaire Monsters (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-04T09:51:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Leer snelle colorimetrische testen om RNA en DNA te onderscheiden in biomoleculaire monsters met behulp van Benedict-, Bial- en Dische-reacties. Deze methode maakt efficiënte analyse van suikercomponenten mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door de Universiteit van Virginia en de Jeffress Memorial Trust (J-971). Wij danken L. Columbus, K. Jain, en P. Randolph voor nuttige discussies en kritische lezing van het manuscript.

1. Benedictus Test voor reducerende suikers <ol><li> Bereid een hoeveelheid reagens Benedict&#39;s - 940 mM watervrij natriumcarbonaat, 588 mM natriumcitraat dihydraat, 68 mM koper (II) sulfaat pentahydraat. Dit reagens kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur (RT) gedurende ten minste zes maanden geen merkbare reactiviteit. </li><li> De bovenstaande reagens is 6x. Zo 600 pi reacties, 100 pi reagens Benedict om een schone 1,5 ml microcentrifugebuis (bijvoorbeeld Eppendorf merk) per monster worden getest. </li><li> Voeg tussen de 10 pl tot 500 pl monster deze buis de optimale volume kan worden bepaald gebaseerd op de intensiteit van kleurvorming in een eerste proef run. Indien voldoende monster beschikbaar is, begint deze proeven op de maximaal mogelijke monstervolume (dwz vijfzesde van het totale reactievolume 500 pl monster in dit geval) en verdun vervolgens in volgende assays. </li><li> Voeg ddH 2 O aan de tuzijn voor de definitieve volume tot 600 pi, de oplossing te mengen door vortexen of pipetteren. </li><li> Incubeer de monsters gedurende 20 minuten in een kokend waterbad. </li><li> Verwijder de verwarmde monster uit het bad en laat hem bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten afkoelen. </li><li> Centrifugeer het monster buis&gt; 9300 xg (~ 10.000 rpm in een FA45-24-11 Eppendorf vaste hoek rotor) gedurende 5 minuten om sediment elk deeltjesvormig materiaal, deze stap is belangrijker voor kwantitatief, geen kwalitatief studies. </li><li> Aliquot het supernatans van deze buis in een schone cuvet. </li><li> Blanco de UV-VIS spectrofotometer met water. </li><li> Meet de absorptie van deze monster bij 475 nm. </li></ol> 2. Orcinol assay voor microbiële pentosesuikers <ol><li> Bereid een geschikte hoeveelheid reagens verse Bial&#39;s - 24,2 mM orcinol monohydraat (zie figuur 2b de structuur van deze verbinding), 6 M HCl, 0,025% w / v ferrichloride-hexahydraat. Opmerking:Voor langdurige opslag kan de Bial reagens worden bereid als twee afzonderlijke voorraadoplossingen: (i) Reagent A [0,05% w / v FeCl3 • 6H 2 O in geconcentreerd HCl] en (ii) Reagent B [422 mM orcinol monohydraat bereid in 95 % ethanol]. Een reagens kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende zes maanden Reagent B kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende een maand, bedekt met folie om blootstelling aan licht te beperken. Deze voorraadoplossingen worden gemengd in een 15 (A): 1 (B) v / v-verhouding voor gebruik. </li><li> De bovenstaande reagens is 2x. Zo 1,0 ml reacties, voeg 500 pi reagens Bial om een ​​schone 1,5 ml microcentrifugebuisje, per monster worden getest. </li><li> Voeg tussen de 10 pl tot 500 pl monster deze buis. Volgens nota 1,3 (hierboven), indien voldoende monster beschikbaar is, begint het proces reacties met de maximaal mogelijke monstervolume (dwz, de helft van de totale reactievolume 500 pl monster in dit geval) en verdun vanaf daar. </li><li> Voeg ddH 2 O om de buis te brengen de fspronkelijke volume tot 1,0 ml; Meng door vortexen of pipetteren. </li><li> Incubeer de monsters gedurende 20 minuten in een kokend waterbad. </li><li> Verwijder de verwarmde monster uit het bad en