Name: Inleiding tot de vaste Ondersteunde Membrane Gebaseerd Electrofysiologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 56 s
Description: Leer SSM-gebaseerde elektrofysiologie voor het karakteriseren van elektrogene membraantransporteurs. Deze methode detecteert ladingsverplaatsing via vaste ondersteunde membraanelektroden en is ideaal voor basisonderzoek en drug discovery.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken J. Garcia-Celma, ik Smirnova en R. Kaback voor bijdragen aan de Lacy metingen en E. Bamberg voor ondersteuning en behulpzaam discussies.

1. Het opzetten van een Inrichting voor SSM-based Electrofysiologie Details zijn te vinden in twee van onze technische publicaties, die bevatten ook schematische tekeningen en foto&#39;s van onze cuvetten en het opzetten van 1, 2. Andere oplossing uitwisseling configuraties en doorstroming protocollen worden ook besproken in onze methode van papier 2. In de volgende voegen we enkele recente verbeteringen en technische details die van rechtstreeks belang zijn voor de videopresentatie. Klepbediening en data-acquisitie De interface box bevat een commerciële USB digitale uitgang / analoge input interface (NI USB-6009 National Instruments) en de klep chauffeurs. Het controleert de oplossing vloeien en is verantwoordelijk voor data-acquisitie. Kleppen worden normaal aangestuurd met 12 V. Echter, voor het snel schakelen van de kleppen kan worden aangestuurd met een spanning tot 18 V. In de video gebruiken we een 12 V voeding. &lt;/ P&gt; De klep driver printplaat kan werken vier kleppen. Het werd vervaardigd door het atelier van het Max Planck Instituut voor Biofysica. Kleppen kunnen worden gecontroleerd door computer of handmatig via schakelaars op het voorpaneel. Dat laatste is handig voor het spoelen-en schoonmaak-procedures. Tijdens de meting, de interface is computergestuurd met behulp van een afsluiter controle en data-acquisitie software (Surfe 2R software, IonGate Biosciences). 2. Voorbereidingen In dit hoofdstuk worden de verschillende protocollen voor de voorbereiding van een SSM-based elektrofysiologie experiment worden genoemd. 2.1 Het maken van de lipide oplossing voor de vorming van de SSM <ol><li> Meng 25 pl octadecylamine (5 mg / ml in chloroform) en 375 gl Diphytanoylphosphatidylcholine (20 mg / ml in chloroform) in een glas flacon. </li><li> Met een rotatieverdamper en continue stikstofgas, verdampen de chloroformongeveer 30 minuten. </li><li> Verwijder het lipide van de wanden van de glazen flacon door schudden met 500 gl n-decaan. De uiteindelijke lipide concentratie 15 mg / ml met 1:60 (w / w) octadecylamine. </li><li> Breng de oplossing voor de opslag van glas flacon. Bewaar de lipide-oplossing bij -20 ° C. </li></ol> 2.2 Chlorering van de referentie-elektrode De referentie-elektroden moet gechloreerde met regelmatige tussenpozen door slijtage. <ol><li> Verwijder de rest van de oude zilverchloride laag met behulp van fijn schuurpapier voor de chlorering proces. </li><li> Plaats de zilverdraad met een platina elektrode in een 1 M zoutzuuroplossing en chloreren gedurende 15 min bij 0,5 mA. Na het voltooien van chlorering, de zilveren draad verandert de kleur naar een homogene donkergrijs. </li></ol> 2.3 Bereiding van de polyacrylamide gel brug <ol><li> Bereid een oplossing die 100 mM KPi bij pH = 7, 100 mM KCl en 6% Acrylamide. </li><li> Voeg 0,3% APS (10% Voorraad) en 0,6% TEMED en binnenkort de oplossing te mengen met een pipet. </li><li> Direct na het mengen van de oplossing, pipetteer 30 ul van het mengsel te injecteren in de lege gel brug container. Het is belangrijk om luchtbellen tijdens de injectie te vermijden. </li><li> Tijdens een incubatietijd van 20 minuten polymeriseren van de gel. </li><li> Na polymerisatie van de gel brug wordt opgeslagen in oplossing (100 mM KPi pH 7, 100 mM KCl). Om de levensduur van de gel brug verlengen oplossing wordt bewaard bij 4 ° C. </li></ol> 2.4 Voorbereiding van de meting van oplossingen Door de sterke wisselwerking van de opgeloste stoffen met SSM worden elektrische artefacten gegenereerd wanneer oplossingen van een andere samenstelling worden uitgewisseld. Daarom is de bereiding van de oplossingen is een kritische stap. Neem de volgende voorzorgsmaatregelen tijdens het bereidingsproces oplossing om de oplossing te wisselen artefacten te minimaliseren. <ol><li> Maak niet-activeren en het activeren van oplossingen van de ene partij, de pH en ionische sterkte. </li><li> Hoge zout achtergrond helpt om oplossing uitwisseling artefacten te verminderen. </li><li> Verdeel de batch oplossing in twee volumes. </li><li> Voeg de activerende verbinding aan het activerende oplossing. Gebruik compenserende verbinding in de niet-activerende oplossing voor de osmolariteit en ionische sterkte van beide oplossingen zo gelijk mogelijk te houden. </li><li> Indien de oplossingen worden bewaard bij 4 ° C, of ​​alle oplossingen op kamertemperatuur voordat de meting, omdat zelfs kleine temperatuurverschillen artefacten produceren. </li></ol> 3. Een SSM-based Electrofysiologie Experiment Hier presenteren we een typisch protocol voor een SSM-based elektrofysiologische experiment. 3.1 Voorbereiden van de SSM Setup Terwijl de SSM Setup is niet in gebruik de buizen worden gevuld met een ethanol 30%/ Wateroplossing om bacteriegroei te voorkomen. <ol><li> Spoel het systeem met zuiver water om de ethanol uit de buis te verwijderen voordat het monteren van de cuvette. Vervang de ethanol containers met water containers. Met behulp van hoge druk (0,6-1,0 bar) reinigen van het systeem met 20-30 ml water. </li><li> Herhaal de reinigingsprocedure met een 100 mM KPi buffer bij pH 7,6 of niet-activerende oplossing. </li><li> Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de vloeistof systeem. </li></ol> 3.2 Montage van de cuvet <ol><li> Bevestig een o-ring aan de referentie-elektrode </li><li> Neem de gel brug van de opslag-oplossing en sluit de referentie-elektrode. </li><li> Prefill de uitlaatconnector met niet-activerende buffer plaatst een o-ring en sluit de gel brug naar de referentie-elektrode samenstel te voltooien. Pas goed op dat er geen luchtbellen zijn op de kruising van de gel brug en de uitlaat oplossing stromingsroute. </li><li> Assembleert het grootste deel van de cuvette door toevoeging van de veer contactpen (verbinding met de versterker), de inlaatbuis (verbinding naar de terminal klep), de O-ring (afdichting voor de SSM) en schroeven. </li><li> Met behulp van een pincet, neem de sensor chip uit de opslag-oplossing (10 mM octadecanethiol in ethanol). </li><li> Met behulp van een pipet, wassen de resterende oplossing met ca. 5 ml zuiver ethanol. </li><li> Droog de elektrode onder stikstofgas. </li><li> Plaats de sensor chip nauwkeurig op het basisdeel van de cuvet bij de inlaat boring van het grootste deel van de cuvet wordt naar de cirkelvormige actieve gebied van de sensor. </li><li> Voeg 1 ul van de lipide oplossing van het actieve gebied van de sensor chip. Zorg ervoor, dat de goudlaag volledig wordt gedekt door de lipide. </li><li> Onmiddellijk na het toevoegen van de lipide-oplossing, sluit de cuvette door toevoeging van de voorgemonteerde hoofdgedeelte. </li><li> Voor de montage van de cuvet in de kooi van Faraday, er zeker van zijn dat alle oppervlakken volledig droog zijn. </li><li> Connect de versterker naar de lente contact pin en de inlaatbuis naar de terminal klep. Bevestig vervolgens de cuvet met de schroeven in de kooi van Faraday. </li><li> Schroef de uitlaat connector naar de top van de cuvette. Tenslotte sluit de afvoerbuis naar de uitgang connector en het voltage generator om de referentie-elektrode. </li><li> Onmiddellijk na het monteren van de cuvet wassen van het systeem met buffer bij 0,6 bar. Dit leidt tot spontane vorming SSM. </li></ol> 3.3 Het meten van membraan parameters Om de kwaliteit van de SSM te controleren, zijn capaciteit en geleidbaarheid gemeten met behulp van de functie generator. <ol><li> Met behulp van de functie generator, gelden 100 mV gelijkspanning om de geleiding te meten. </li><li> Bereken de geleiding: De huidige verval toont het opladen van het membraan condensator. Nadat de condensator volledig is opgeladen de gemeten huidige opbrengsten het membraan geleiding met behulp van de wet van Ohm. Voor de eenvoud gebruiken we de current 1 seconde nadat de spanning op de geleiding G = I / U. berekenen </li><li> Breng een driehoekige AC spanning van 50 mV piek amplitude en een frequentie van 0,5 Hz tot de capaciteit te meten piek. </li><li> Bereken de capaciteit: De amplitude van de resulterende blokgolf stroom vertegenwoordigt de laadstromen van de condensator. De kapaciteit C is gelijk aan de overgedragen lading Q = IΔt gedeeld door Au = 100 mV. (Au is tweemaal de aangelegde spanning van 50 mV, omdat ik het verschil huidige positieve minus negatieve helling van de driehoekige spanning.) </li><li> Bewaken van de elektrische parameters van het membraan herhaaldelijk elke 10 min. gedurende ca.. 30 tot 40 min, totdat constante waarden worden bereikt. Wassen tussendoor met KPi buffer bij hoge druk in het traject van ongeveer 0,6 tot 1 bar. </li><li> Schat de kwaliteit van de SSM: Optimale parameters in het traject van 0,1 tot 0,2 nS en 2 tot 3,5 nF. Een hoge geleidbaarheid boven 0,8 nS en lage capaciteit van minder dan 1 nF geeftdat de SSM niet correct gevormd. Een hoge capaciteit boven 4 nF kan betekenen dat de actieve zone niet volledig onder de SSM. </li><li> Als de parameters niet in het optimale bereik moet het membraan worden weggegooid en andere SSM onder gebruik van een versbereide elektrode chip. </li></ol> 3.4 Controle voor oplossing uitwisseling artefacten Nadat het membraan parameters zijn gecontroleerd, dient de meting buffers worden getest oplossing uitwisseling artefacten. <ol><li> Plaats de respectievelijke oplossing containers naar de vloeistof systeem. </li><li> Verwijder luchtbellen uit de vloeistof-systeem, met behulp van de handmatige kleppen. </li><li> Met behulp van de data-acquisitie software koos de stroom protocol dat u wilt gebruiken in uw experiment. </li><li> Stel de druk tot 0,6 bar en start de meting. </li><li> Afgezien van de mechanische klep switching artefacten, idealiter geen artefact stromen worden gemeten of ze moeten veel sma wordenller dan het verwachte eiwit transport signalen. Als oplossing uitwisseling artefacten worden waargenomen, proberen om de buffer composities en / of de voorbereidingsprocedure te optimaliseren voordat u verder het experiment. </li></ol> 3.5 Het toevoegen van het eiwit monster Meestal proteoliposomen of membraan fragmenten worden opgeslagen bij -80 ° C. Voor een meting van een hoeveelheid van ongeveer 30 pl nodig. <ol><li> Spoel de SSM met niet-activerende oplossing. </li><li> Ontdooi het eiwit monster op ijs. </li><li> Drie 10-sec sonicatie cycli worden afgewisseld met 10-sec koeling intervallen op ijs. Proteoliposomen worden behandeld met geluidsgolven met een badsonicator. Voor membraanfragmenten een tip sonicator (50W, 30 kHz, 1 mm sonotrode diameter, intensiteit 20%, 0,5 cyclus) wordt gebruikt. Na de laatste sonificeren stap niet terug het monster op het ijs, maar injecteren onmiddellijk in de cuvet. </li><li> Schroef de uitlaat connector samen met de referentie-elektrode assembly. </li><li> Met behulp van een pipet, zuig 30 pi van het eiwit monster en monteer de pipet tip om de uitlaatboring. </li><li> Open de handbediende klep in de niet-activerende pad naar de afvalcontainer en injecteer het proteoliposomen in de cuvet volume. Wees voorzichtig niet te lucht te injecteren in het volume van de meetcel van de sensor. </li><li> Voor het verwijderen van de pipet tip, sluit de handmatige klep om verdere oplossing stromen te voorkomen. </li><li> Laat de proteoliposomen te adsorberen aan de SSM een incubatietijd van 1-2 uur. Het is ook mogelijk om incubeer overnacht. </li></ol> 3.6 Algemene procedure van een SSM-based experiment <ol><li> Warm het meten van buffers in de tijd, indien bewaard bij 4 ° C. Alle buffers moeten meten bij kamertemperatuur voordat de meting artefacten te vermijden. </li><li> Bij het wijzigen van oplossingen, verwijder eerst de buizen in de oplossing containers met een niet-fuzzing weefsel, plaats vervolgens de nieuwe flessen. </li><li> Vóór het begin van de meting, gebruikt u de handmatige kleppen om luchtbellen, die zouden zijn ontstaan ​​uit de veranderende procedure te verwijderen. </li><li> Stel de druk net voor het starten van een meting. We routinematig gebruik van een druk van 0,6 bar, die bij onze specifieke afsluiter en buizenconfiguratie levert een debiet van ongeveer 1,0 ml / sec. </li><li> De eerste meting kan worden uitgevoerd direct na elkaar en afwijzing tot de piekstroom constant blijft. Indien de oplossingen verschillen in pH een incubatietijd van ten minste 3 minuten nodig om het inwendige pH van de proteoliposomen passen voordat de meting wordt gestart. </li><li> Nu is de set-up is klaar voor de meting. Om de ruis te verminderen minstens 3 metingen moeten worden gemaakt en gemiddeld. </li></ol> 3.7 Controle Metingen Een signaal rundown tijdens een reeks metingen kan optreden als gevolg van afbraak van eiwitten of een verlies van adsorptie. Elke SSM experiment moet include een vervallen controle. Dit gebeurt door herhaalde metingen met identieke oplossingen. De minimale verlaging besturingsmiddelen een meting aan het begin en aan het eind van het experiment met dezelfde oplossing. Wij raden aan om de vervallen controle doen onder omstandigheden waarbij je de hoogste piek amplitude in het experiment verwachten. Dit maakt het gemakkelijker om de verlaging van het signaal kwantificeren. Het signaal vervallen kan worden gekwantificeerd door vergelijking van de piek amplitudes van de twee vervallen controles. Het verkregen percentage kan worden gebruikt om de gemeten signalen te corrigeren door uitgaande van een lineaire tijdsafhankelijkheid van het vervallen. 3.8 Artifact controles Indien mogelijk proberen om uw resultaten te valideren door het remmen van het eiwit van belang na het experiment. Overblijvende signalen zijn waarschijnlijk oplossing uitwisseling artefacten. De signalen hebben dan de gemeten artefacten te corrigeren. <ol><li> Spoel het systeem met 20-30 ml zuiver water en 20-30 ml 30% ethanol / water. De ethanolische oplossing vermijdt bacteriegroei wanneer het systeem niet gebruikt. </li><li> Na deze reiniging procedure, laat de druk uit het systeem en schakel alle instrumenten. </li><li> Verwijder de cuvette uit de Faraday kooi en het demonteren. Alle onderdelen van de cuvette kan worden gereinigd met water en zuivere ethanol, indien nodig, met behulp van een badsonificeerinrichting. </li><li> Plaats de sensor chip in een glas beker met zuivere ethanol. Sonificeer het bekerglas gedurende 1 tot 2 minuten met een badsonificeerinrichting. </li><li> Droog de sensor chip onder stikstofgas. </li><li> Bewaar de sensor chip uit de buurt van licht in een 10 mM Octadecanthiol oplossing in ethanol. Na een incubatietijd van ongeveer 30 minuten de sensor chip is klaar voor hergebruik. </li></ol>

<ol><li>Seifert, K., Fendler, K., Bamberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge+transport+by+ion+translocating+membrane+proteins+on+solid+supported+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Charge transport by ion translocating membrane proteins on solid supported membranes.</a> Biophys. J. 64, 384-391 (1993).</li>
<li>Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SSM-based+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">SSM-based electrophysiology.</a> Methods. 46, 97-103 (2008).</li>