laat hem bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten afkoelen. </li><li> Centrifugeer het monster buis&gt; 9300 xg (~ 10.000 rpm in een FA45-24-11 Eppendorf vaste hoek rotor) gedurende 5 minuten om sediment elk deeltjesvormig materiaal, deze stap is belangrijker voor kwantitatief, geen kwalitatief studies. </li><li> Aliquot het supernatant van deze buis een schone cuvet voor visuele inspectie. </li><li> Voor semi-kwantitatieve analyse, de blanco UV-VIS spectrofotometer met water en meet de absorptie van de cuvette monster bij 660 nm. </li></ol> 3. Dische&#39;s Difenylamine Assay voor 2&#39;-deoxypentose Sugars <ol><li> Bereid een hoeveelheid Dische&#39;s difenylamine reagens - 60 mM difenylamine, 11 M ijsazijn, 179 mM zwavelzuur, 62% v / v ethanol. Dit reagens kan voorafvergeleken vooraf opgeslagen bij kamertemperatuur in een donkere container, of bedekt met folie, om blootstelling aan licht te beperken. Vanwege de lichtgevoeligheid reagens niet onbeperkt worden opgeslagen, maar in de praktijk kan worden bereid elke twee tot drie maanden geen duidelijk verschil in reactiviteit. </li><li> De bovenstaande reagens is 2x. Zo 1,0 ml reacties, voeg 500 pi reagens Dische om een ​​schone 1,5 ml microcentrifugebuisje, per monster worden getest. </li><li> Voeg tussen de 10 pl tot 500 pl monster deze buis. Volgens nota 1,3 (hierboven), indien voldoende monster beschikbaar is, begint het proces reacties met de maximaal mogelijke monstervolume (dwz, de helft van de totale reactievolume 500 pl monster in dit geval) en verdun vanaf daar. </li><li> Voeg ddH 2 O de buis om het eindvolume tot 1,0 ml te brengen; Meng door vortexen of pipetteren. </li><li> Incubeer de monsters gedurende 20 minuten in een kokend waterbad. </li><li> Verwijder de verwarmde monster uit het bad en allow aan afkoelen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. </li><li> Centrifugeer het monster buis&gt; 9300 xg (~ 10.000 rpm in een FA45-24-11 Eppendorf vaste hoek rotor) gedurende 5 minuten om sediment elk deeltjesvormig materiaal, deze stap is belangrijker voor kwantitatief, geen kwalitatief studies. </li><li> Aliquot het supernatant van deze buis een schone cuvet voor visuele inspectie. </li><li> Voor semi-kwantitatieve analyse, de blanco UV-VIS spectrofotometer met water en meet de absorptie van de cuvette monster bij 600 nm. </li></ol> 4. Verdere Gebruik Notes <ol><li> De volgende klassen van moleculen zijn geschikt referentieverbindingen voor positieve en negatieve controle reacties voor elke assay: <ul><li> Benedict&#39;s - Positieve = gratis ribose, fructose, glucose, Negatieve = RNA, DNA, ATP, etc. (Elke saccharide ontbreekt een gratis reducerende suiker functionaliteit) </li><li> Bial&#39;s - Positieve = RNA (bijvoorbeeld bakkersgist extract), ribose, ATP, UMP; Negatieve = runderen serum albumine (BSA) of andere eiwitten </li><li> Dische&#39;s - Positieve = DNA (bv. kalf thymus); Negatieve = RNA, ATP, etc. (Niet-2&#39;-nucleotide deoxygenated) </li></ul></li><li> Deze testen zijn gevonden redelijk veerkrachtig verbindingen vaak gebruikt bij eiwitzuivering, bijvoorbeeld, vaak zouten zoals NaCl, (NH4) 2 SO4 en K 2 SO 4 niet verstoren, en de reacties treden gewoonlijk ongevoelig de inhoud van het verdunningsmiddel. Detergenten of chaotropische middelen, zoals ureum kunnen de reactiviteit van de assays als de pH zeer basisch, neutraal tot zure pH is in het algemeen optimaal voor Bial en Dische de assays door de onderliggende reactiechemie (zie de tekst en de protonen in figuur 2b, c). Potentieel suboptimale reactie-omstandigheden, verdachte interfererende, enz. moeten worden getest op een case-by-case basis, met behulp van positieve en negatieve controle-experimenten wet referentieverbindingen. </li></ol>