<li>Garcia-Celma, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+activation+of+the+melibiose+permease+MelB+immobilized+on+a+solid-supported+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Rapid activation of the melibiose permease MelB immobilized on a solid-supported membrane.</a> Langmuir. 24, 8119-8126 (2008).</li>
<li>Mager, T., Rimon, A., Padan, E., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+mechanism+and+pH+regulation+of+the+Na%2B%2FH%2B+antiporter+NhaA+from+Escherichia+coli%3A+an+electrophysiological+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Transport mechanism and pH regulation of the Na+/H+ antiporter NhaA from Escherichia coli: an electrophysiological study.</a> J. Biol. Chem. 286, 23570-23581 (2011).</li>
<li>Zhou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Charge+translocation+during+cosubstrate+binding+in+the+Na%2B%2Fproline+transporter+of+E.coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Charge translocation during cosubstrate binding in the Na+/proline transporter of E.coli.</a> J. Mol. Biol. 343, 931-942 (2004).</li>
<li>Ganea, C., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+transporters%3A+charge+translocation+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Bacterial transporters: charge translocation and mechanism.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1787, 706-713 (2009).</li>
<li>Schulz, P., Werner, J., Stauber, T., Henriksen, K., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+G215R+mutation+in+the+Cl-%2FH%2B-antiporter+ClC-7+found+in+ADO+II+osteopetrosis+does+not+abolish+function+but+causes+a+severe+trafficking+defect%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The G215R mutation in the Cl-/H+-antiporter ClC-7 found in ADO II osteopetrosis does not abolish function but causes a severe trafficking defect.</a> PLoS ONE. 5, e12585(2010).</li>
<li>Schulz, P., Dueck, B., Mourot, A., Hatahet, L., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+ion+channels+on+solid+supported+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measuring ion channels on solid supported membranes.</a> Biophys. J. 97, 388-396 (2009).</li>
<li>Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+LacY%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of LacY.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 7373-7378 (2009).</li>
<li>Garcia-Celma, J. J., Ploch, J., Smirnova, I., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineating+electrogenic+reactions+during+lactose%2FH%2B+symport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Delineating electrogenic reactions during lactose/H+ symport.</a> Biochemistry. 49, 6115-6121 (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

1. Voordelen SSM-based elektrofysiologie vergelijking met conventionele methoden SSM-based elektrofysiologie heeft zich bewezen als een waardevol instrument van de elektrofysiologische toolbox. Het is vooral nuttig in gevallen waarin conventie elektrofysiologie, namelijk patch clamp en voltage clamp methodes, niet kunnen worden toegepast: Afgezien van enkele zeldzame uitzonderingen na bacteriële vervoerders niet kan worden onderzocht met behulp van voltage clamp-of patch-clamp methodes vanwege de kleine omvang van bacteriën en omdat ze zijn moeilijk uit te drukken in zoogdiercellen of eicellen. Maar ook fysiologisch relevante zoogdieren vervoerders kan worden onderzocht. In dit geval SSM-based elektrofysiologie is aantrekkelijk voor vervoerders uit intracellulaire membranen en voor screening toepassingen in drug discovery vanwege zijn robuustheid en zijn potentieel voor automatisering. SSM-basedUsing conventionele elektrofysiologie, tijdopgeloste karakterisering van transporters is uitdagend. Aangezien de omzet van vervoerders is laag een &#39;gigantische patch&#39; of configuratie van een &#39;whole cell&#39; is vereist, die een inherent lage tijdsresolutie in een oplossing ruil experiment hebben. De complicatie kan worden overwonnen met behulp van fotolytische substraat release. Slechts een beperkt aantal substraten zijn geschikt voor deze benadering. Hier de snelle uitwisseling oplossing bij de SSM biedt de unieke kans om elektrofysiologische studies uit te voeren met een hoge tijdsresolutie met willekeurige substraten. 2. Beperkingen en kritische stappen In tegenstelling tot patch clamp en voltage clamp technieken kan SSM-based elektrofysiologie niet worden gebruikt om een ​​mogelijke toepassing. Transporter karakterisering blijft daarom beperkt tot modes die niet afhankelijk zijn van een membraanpotentiaal vervoeren. In het algemeen SSM-based elektrofysiologie geen beperkingen aan het type (electrogene) transporter. Maar spanning clkan amp of patch clamp methodes voordelen hebben, als intracellulaire componenten zoals bindende eiwitten zijn nodig voor eiwit functionaliteit. Beperkingen kunnen ontstaan, als oplossing uitwisseling creëert grote artefact stromen. Dit gebeurt wanneer het substraat sterk interageert met de SSM dergelijke in het geval van lipofiele verbindingen. Artefact controles kunnen worden gebruikt om de gemeten signalen te corrigeren. Bovendien hoog zoutgehalte achtergrond meten in alle buffers kunnen worden gebruikt om artefacten te reduceren. Maar in gevallen, waarbij de grootte van het artefact is vergelijkbaar met het eiwit signaal, is het bijna onmogelijk om het eiwit gerelateerde signaal van het artefact te isoleren. Gelukkig hoge artefacten zijn ongebruikelijk in een geoptimaliseerde oplossing uitwisseling. Er zijn een paar stappen die cruciaal zijn voor de succesvolle realisatie van een SSM-based elektrofysiologie experiment zijn. De bereiding van het eiwit monster is het belangrijkste onderdeel. Als proteoliposomen worden gebruikt, moet u de RECONSlige prostitutie proces levert een schone, reproduceerbaar monster van voldoende LPR en de transporteur is georiënteerd op de juiste wijze. De LPR kan worden gecontroleerd door bevriezing breuk elektronenmicroscopie en oriëntatie door een ELISA experiment als antilichamen beschikbaar. Gebruik alleen een SSM die optimale parameters toont voor de incubatie van het eiwit monster. De injectie van het eiwit is een belangrijke stap. Sonicatie is essentieel en luchtbellen worden vermeden tijdens de injectie. Na het monster incubatie de metingen zelf zijn van cruciaal belang, omdat luchtbellen de geadsorbeerde eiwit monster van de sensor chip zal verwijderen. Daarom altijd luchtbellen te verwijderen na het veranderen van oplossingen. Toch een signaal vervallen kan optreden. Een mogelijke signaal vervallen corrigeren, is het essentieel om vervallen controles bereiken tijdens het experiment. 3. Gespecialiseerde Systems De SSM-instelling kan worden aangepast aan de toepassing ervan. Bovendien thier zijn heel anders, zeer gespecialiseerde setups beschikbaar. Er is de mogelijkheid om eiwitten signalen onder asymmetrische omstandigheden, bijvoorbeeld onder een pH-gradiënt te meten. Voor asymmetrische buffer samenstellingen binnen en buiten de proteoliposomen een derde te kunnen zetten, de rustende oplossing moet komen en dit vereist een configuratie dubbele uitwisseling. Hier extra driewegklep schakelen tussen niet-activerende en rust oplossingen vereist. Om de tijdsresolutie van het systeem we een andere stromingsmeter weg zonder de terminal klep, maar een ander type van cuvette ontwikkeld verhogen. Hier de kruising van activatie en niet-activerende oplossing ligt binnen het cuvette, 3 mm voor de SSM. Deze opstelling is zeer geschikt voor kinetische analyse van snel transport processen. Het kan worden aangetoond dat een tijdsresolutie zo laag als 2 msec is mogelijk. Commerciële fully geautomatiseerde systemen zijn beschikbaar die gericht zijn op een aanzienlijk hogere doorvoersnelheid voor drug discovery. Een beweegbare eenheid verzamelt oplossingen en injecteert deze op het sensoroppervlak in 96-well platen in een standaard microtiterplaat formaat.

Hier laten we zien een nieuwe elektrofysiologische benadering gebaseerd op een solide ondersteunde membraan (SSM) voor de karakterisering van elektrogene membraaneiwitten. De vaste drager bestaat uit een dunne goudlaag op een glasplaatje, de sensor chip. De hydrofiele goud oppervlak wordt gebruikt om de thiolgroep van een alcanethiol reagens binden. Daarna selfassembly van een fosfatidylcholine monolyer de vorming van de SSM voltooid. Om electrogene reacties van membraaneiwitten te meten worden proteoliposomen of membraan fragmenten geadsorbeerd aan het SSM (figuur 1). Het eiwit bevattende membraan en de SSM vormen dan een capacitief gekoppeld membraansysteem. Daarom kan lading translocatie in het eiwit bevattende membraan worden gedetecteerd door capacitieve koppeling via de SSM. Deze methode levert alleen overgangsstromen. De piekstroom vertegenwoordigt de stationaire vervoersactiviteiten. De tijdsafhankelijke transporter currents kan worden gereconstrueerd door schakeling analyse. De sensor chip is gemonteerd in een cuvette (zie figuur 2). De cuvette heeft een cilindrisch volume van de meetcel van 17 pl (netto volume met O-ring gemonteerd). Een veer contactpin creëert de contactpersoon naar de versterker. Een uitlaat connector is vastgeschroefd aan de bovenkant van het hoofddeel en draagt ​​de referentie-elektrode, een gechloreerde zilverdraad. De cuvette wordt gemonteerd in een kooi van Faraday. Het is verbonden met een fluïdumdoorgang, die wordt gebruikt om de transportactiviteit van het membraaneiwit induceren in reactie op een snelle oplossing uitwisseling (figuur 3). In de enkele oplossing uitwisselingsprotocol twee oplossingen, een niet-activerende en een activerende oplossing, zijn vereist. Het debiet wordt geregeld door perslucht via een klepbediening software op een computer of handschakelaar op een interface box.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>Waterbath Sonicator</td><td>Bandelin</td><td>RK 52 H</td><td></td></tr><tr><td>Tip Sonicator</td><td>Hielscher Ultrasonics GmbH</td><td>UP50H</td><td></td></tr><tr><td>2-way valve</td><td>NResearch, West Caldwell, USA</td><td>NR225T011</td><td></td></tr><tr><td>Terminal valve</td><td>NResearch, West Caldwell, USA</td><td>NR225T031</td><td></td></tr><tr><td>Manometer</td><td>Greisinger electronics</td><td>GDH 14 AN</td><td></td></tr><tr><td>Faraday cage</td><td>Max Planck Institute of Biophysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cuvette</td><td>Max Planck Institute of Biophysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 ml solution containers</td><td>Kartell</td><td>1623</td><td></td></tr><tr><td>O-rings</td><td>Seal Science Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronix</td><td>TDS 1002</td><td></td></tr><tr><td>Reference electrode</td><td>Max Planck Institute of Biophysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Function generator</td><td>Max Planck Institute of Biophysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubings</td><td>SAINT-GOBAIN Performance Plastics</td><td>AAC00006</td><td></td></tr><tr><td>Sensor chip</td><td>Fraunhofer Institut f&#252;r Schicht und Oberfl&#228;chentechnik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Interface box</td><td>Max Planck Institute of Biophysics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Keithley</td><td>427</td><td></td></tr><tr><td>Manual cog</td><td>Vygon GmbH</td><td>876</td><td></td></tr><tr><td>USB analog-to-digital converter</td><td>National Instruments</td><td>6009</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Regeants</td></tr><tr><td>1,2&#8209;Diphytanoyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholine</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850356</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide/Bis-acrylamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3574</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose </td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol </td><td>Sigma Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>VWR AnalaR NORMAPUR</td><td>603-002-00-5</td><td></td></tr><tr><td>Natural E. coli lipids polar extract</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>100600</td><td>for LacY reconstitution</td></tr><tr><td>n-Decane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D901</td><td></td></tr><tr><td>Octadecanethiol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O1858</td><td></td></tr><tr><td>Octadecylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74750</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Merck</td><td>1049360500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylenediamine</td><td>BIO RAD</td><td>1610801</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Lactose monohydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8783</td><td></td></tr></tbody></table>

inleiding tot de vaste ondersteunde membrane gebaseerd electrofysiologie

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

De elektrofysiologische methode presenteren we is gebaseerd op een vaste drager membraan (SSM) bestaande uit een laag octadecanethiol gechemisorbeerd op een gouden gecoate sensor chip en een fosfatidylcholine monolaag geplaatst. Dit samenstel wordt gemonteerd in een cuvet systeem met de referentie-elektrode, een gechloreerde zilverdraad. Na adsorptie van membraan-fragmenten of proteoliposomen met het membraan eiwit van belang, is een snelle oplossing uitwisseling gebruikt om de vervoersactiviteiten van het membraan eiwit induceren. In de enkele oplossing uitwisselingsprotocol twee oplossingen, een niet-activerende en een activerende oplossing, nodig zijn. Het debiet wordt geregeld door perslucht en een ventiel en buissysteem binnen een Faraday kooi. De kinetiek van de elektrogene transport activiteit wordt verkregen via de capacitieve koppeling tussen de SSM en de proteoliposomen of membraan fragmenten. Werkwijze Daarom levert alleen transient stromingen. De piekstroom vertegenwoordigt de stationaire vervoersactiviteiten. De tijdsafhankelijke transporter stromingen kan worden gereconstrueerd door schakeling analyse. Deze methode is vooral geschikt voor prokaryotische of eukaryotische transporters transporters van intracellulaire membranen, die niet kan worden onderzocht door de patch clamp of voltage clamp methodes.