<ol><li>De Mey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+DNA+and+RNA+quantification+methods+suitable+for+parameter+estimation+in+metabolic+modeling+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of DNA and RNA quantification methods suitable for parameter estimation in metabolic modeling of microorganisms.</a> Anal. Biochem. 353, 198-203 (2006).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+Microvolume+Quantitation+of+Nucleic+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids.</a> J. Vis. Exp. (45), e2565(2010).</li>
<li>Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Short+Protocols+in+Molecular+Biology%3A+A+Compendium+of+Methods+from+Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology</a>. , 4th, Wiley. (1999).</li>
<li>Voet, D., Voet, J. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVoet%2C+D+%22Biochemistry%22">Biochemistry</a>. , 4th, John Wiley & Sons. (2011).</li>
<li>Adams, R. L. P., Knowler, J. T., Leader, D. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAdams%2C+RLP+%22The+Biochemistry+of+the+Nucleic+Acids%22">The Biochemistry of the Nucleic Acids</a>. , 10th, Chapman and Hall. (1986).</li>
<li>Rice, P. A., Correll, C. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRice%2C+PA+%22Protein-nucleic+acid+interactions%3A+Structural+biology%22">Protein-nucleic acid interactions: Structural biology</a>. , RSC Pub. (2008).</li>
<li>Bowman, J. C., Lenz, T. K., Hud, N. V., Williams, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cations+in+charge%3A+Magnesium+ions+in+RNA+folding+and+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cations in charge: Magnesium ions in RNA folding and catalysis.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. , (2012).</li>
<li>Balandina, A., Kamashev, D., Rouviere-Yaniv, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+histone-like+protein+HU+specifically+recognizes+similar+structures+in+all+nucleic+acids.+DNA%2C+RNA%2C+and+their+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The bacterial histone-like protein HU specifically recognizes similar structures in all nucleic acids. DNA, RNA, and their hybrids.</a> J. Biol. Chem. 277, 27622-27628 (1074).</li>
<li>Graslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nat. Methods. 5, 135-146 (2008).</li>
<li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17, 14-20 (2011).</li>
<li>Benedict, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reagent+for+the+detection+of+reducing+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A reagent for the detection of reducing sugars.</a> J. Biol. Chem. 277, e5(1908).</li>
<li>Endo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simultaneous+estimation+method+of+DNA+and+RNA+by+the+orcinol+reaction+and+a+study+on+the+reaction+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A simultaneous estimation method of DNA and RNA by the orcinol reaction and a study on the reaction mechanism.</a> J. Biochem. 67, 629-633 (1970).</li>
<li>Almog, R., Shirey, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+orcinol+test+for+the+specific+determination+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A modified orcinol test for the specific determination of RNA.</a> Anal. Biochem. 91, 130-137 (1978).</li>
<li>Dische, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+color+reactions+for+determination+of+sugars+in+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Biochem.+Anal%22%5BJournal%5D)">New color reactions for determination of sugars in polysaccharides.</a> Methods Biochem. Anal. 2, 313-358 (1955).</li>
<li>Burton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+conditions+and+mechanism+of+the+diphenylamine+reaction+for+the+colorimetric+estimation+of+deoxyribonucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">A study of the conditions and mechanism of the diphenylamine reaction for the colorimetric estimation of deoxyribonucleic acid.</a> Biochemical Journal. 62, 315-323 (1956).</li>
<li>Vogel, J., Luisi, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hfq+and+its+constellation+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Hfq and its constellation of RNA.</a> Nat. Rev. Microbiol. 9, 578-589 (2011).</li>
<li>Deckert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+composition+and+electron+microscopy+structure+of+affinity-purified+human+spliceosomal+B+complexes+isolated+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein composition and electron microscopy structure of affinity-purified human spliceosomal B complexes isolated under physiological conditions.</a> Mol. Cell Biol. 26, 5528-5543 (2006).</li>
<li>Stevens, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+functional+characterization+of+the+yeast+spliceosomal+penta-snRNP%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Composition and functional characterization of the yeast spliceosomal penta-snRNP.</a> Mol. Cell. 9, 31-44 (2002).</li>
<li>Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+protein+assay+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Appl.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Colorimetric protein assay techniques.</a> Biotechnol. Appl. Biochem. 29 (Pt. 2), 99-108 (1999).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidinium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%3A+twenty-something+years+on%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on.</a> Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