Tot nu, SSM-based elektrofysiologie werd gebruikt om meer dan 20 vrachtwagens, meestal van prokaryotische oorsprong, bijv. MelB 3, 4 en NhaA PutP 5 (samengevat in 6) karakteriseren. Maar ook eukaryote vervoerders uit intracellulaire membranen, bijv. ClC7 7 evenals ionkanalen, zoals de nicotine acetylcholine receptor 8 zijn onderzocht. Hier presenteren we als voorbeeld metingen van de suiker / H + cotransporter kanten van Escherichia coli met proteoliposomen met ten minste 85% goede kant gerichte kanten op een LPR van 5 9, 10. Wij richten ons op de belangrijkste stappen die leiden tot een minimale kinetisch model van dit transporteiwit. 1. Elektrofysiologische karakterisatie van wildtype Lacy De eerste stap is een algemene karakterisering van de reactie door het meten electrogene verschillende pH-waarden ( <strong<html> &gt; Figuur 4), substraat concentraties (figuur 5) en substraten. Om de techniek te valideren, werden K M en gegeven in de literatuur pK-waarden weergegeven. De pH-afhankelijkheid van Lacy toont twee verschillende elektrogene reacties. Het capacitief gekoppeld huidige stijgingen tussen pH 5 en pH 8.5, maar ook van vorm verandert. Onder alkalische omstandigheden steady state transport wordt waargenomen, terwijl bij zure pH-waarden slechts een snelle elektrogene reactie blijft. Om de steady state signalen te onderscheiden van de snelle elektrogene reacties die we circuit analyse gebruikt om transporter stromen (Figuur 6) te reconstrueren. Bij pH 7 de monofase-signaal bifasische. Dit geeft ook aan dat er twee verschillende electrogene reacties. Geschat uit de overgedragen lading (integraal van de signalen), de twee reacties hebben ongeveer 6% en 94% van de totale electrogenicity van de transportcyclus. ove_step &quot;. Toewijzing van de elektrogene reacties&gt; 2 De twee electrogene reacties op specifieke stappen in de reactiecyclus Lacy toewijzen werd E325A Lacy variant gemeten (Figuur 7). Deze variant toont alleen lactose uitwisseling, maar deficiënt voor actief transport modes, vanwege de remming van proton release. Het signaal van E325A Lacy staat voor een snel voorbijgaande aard en is constant voor alle gemeten pH-waarden. De vorm en amplitude van het signaal is gelijk aan het signaal van wildtype Lacy onder zure omstandigheden. Verder zien we een kleine negatieve fase na de dalende piekstroom, die kenmerkend is voor een snelle stootspanningen gemeten in capacitief gekoppelde systemen. Omdat lactose bindend en release is niet elektrogene, de snel voorbijgaande moeten correleren met een elektrogene conformationele overgang na lactose bindend. Het is bekend dat het proton afgifte stap rate limiting voor Lacy omzet in de lactose concentratiegradiënt aangedreven vervoerswijze. In dit geval verwachten we een stijging van het transporttarief met alkalische pH, omdat proton vrijlating wordt begunstigd. Dit is het geval voor de steady state transport gecorreleerd signaal van wildtype Lacy. Bovendien kon worden aangetoond door pH-gradiënt meting die alleen het binnenste pH invloed op de steady state transport van Lacy (niet gepubliceerd). Daarom is de grote electrogene reactie kan worden toegewezen aan de proton afgifte stap. 3. Metingen voor kinetische analyse Na identificatie van de elektrogene reacties aan en uit vrachtprijzen werden bepaald met behulp van een SSM-instelling met een hoge tijdsresolutie van ongeveer 4,5 msec. Dit is alleen mogelijk onder omstandigheden wanneer een reactie overheerst het signaal. In dit geval de snelheidsconstanten kunnen worden afgeleid uit de transiëntstromen inachtneming van de tijdresolutie van de signalen met behulp van een iteratieve kleinste kwadraten de<html> convolutie algoritme (figuur 8). De bepaalde snelheidsconstanten en de voorgestelde minimale kinetische model (Figuur 9) tenslotte werden gebruikt voor de simulatie van de transporter kinetiek. De gesimuleerde curves reproduceren de SSM data die bovendien bewijst het kinetisch model. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig1.jpg" alt="Figuur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig1highres.jpg"/> Figuur 1. Adsorptie geometrie van proteoliposomen op de SSM. De SSM is gevormd op een sensor chip, een gestructureerde goud gecoate glasplaatje. Om electrogene reacties van membraaneiwitten te meten worden proteoliposomen of membraan fragmenten geadsorbeerd aan de SSM. De twee membranen een capacitief gekoppelde systeem. Daarom alleen overgangsstromen gedetecteerd. tp_upload/50230/50230fig2highres.jpg &quot;/&gt; Figuur 2. De SSM cuvet voert de sensor chip en de referentie-elektrode. De sensor chip is ingeklemd tussen de kuvet basis en de cuvette hoofd. De referentie-elektrode is geïsoleerd van de stromingsroute door een polyacrylamidegel zoutbrug. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig3.jpg" alt="Figuur 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig3highres.jpg"/> Figuur 3. Fluid Pathway en elektrische circuit van de SSM Setup. In de enkele oplossing uitwisselingsprotocol slechts een niet-activerende (NA) en een activerende (A)-oplossing nodig. Het debiet wordt geregeld door twee 2-weg kleppen (V1) en een terminal ventiel (V2). De terminal ventiel schakelt tussen niet-activerende en activerende oplossingen, regisseren een van de oplossingen voor de cuvette en de andere oplossing om een ​​afvalcontainer (W). De sensor chip (SSM) is aangesloten op de versterker (I / U)<html> terwijl de referentie-elektrode (AgCl) is verbonden met de functiegenerator (F) in de externe elektrische schakeling. Een computer (PC) en een interface box worden gebruikt voor de werking van de afsluiter en data-acquisitie. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig4.jpg" alt="Figuur 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig4highres.jpg"/> Figuur 4. Stootspanningen gemeten met wildtype Lacy proteoliposomen na 100 mM lactose concentratie springt bij verschillende pH-waarden. Het niet-activerende oplossing bevatte 100 mM glucose, terwijl de activerende oplossing bevatte 100 mM lactose. Alle oplossingen werden bereid in 100 mM kaliumfosfaatbuffer bij de aangegeven pH met 1 mM DTT. Voor details van de meetcondities in deze en de volgende figuren wordt verwezen naar 9 en 10. <html> ftp_upload/50230/50230fig5highres.jpg &quot;/&gt; Figuur 5. Gemiddelde genormaliseerde Peak stromen gemeten met wild-type Lacy proteoliposomen na lactoseconcentratie sprongen in verschillende concentraties en pH-waarden. De K M waarden worden verkregen van de hyperbolische past. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig6.jpg" alt="Figuur 6" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig6highres.jpg"/> Figuur 6. Reconstructie van transporter stromingen. De voorbijgaande stromen (A) wordt gebruikt om de transporter stromingen (B) te reconstrueren werden gemeten met een wild-type Lacy proteoliposomen na 100 mM lactoseconcentratie springt bij pH 8.5 (blauw trace) en pH 5.2 (rood trace). Bij pH 8,5 rouleren voortdurend waargenomen terwijl bij pH 5,2 snel electrogene reactie optreedt. Dit wordt duidelijk waargenomen in de gereconstrueerde momentele (B). files/ftp_upload/50230/50230fig7.jpg &quot;alt =&quot; Figuur 7 &quot;fo: content-width =&quot; 4in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/50230/50230fig7highres.jpg &quot;/&gt; Figuur 7. Tijdelijke stroom gemeten met E325A Lacy proteoliposomen na een 100 mM lactoseconcentratie sprong bij pH 5,2. Dit Lacy variant wordt geremd in het proton vrijlating stap van het transport cyclus en dus transport-deficiënte. De kleine negatieve component waargenomen is kenmerkend voor een snelle transiënte stromen gemeten in capacitief gekoppelde systemen en wordt veroorzaakt door de lozing van het membraan capaciteit na een snelle elektrogene reactie. Zijn tijd constante π0 wordt bepaald door de capaciteiten en de geleidingen van het systeem (figuur 1). <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig8.jpg" alt="Figuur 8" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig8highres.jpg"/> Figuur 8. Overgangsstromen gemeten met wild-type Lacy proteoliposomen after verschillende lactoseconcentratie springt bij pH 5.2. Onder deze omstandigheden geen steady state transport wordt waargenomen, maar een elektrogene conformationele overgang op lactose bindend. De stippellijn geeft de overdrachts-functie die de tijdsresolutie van het systeem. De inzet toont de bepaling van de aan en uit snelheidsconstanten van de waargenomen snelheidsconstante k obs met een hyperbolische fit aan de gegevens. De waargenomen snelheidsconstante werd berekend uit de transiëntstromen een iteratieve kleinste-kwadraten deconvolutie-algoritme 10. <img src="/files/ftp_upload/50230/50230fig9.jpg" alt="Figuur 9" fo:content-width="4.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50230/50230fig9highres.jpg"/> Figuur 9. Een kinetisch model voor de reactie cyclus van Lacy. Electrogene twee stappen kunnen worden geïdentificeerd en gekarakteriseerd door SSM metingen. Een sterk elektrogene reactie neerkomt op ~ 94% van de totale lading verplaatsing in de reactiecyclus wordt alleen waargenomen bij neutrale en basische pH-waarden. Het kan worden toegewezen aan de proton afgifte stap (blauwe pijl). Een zwak elektrogene stap wordt waargenomen bij zure pH bij continue omzet van wild-type Lacy wordt geremd. We toegewezen deze reactie een elektrogene conformationele overgang op lactose binding, die 6% van de totale lading verplaatsing in de reactiecyclus vertegenwoordigt.

Hier presenteren we een elektrofysiologische methode gebaseerd op vaste drager membranen met de nadruk op de toepassing daarvan voor de karakterisering van elektrogene membraan transporters.

Inleiding tot de vaste Ondersteunde Membrane Gebaseerd Electrofysiologie

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

Supportmembraan-gebaseerde elektrofysiologie, afgekort als SSM-gebaseerde elektrofysiologie, is een nieuwe elektrofysiologische benadering. Deze biedt voor een reeks toepassingen een aanzienlijke verbetering ten opzichte van de conventionele methoden.Het belangrijkste instrument van de conventionele elektrofysiologie is de met elektrolyt gevulde micro-elektrode, terwijl SSM-gebaseerde elektrofysiologie ladingstranslocatie detecteert via een op een vaste drager ondersteunde membraanelektrode. Dit is uiterst nuttig in gevallen waarin conventionele elektrofysiologie niet kan worden toegepast, zoals bij bacteriële transporters, die — afgezien van enkele zeldzame uitzonderingen — niet kunnen worden onderzocht met voltage-clamp- of patch-clamp-methoden. In dergelijke gevallen is SSM-gebaseerde elektrofysiologie zeer succesvol gebleken.Het kan ook worden aangewend om fysiologisch relevante eukaryote transporters in intracellulaire membranen te onderzoeken. Er zijn veel manieren om elektrofyziologische experimenten op basis van SSM uit te voeren. In fundamenteel onderzoek kan het worden toegepast om kinetische parameters te bepalen en het transportmechanisme te verduidelijken, maar de robuustheid en het potentieel voor automatisering maken het ideaal voor screeningtoepassingen bij het ontdekken van targets.De SSM-elektrode bevat een samengesteld membraansysteem bestaande uit de onderliggende SSM en de geadopteerde proteasomen of membraanfragmenten die het transporteiwit van belang bevatten. De elektrische eigenschappen van het samengestelde membraan kunnen worden beschreven door een equivalent circuit waarin de membranen een capacitief gekoppeld systeem vormen. Let op dat het elektrische gedrag van het systeem in essentie hetzelfde is, ongeacht of er membraanfragmenten of protealiposomen worden gebruikt.De ladingsverplaatsing in het transporteiwit wordt via de capaciteit van het blaasmembraan overgebracht naar het meetcircuit. Dit detectieprincipe wordt capacitieve koppeling genoemd. In een typisch experiment biedt de snelle uitwisseling van de oplossing bij de VSSM het substraat voor het transporteiwit; de daaropvolgende elektrogene transportactiviteit van het eiwit genereert een stroom, die via de SSM-capaciteit is gekoppeld aan het meetsysteem.Tegelijkertijd zorgt de elektrogene eiwitactiviteit voor een geleidelijke oplading van het liposomale membraan, wat leidt tot een inhibitie van het transporteiwit en een afnemende stroom in het meetcircuit; de gemeten stroom is het resultaat van gelijktijdige transportreacties van miljoenen proteoliposomen die geadsorbeerd zijn aan de Enzo, elk met ongeveer 100 transporters. De opstelling bestaat uit een kooi van Faraday met een vloeistofpad, externe circuits voor klepbesturing, signaalversterking, en data-acquisitie en -analyse.De EC-kooi bevat de containers, kleppen en buizen die nodig zijn voor de controle van de vloeistofstroom, evenals een cubit met een XOR-chip. De XOR-chip bevat de SSM-elektrode en de geabsorbeerde prot-liposomen. De vete is verbonden met de versterker en functiegenerator van het externe elektrische circuit.SSM-metingen, wreak fire, twee oplossingen, één activerende en één niet-activerende, apart van het substraat, dat alleen in de activerende oplossing aanwezig is. Beide oplossingen hebben dezelfde samenstelling in de enkelvoudige uitwisselingsconfiguratie. Twee tweewegkleppen regelen de stroom van de niet-activerende en de activerende oplossingen.De eindkraan, een mechanisch gekoppelde drievoudige driewegkraan, wordt gebruikt om te schakelen tussen de niet-activerende en de activerende oplossingen, waarbij één van de oplossingen naar de afvalcontainer wordt geleid en de andere oplossing naar de qve. Wanneer de eindkraan wordt omgeschakeld, wordt de stroom van de niet-activerende oplossing omgeleid naar het afval en stroomt de activerende oplossing naar de qve. Deze configuratie maakt een gelijktijdige continue stroom van beide oplossingen mogelijk.Op elk moment tijdens het flowprotocol kan het flowpad naar behoefte worden geoptimaliseerd. Er moet echter rekening worden gehouden met het feit dat de afstand tussen de SSM en de junctie van de niet-activerende en activerende