<html> De colorimetrische testen hier gepresenteerde bieden een eenvoudige benadering snel de chemische aard van biomoleculaire mengsels, zoals worden aangetroffen bij het zuiveren van eiwitten, RNA&#39;s of complexen van gehele cellysaat in voorbereiding op verdere studies. Als structurele biologie streeft meer native-achtige samenstellingen, geleidelijk grotere uitdagingen, zoals de voorbeelden heterogeniteit, zullen worden als gevolg van de ingewikkelde en multi-component complexen. Supramoleculaire samenstellingen zi...

Veel van celbiologie gebeurt via moleculaire interacties van DNA en RNA. 4 Deze natuurlijk voorkomende nucleïnezuren (NA) met elkaar, 5 eiwitten, 6 en met een groot aantal kleine molecule verbindingen en liganden in vivo (bijvoorbeeld tweewaardige kationen 7). De interacties kan van korte of lange duur (kinetisch), kan variëren van hoog tot matig tot lage affiniteit (thermodynamische sterkte), en kan aanzienlijke variatie vertonen ook in chemische eigenschappen en specificiteit - sommige verenigingen zijn vrij specifiek (bv DNA · · · transcriptiefactoren, RNA · · · splicing factoren), terwijl andere interacties zijn noodzakelijkerwijs veel meer generiek (bv DNA · · · bacteriële histon-achtige HU eiwitten 8). Niet-specifieke interacties met NAS kan praktische gevolgen hebben voor in-vitro-experimenten met mengsels van biomolecules, aangezien het mogelijk en zelfs waarschijnlijk dat sommige NAs zal associëren met biomoleculen plaats, althans onder een deel van de experimentele omstandigheden gebruikt (ionsterkte, pH, enz.). Beschouw bijvoorbeeld de productie van een eiwit van interesse (POI) via heterologe over-expressie van het recombinant eiwit in Escherichia coli celcultuur; dergelijke procedure wordt routinematig uitgevoerd in vrijwel elke structurele biologie lab 9 In voorbereiding op verdere experimenten dergelijke. als biochemische / biofysische karakterisering, kristallisatie, enz. eerste pogingen algemeen gericht op het verkrijgen van een voldoende hoeveelheid van de POI in zo zuiver mogelijke vorm, idealiter als een chemisch homogene en biofysisch monodisperse specimen. Na onderbreking van de gastheercellen, de vroege stadia van een typische zuivering workflow doel de POI isoleren van E. coli eiwitten, nucleïnezuren, celwand puinen andere onderdelen van het cellulaire lysaat. Echter, gastheer NA kan samenwerken zuiveren met de POI voor verschillende fysisch-chemische redenen - een zeer basic POI kan niet-specifiek pull-down gastheer DNA / RNA, de POI kan een generieke NA-bindende activiteit (bijvoorbeeld de eerder genoemde HU); de POI kan een vrij specifieke NA-bindingseiwit maar vertonen kruisreactiviteit met gastheer RNA of DNA zijn; ontvangende NA kan interageren met een chromatografiematrix en daardoor eenvoudig co-elueren met de POI, enzovoort. Willekeurige, hoge affiniteit binden van gastheer NA naar een POI kan vormen een vervelend probleem, omdat de NA onzuiverheden zal waarschijnlijk interfereren met downstream-experimenten (bijv. fluorescentie anisotropie testen van POI • RNA binding 10). U kunt ook onverwachte POI · · · NA verenigingen kunnen ook toevallig worden bekeken, als dergelijke interacties verlichten de POI&#39;s nucleïnezuur-bindend vermogen. Hoe dan ook, of NA zijn belangrijke componenten of verontreinigingen, moet men eerst kwantificeren enidentificeren type (DNA, RNA) van co-zuivering NAs in voorbereiding downstream experimenten. Aantal analysemethoden aanwezig voor het detecteren en kwantificeren NAs in een monster. De meeste beschikbare methoden fundamenteel of spectrofotometrische (bijvoorbeeld A 260 absorptiewaarden en A 260 / A 280 verhoudingen), fluorometrische (bijvoorbeeld binding van thiazool oranje of andere fluorescerende kleurstoffen NA) of colorimetrische (gevoeligheid van nucleosiden om chemische reacties dit rendement chromoforen absorberen in het UV-VIS gebied van het elektromagnetische spectrum), zoals onlangs beschreven door De Mey et al. 1. echter de cruciale stap van het identificeren van het type polynucleotide RNA of DNA valt buiten het bestek van veel van deze kwantificering benaderingen. Hier geven we een reeks colorimetrische testen snel de soorten NA componenten identificeren in een eiwit monster. De protocollen die hier beschreven ceen efficiënt worden uitgevoerd zonder extra stappen van het isoleren mogelijke NA onzuiverheden en afhankelijk assay Benedict voor reducerende suikers 11 de orcinol assay voor pentoses 12,13, 14,15 en difenylamine reacties van 2&#39;-deoxypentoses (figuren 1 en 2) . De Benedict&#39;s test (figuur 2a) gebruikt het vermogen van de lineaire, open keten (aldehyde) vorm van een aldose suiker Cu 2 verlagen +, met gelijktijdige oxidatie van carbonyl de suiker om een carboxylaat groep en productie van Cu 2 O als onoplosbare rood neerslag. Deze reactie positief testen vrije reducerende suikers zoals aldoses en ketoses (die converteren naar de overeenkomstige aldosen via enediol tussenproducten), maar niet met pentose suikers die zijn opgesloten in cyclische vorm als deel van het covalente ruggengraat van een DNA of RNA polynucleotide. Door de minimalistische vereiste van een vrije hemiacetal functionaliteit andere compounds die kunnen positief testen bij deze assay - en dus als potentieel interfererende - onder α-hydroxy-ketonen en korte oligosaccharides (bijvoorbeeld de disaccharide maltose). Zowel de Bial de orcinol (Figuur 2b) en Dische de difenylamine (figuur 2c) reacties zijn gebaseerd op initiële vernietiging van de polynucleotide backbone, via depurinering van de nucleoside en verder zuur of base gekatalyseerde hydrolyse van de ouder nucleotiden aan furan-2 oplevert -carbaldehyde (furfural) derivaten, die derivaten vervolgens reageren met ofwel een polyhydroxy fenol zoals orcinol (Bial&#39;s) of difenylamine (Dische&#39;s) reagentia gekleurde condensatieproducten van veelal onbekende chemische structuur. De DNA versus RNA specificiteit van de assay Dische komt voort uit het feit dat de pentose suiker moet 2&#39;-zuurstofarme om gevoelig voor oxidatie zijn om ω-hydroxylevulinyl aldehyde, die verder reageert met difenylamineonder zure omstandigheden om een heldere blauwe condensaat (2c figuur) op te leveren. Met de gestroomlijnde protocollen beschreven, hebben we gevonden dat deze suiker-specifieke colorimetrische reacties kunnen maken tussen RNA en DNA, en ook de aanwezigheid van vrije reducerende suikers zoals glucose, fructose, ribose of in een biomoleculaire monster.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens of uitrusting </td><td> Leverancier / bedrijf </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties, notities </td></tr><tr><td> Watervrij natriumcarbonaat </td><td> Fisher Scientific </td><td> S263 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumcitraatdihydraat </td><td> Sigma </td><td> S-4641 </td><td></td></tr><tr><td> Koper (II) sulfaat pentahydraat </td><td> VWR </td><td> VW3312-2 </td><td></td></tr><tr><td> Orcinol monohydraat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O1875 </td><td></td></tr><tr><td> Geconcentreerd HCl </td><td> VWR </td><td> BDH3030 </td><td></td></tr><tr><td> Ferrichloride hexahydraat </td><td> Sigma </td><td> F-2877 </td><td></td></tr><tr><td> Difenylamine </td><td> Aldrich </td><td> 112763 </td><td></td></tr><tr><td> IJsazijn </td><td> Fisher Scientific </td><td> A28 </td><td></td></tr><tr><td> Zwavelzuur </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 258105 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Koptec </td><td> V1101 </td><td></td></tr><tr><td> Ribose </td><td> Sigma </td><td> R-7500 </td><td> prep bij 1% w / v in H 2 O </td></tr><tr><td> Ribonucleïnezuur van bakkersgist (S. cerevisiae) </td><td> Sigma </td><td> R6750 </td><td> prep Bij 10 mg / ml in H 2 O, bij -20 ° C </td></tr><tr><td> Desoxyribonucleïnezuur (natriumzout), van kalf thymus </td><td> Sigma </td><td> D1501 </td><td> prep Bij 10 mg / ml in H 2 O; bewaar bij 4 ° C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagentia, apparatuur en Veiligheid Materialen worden vermeld in de following tafel in de volgorde waarin ze in het protocol sectie. Tenzij anders vermeld (hierboven) kunnen alle reagentia worden bewaard bij kamertemperatuur en verlichting. Voor alle items die niet hieronder (bijv. microcentrifugebuisjes), kunnen de gebruikelijke merk / model / variatie gevonden in een standaard biochemische laboratorium worden gebruikt (bijvoorbeeld Eppendorf merk 1,5 ml microfugebuizen). Standaard plastic micro-centrifugebuisjes worden gebruikt gepaard gaat centrifugeren (bijvoorbeeld om sediment deeltjesmateriaal het einde van elk protocol). Geen bijzondere materiaal de voorkeur, zolang de buizen worden afgedicht, de typische polypropyleenbuisjes in biochemie laboratoria werken goed. In termen van bezorgdheid over de veiligheid en afvalverwerking, dient de standaard laboratorium voorzorgsmaatregelen (veiligheidsbril, zuurkasten) worden uitgeoefend in het voorbereiden, het werken met en voor de verwijdering van de oplossingen die geconcentreerd azijnzuur, zoutzuur of zwavelzuur. Voor organische reagentia zoals orcinol of diphenylamine, nitril handschoenen zijn te verkiezen boven de gemeenschappelijke latex (natuurrubber) variëteit. </td></tr></tbody></table>