oplossingen zo kort mogelijk moet worden gehouden, aangezien dit de tijd voor de uitwisseling van de oplossingen bepaalt.De stroomversterker buiten de kooi van het voedingsplatform is verbonden met een sensorchip. Gewoonlijk wordt deze ingesteld op een versterking van 10⁸ tot 10⁹ V/A en een rusttijd van 1 tot 10 ms. Een functiegenerator is verbonden met de referentie-elektrode en een computer met software voor klepbesturing en gegevensverwerving en een interfacebox maken het systeem compleet.De interfacebox bevat de acquisitiesystemen voor de klepsturingen en de digitale output-hardware. De vloeistofstroom wordt gehandhaafd door perslucht van 0,22 bar. De druk wordt gemonitord met een digitale manometer. Deze kan worden gehandhaafd door een stalen container te vullen, die via een naaldventiel tussen de luchtoevoer en de vloeistofcontainers in de EC-kooi is geïnstalleerd.De CVIC bestaat uit vier delen. De zen-chip bevindt zich tussen de vet-basis en de vet-kop. Een cilindrische uitlaatconnector is in de vet-kop geschroefd en bevat de referentie-elektrode-assemblage.De referentie-elektrode bestaat uit een gechloreerde zilverdraad met een miniatuur SMC-connector en is gescheiden van het stroompad door een zoutbrug van polyacrylaatgel. Wanneer deze niet in gebruik is, wordt de gelbrugassemblage bewaard in een 100 millimolaire kaliumfosfaatoplossing met pH 7, die 100 millimolair kaliumchloride bevat. Eerst moet de referentie-elektrode worden geplaatst in de referentie-elektrodeassemblage die de gelbrug bevat.Het is belangrijk om luchtbellen te vermijden tijdens het installeren van de referentie-elektrode. Dit deel van de vete wordt nu bevestigd aan de uitlaatconnector, die vooraf is gevuld met buffersolution. Alle verbindingen moeten worden afgedicht met O-ringen.Deze SM is gevormd op een zor-chip, een gestructureerd met gecoat glas bedekt licht. Deze sematische weg heeft een diameter van één millimeter en is via een witte contactstrip van 0,2 millimeter verbonden met het contactplatform. Een veercontactpen vormt het contact met de versterker.De zen-chip wordt donker bewaard in een 10 LAR Okta Deccan thiol ethanol-oplossing. Om de arcane thi-laag te behouden en de niet-geabsorbeerde Okta deccan-virale moleculen te verwijderen, wordt de elektrode gespoeld met pure ethanol en vervolgens gedroogd met stikstofgas. Nu kan de fosfocholine-monolaag worden samengesteld.De lipide-oplossing bevat 15 milligram per milliliter DFI choline en 250 microgram per milliliter Okta twee A mine in decay en wordt bewaard bij -20 °C. De elektrode wordt nu nauwkeurig op de bodem van de SA cubit geplaatst.Voeg één µL van de oplossing toe aan de SSM-elektrode zonder de gouden laag aan te raken. Direct na het toevoegen van de lipidoplossing kan de vete worden gemonteerd. Het door een O-ring afgesloten vete-volume is cilindrisch met een intern volume van 17 µL wanneer deze is gemonteerd.De SSM moet gecentreerd worden onder de inlaatopening. Voordat de vet wordt aangesloten, moet het vloeistofsysteem worden gevuld met een 100 millimolaire kaliumfosfaatbuffersolution. Het is belangrijk om er zeker van te zijn dat er geen luchtbellen in de slang en de kleppen aanwezig zijn.Nu kan de vet worden gemonteerd in de thyroid day cage, waarna de versterker, de in- en uitlaat van het vloeistofstroompad en de functiegenerator worden aangesloten. Ten slotte kan de cubit worden gespoeld met een 100 millimeter kaliumfosfaatbuffer. Dit leidt tot spontane SSM-vorming om de kwaliteit van de SSM te controleren.Capaciteit en conductantie worden gemeten met behulp van de functiegenerator; om de conductantie te meten, wordt een DC-spanning van 100 millivolt gebruikt. Het stroomverval laat de oplading van de membraancapacitor zien nadat de capacitor volledig is opgeladen. De gemeten stroom levert de membraanconductantie op via de wet van Ohm.Hier observeren we een geleidbaarheid van 0,17 nS. De capaciteit kan worden gemeten met een driehoekige AC-spanning van 50 mV piek-tot-piek amplitude en een frequentie van 0,5 Hz. De amplitude van de resulterende blokgolfstroom vertegenwoordigt de laadstroom van de condensator.De capaciteit is gelijk aan de overgedragen lading gedeeld door de aangelegde spanning. Dit membraan vertoont een capaciteit van 2,3 nF; een hoge conductantie en een lage capaciteit geven aan dat de SSM niet correct is gevormd. In dergelijke gevallen moet het membraan worden weggegooid en een nieuwe SSM worden geprepareerd met behulp van een nieuwe elektrodechip.Meestal worden protoliposomen bevroren bewaard bij -80 °C. Dooi het monster op ijs ontdooi. Sonicatie is essentieel omdat een geaggregeerd monster te veel absorbeert; gebruik de SSM om een homogene protoliposoomsuspensie te verkrijgen. Drie sonicatiecycli van tien seconden worden afgewisseld met koelintervallen van tien seconden op ijs.Spoel hun SSM met niet-activerende oplossing. Draai vervolgens de uitlaatconnector samen met het monster van de referentie-elektrode los. Injecteer met een pipet 30 µL van het eiwitmonster via de uitlaat van de vete in het ette-volume.Bevestig eerst de pipetpunt aan de uitlaatopening. Open vervolgens de handmatige klep hierboven in het niet-activerende traject en injecteer de protea-liposomen. Verwijder daarna de pipetpunt.Sluit de handkraan hierboven om verdere doorstroming van de oplossing te voorkomen. Laat de protea-liposomen gedurende een incubatietijd van één tot twee uur absorberen aan het SSM. Gebruik het venster voor het stroomprotocol van de software voor klepbediening en gegevensverwerving om uw stroomprotocol te definiëren.Als u onder symmetrische omstandigheden wilt meten, bijvoorbeeld voor de bepaling van substraatspecificiteit, de KM-waarde of pH-afhankelijkheid, kies dan voor het protocol voor enkelvoudige oplossinguitwisseling. Stel de stroomduur voor elke oplossing in op 0,5 tot 1 seconde. De stroom wordt gedurende het gehele stroomprotocol geregistreerd.De versterking wordt doorgaans ingesteld op 10 tot de macht negen, en voor de bemonsteringssnelheid kiezen we 2000 datapunten per seconde. Sla uw nieuwe protocol tenslotte op onder de titel NA a en a. In het tweede tabblad van het flowprotocolvenster kunt u de open- of gesloten toestand van specifieke kleppen definiëren om de stroom van niet-activerende of activerende oplossing door de qubit te regelen.Hier tonen wij de meting van proteoliposomen met de suiker-proton-symporter LacY uit E. coli. De activerende oplossing bevat het getransporteerde substraat lactose, terwijl de niet-activerende oplossing een gelijke hoeveelheid van het niet-getransporteerde glucose bevat als compenserende verbinding. Naast de suikers bevatten de oplossingen 100 millimolar kaliumfosfaat bij pH 7.6 en één millimolar DTT.Na het wisselen van oplossingen dient de handmatige klep te worden gebruikt om er zeker van te zijn dat luchtbellen zijn verwijderd. Pas de druk vlak voor het starten van de meting aan voordat u begint met een flowprotocol. Wij gebruiken routinematig een druk van O 0,6 