snelle colorimetrische testen om kwalitatief onderscheid rna en dna in biomoleculaire monsters

Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples

Biochemische experimenten vereist doorgaans nauwkeurige kennis in een vroeg stadium van het nucleïnezuur, eiwit en andere biomoleculaire componenten mogelijk heterogene monsters. Nucleïnezuren kan worden gedetecteerd via verscheidene erkende benaderingen, waaronder analysemethoden die spectrofotometrische (bijvoorbeeld A 260), fluorometrische (bijvoorbeeld binding van fluorescerende kleurstoffen) of colorimetrische (nucleoside-specifieke chromogene chemische reacties). Een Hoewel het niet gemakkelijk onderscheiden RNA uit DNA, de A 260 / A 280 verhouding wordt meestal gebruikt, omdat het een eenvoudige en snelle 2 evaluatie van de relatieve gehalte aan nucleïnezuur dat voornamelijk absorbeert nabij 260 nm en eiwitten, die absorbeert vooral nabij 280 nm. Ratio &lt;0,8 worden als indicatie &#39;pure&#39; eiwit specimens, terwijl zuivere nucleïnezuur (NA) wordt gekenmerkt door verhoudingen&gt; 1,5 3. However zijn er nog gevallen waarin het eiwit / NA inhoud kan niet zo duidelijk of betrouwbaar afgeleid van eenvoudige UV-VIS spectrofotometrische metingen. Bijvoorbeeld (i) monsters kunnen een of meer eiwitten die relatief vrij van de aromatische aminozuren die verantwoordelijk zijn voor absorptie bij ≈ 280 nm (Trp, Tyr, Phe), zoals het geval is met enkele kleine RNA-bindende eiwitten en (ii) monsters vertonen tussenproduct A 260 / A 280 verhoudingen (~ 0.8 &lt;~ 1.5), waarbij het ​​eiwit / NA inhoud veel minder duidelijk en zelfs tijdens een hoge affiniteit associatie tussen het eiwit en NA componenten. Voor dergelijke situaties beschrijven we hierin een reeks colorimetrische testen snel onderscheiden RNA, DNA en reducerende suikers in een potentieel mengmonster van biomoleculen. De methoden steunen op het verschil in gevoeligheid van pentosen en andere koolhydraten Benedictus, Bial&#39;s (orcinol), en Dische&#39;s (difenylamine) reagentia, de gestroomlijnde protocollen kan comafgerond in enkele minuten, zonder extra stappen van het moeten de componenten isoleren. De assays kunnen worden uitgevoerd in parallel te maken tussen RNA en DNA, en de aanwezigheid van vrije reducerende suikers zoals glucose, fructose, en ribose (figuur 1).

Resultaten worden getoond in figuur 3 voor toepassing van deze colorimetrische testen bekende referentieverbindingen. Representatieve kwalitatieve gegevens weergegeven voor de Benedict&#39;s (a), orcinol (b) Bial, en Dische de difenylamine (c) assays en standaard curves voor deze drie assays worden getoond in Figuur 4. In panelen 3 (ac), de linker panelen tonen positieve / negatieve controle experimenten met geschikte reactieve / reactief analyten; deze visuele resultaten worden getoond...

Een reeks colorimetrische testen beschreven voor het snel onderscheiden eiwitten, RNA, DNA, en opnieuw in ducing suikers mogelijk heterogene biomoleculaire monsters.

Snelle Colorimetrische Testen om kwalitatief onderscheid RNA en DNA in Biomoleculaire Monsters

Biochemical experimentation generally requires accurate knowledge, at an early stage, of the nucleic acid, protein, and other biomolecular components in ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om te bepalen of een mogelijk heterogene monster van biomoleculen nucleïnezuur en/of reducerende suikers bevat. En zo ja, onderscheid maken tussen RNA en DNA op basis van de verschillende reactiviteit van hun suikermotieven. Dit wordt bereikt door eerst de Benedict-test toe te passen om te bepalen of het biomoleculaire mengsel vrije reducerende suikers bevat.Als tweede stap wordt files, arsen of assay gebruikt, die vaststelt of er suikercomponenten zijn met pento-ringen. Vervolgens wordt difenylaminereagens gebruikt om te bepalen of de pento-suiker een deoxyribose is zoals in DNA of niet zoals in RNA. De resultaten tonen het type biopolymeer op basis van gemakkelijk te onderscheiden kleurproducten die worden gevormd door de verschillende reactiviteiten van suikergebaseerde componenten in het monster, die kunnen worden geanalyseerd tegen standaardcurven met behulp van spectrofotometrische metingen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals elektroforese met behulp van fluorescerende kleurstoffen, pico groen of cyber goud, is dat er geen beperking is op basis van grootte, lading of suikercomp

rapid-colorimetric-assays-to-qualitatively-distinguish-rna-dna

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

This video presents the protocol for signal detection during RNA chromogenic in situ hybridization. This technique can be used to diagnose an active oncogenic infection visually in an intact tissue specimen.

RNA CISH Signal Detection: A Technique to Detect Chromogenic Signals During RNA In Situ Hybridization in Intact Tissue Specimens

Het doel van deze publicatie is om te visualiseren en te discussiëren over de operatieve stappen van een Enhanced Northern Blot protocol op RNA geëxtraheerd uit Drosophila melanogaster embryo's, cellen en weefsels. Dit protocol is bijzonder bruikbaar voor de efficiënte detectie van kleine RNA species.

Verbeterde Northern Blot detectie van kleine RNA Species in Drosophila melanogaster

Gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole en haar freebase analoge vertonen een lage micromolaire cel cytotoxiciteit. Dit manuscript beschrijft een RNA transcriptie reactie, beeldvorming RNA met ethidiumbromide gekleurde gel en kwantificeren RNA met UV-Vis spectroscopie, teneinde transcriptie remming te bepalen door corroles en toont een eenvoudige methode voor de beoordeling antikanker kandidaat eigenschappen.

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Enzymatische test te meten transcriptie Remming van gallium (III) en H<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorfenyl) corroles

We beschrijven een digitale eindpuntassay voor het kwantificeren van nucleïnezuren met een vereenvoudigde (analoge) uitlezing. We meten bulkfluorescentie van druppelgebaseerde digitale assays met behulp van een standaard qPCR-machine in plaats van gespecialiseerde instrumenten en bevestigen onze resultaten door middel van microscopie.

Eenvoudige Bulk uitlezing van Digital nucleïnezuur kwantificering Testen

Hier presenteren we een protocol voor het traceren van genomic DNA (gDNA) verontreiniging in RNA monsters. De onderhavige methode maakt gebruik van primers specifiek voor de interne getranscribeerde spacer regio (ITS) van ribosomal DNA (rDNA) genen. De methode is geschikt voor betrouwbare en gevoelige detectie van DNA besmetting in meeste prokaryoten en de eukaryoten.

Beoordeling van DNA besmetting in RNA Samples gebaseerd op Ribosomal DNA

Hier presenteren we een protocol voor DNAzyme-afhankelijke splijting van RNA. Dit maakt een snelle en site-afhankelijke analyse van RNA 2 '-O-Methylation mogelijk. Deze aanpak kan worden gebruikt voor de voorlopige of belangrijke beoordeling van de activiteit van snoRNA.

DNAzyme-afhankelijke analyse van rRNA 2 '-O-methylatie

De op DNAzyme gebaseerde nanomachines kunnen worden gebruikt voor zeer selectieve en gevoelige detectie van nucleïnezuren. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor het ontwerp van op DNA gebaseerde nanomachines met een 10-23-kern met behulp van gratis software en hun toepassing bij de detectie van een Epstein-Barr-virusfragment als voorbeeld.

DNAzyme 10-23 - Op basis van nanomachines voor nucleïnezuurherkenning

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het bepalen van nucleïnezuurmetaboliserende enzymen, met behulp van voorbeelden van ligase-, nuclease- en polymerase-enzymen. De test maakt gebruik van fluorescerend gelabelde en niet-gelabelde oligonucleotiden die kunnen worden gecombineerd om duplexen te vormen die RNA- en/of DNA-schade of tussenproducten van de route nabootsen, waardoor het enzymgedrag kan worden gekarakteriseerd.

Gebruik van gemodificeerde synthetische oligonucleotiden om nucleïnezuurmetaboliserende enzymen te testen

Deze studie presenteert een robuuste methode om axonale mRNA's te isoleren met poreuze membraaninserts, waardoor totale neuron- versus neurietscheiding en RNA-zuivering mogelijk zijn. In combinatie met RTddPCR maakt de aanpak absolute kwantificering van low-copy transcripts mogelijk, wat studies naar mRNA-transport en lokale translatie met hoge gevoeligheid, reproduceerbaarheid en brede experimentele toepasbaarheid vergemakkelijkt.

Isolatie en kwantificering van axonale mRNA's met behulp van poreuze membraaninserts en RTddPCR

We beschrijven experimentele details van de synthese van patronen en herconfigureerbare deeltjes van tweedimensionale (2D) precursors. Deze methodologie kan worden gebruikt om deeltjes te maken in een verscheidenheid van vormen zoals veelvlakken en grijpinrichtingen bij lengteschalen variërend van micro tot centimeter schaal.

Origami Inspired Zelf-assemblage van Patterned en Herconfigureerbare Deeltjes

Leer snelle colorimetrische testen om RNA en DNA te onderscheiden in biomoleculaire monsters met behulp van Benedict-, Bial- en Dische-reacties. Deze methode maakt efficiënte analyse van suikercomponenten mogelijk.

Snelle Colorimetrische Testen om kwalitatief onderscheid RNA en DNA in Biomoleculaire Monsters

Meer video's verkennen