bar, wat bij onze specifieke klep- en buisconfiguratie een stroomsnelheid van ongeveer één milliliter per seconde oplevert.Select vervolgens hier een veilig stroomprotocol, het NAA-protocol, en druk op de startknop om elke meting te beginnen. Tijdens de eerste paar metingen worden losjes geabsorbeerde proteoliposomen verwijderd, waardoor de piekstroom kan afnemen. Herhaal de meting totdat de piekstroom constant blijft.Tijdens de eerste fase van de stroom van de niet-activerende oplossing is de stroom nul. De overgang van de niet-activerende naar de activerende oplossing, die lactose bevat, induceert de elektrogene transportactiviteit van het membraan. De positieve lading van het eiwit accumuleert binnenin de proteoliposomen en de versterker detecteert een positieve overgangsstroom als gevolg van positieve koppeling via de SSM.Deze positief gekoppelde stroom wordt het "aan-signaal" genoemd en ontstaat door de activerende oplossing. Terugkeer naar de niet-activerende oplossing induceert proton-suiker-cotransport uit de liposomen. In dit geval wordt een negatief gekoppelde stroom vertoond, het zogenaamde "uit-signaal" voor proteïne-kinetische analyse.Alleen het 'on'-signaal wordt gebruikt, aangezien het 'off'-signaal slecht gedefinieerd is omdat het schakelen van de ladingstoestand van de membraanklep mechanische en elektrische artefacten veroorzaakt. Gelukkig zijn deze beperkt tot een tijdsinterval voorafgaand aan de observatie van de eiwitgeïnduceerde signalen. Let op dat de vertraging van 50 milliseconden tussen de klepschakelartefacten en de transportersignalen de tijd is die de oplossing nodig heeft om zich voort te planten van de eindklep naar het oppervlak van de SSM Rapid Solution Exchange. Een dergelijke uitvoering op de SSM vertegenwoordigt een typisch relaxatie-experiment.In dergelijke experimenten ontspant de stroom zich via een tijdsafhankelijke pre-steady-state fase naar een constante steady-state. Kinetische details van de reactiecyclus kunnen worden afgeleid uit de vorm en grootte van de pre-steady-state stroom, terwijl de steady-state stroom informatie verschaft over de continue omzetting van membraaneiwitten.In het ly-gekoppelde systeem waarbij proteoliposomen zijn geadsorbeerd aan hun SSM, blijven de pre-steady-state-stromen vrijwel ongewijzigd. Hoewel er nooit een constante steady-state-stroom wordt bereikt, neemt de gemeten stroom geleidelijk af als gevolg van de oplading van de liposomen. De transportstroom kan door middel van circuitanalyse worden berekend uit de gemeten ly-gekoppelde stroom.Hier demonstreren we representatieve resultaten met gebruik van de suiker-proton-cotransporter, zoals Y in het PA-bereik tussen 8,5 en 7,6. De transportstroom wordt gedomineerd door een elektrogene reactie laat in de reactiecyclus. Onder deze omstandigheden bestaat de pre-steady state fase uit een eenvoudige stroomstijging naar de steady state waarde.Dit sterft vervolgens af door capacitieve koppeling. Wij zijn geïnteresseerd in de transportstroom in de stationaire toestand. In afwezigheid van een membraanpotentiaal wordt dit goed benaderd door de piekstroom.De Ali Mein-kinetiek kan daarom worden geanalyseerd door de piekstromen voor verschillende substraatconcentraties uit te zetten, maar houd er rekening mee dat amplitudes van de piekstroom alleen strikt kunnen worden vergeleken als ze van één enkele sensor in één experiment zijn verkregen. Een reden hiervoor is de variabiliteit van de absorptie-efficiëntie. Wanneer de pH verder wordt verlaagd, wordt het monofasische signaal bifasisch.Ten slotte blijft er een snelle transiënt over voor de transportdeficiënte lag Y-mutant. De snelle transiënt wordt gevolgd door een kleine, tragere negatieve component. De negatieve component is kenmerkend voor snelle transiëntstroommetingen in ly-gekoppelde systemen en wordt veroorzaakt door de ontlading van de membraancapaciteit.Hier representeert de piekstroom geen steady-state transport, maar eerder een electrogene bevestiging van een transitie vroeg in de ionencyclus; dit wordt duidelijk omdat een lagY-mutant geen steady-state transport vertoont, en voor wildtype lagY het steady-state transport wordt geremd door een lage pH. Het experimentele bewijs biedt een mechanistische interpretatie van de ladingsverplaatsing in de reactiecyclus van lagY, zoals weergegeven in het kinetische model. De snelle transiënt waargenomen voor de transportdeficiënte mutant, of in het geval van wildtype lagY bij zure omstandigheden, is te wijten aan een snelle, zwak electrogene reactie na lactosebinding; bij hogere pH-waarden wordt het signaal gedomineerd door de belangrijkste electrogene reactie laat in de reactiecyclus, waarvan werd voorgesteld dat deze de pseudo-plasmische protonafgifte in het capacitief gekoppelde systeem representeert.Dit leidt tot transiënte stromen die het steady-state transport van Lag y vertegenwoordigen als gevolg van de sterke interactie van de Utes. Met de SSM worden elektrische artefacten gegenereerd wanneer oplossingen van verschillende samenstelling worden uitgewisseld. Zorg ervoor dat niet-activerende en activerende oplossingen zo gelijk mogelijk zijn, met name wat betreft hun pH en ionsterktes.Er moeten controles worden uitgevoerd omdat substraten ook artefacten kunnen produceren. Test altijd uw specifieke buffersysteem en flow-protocol op artefacten met de onbehandelde SSM voordat het eiwitmonster wordt toegevoegd. Na toevoeging van het eiwitmonster kunnen controlemetingen worden uitgevoerd met oplossingen die niet-substraten bevatten die structureel vergelijkbaar zijn met het substraat.Bovendien is het mogelijk om het substraat op artefacten te testen met behulp van liposomen of membraanfragmenten zonder het betreffende eiwit. U kunt ook inhibitoren aan uw oplossingen toevoegen of deze pipetteren. Na het experiment direct bij de uitlaat van de vete om de inhibitie van het transporter-signaal te meten; de eiwitspecifieke signalen zullen dan verdwijnen, waardoor alleen artefacten door vloeistofuitwisseling overblijven.Het eiwitsignaal kan vervolgens eenvoudig worden gecorrigeerd. Zorg ervoor dat het verlies door geabsorbeerd eiwit, liposomen of eiwitdegradatie uw meting niet beïnvloedt. Door herhaalde controlemetingen onder identieke omstandigheden uit te voeren, is een signaalafname tot 20% acceptabel en kan dit worden gecorrigeerd door uit te gaan van een lineaire tijdsafhankelijkheid van de afname.Deze opstelling is het resultaat van 20 jaar technische ontwikkeling in ons laboratorium. Daarnaast zijn er gespecialiseerde systemen beschikbaar met een hogere timer-resolutie voor kinetische analyse en een lager oplossingsverbruik voor dure substraten. Voor drugscreening maken wij gebruik van volledig automatische opstellingen met een hogere doorvoersnelheid.Tot op heden zijn er meer dan 20 transporters gekarakteriseerd met behulp van deze methode. Deze omvatten transport-APA's, ademhalingsketencomplexen, cool transporters, exchangers en zelfs ijkerkanalen. Wanneer u uw probleem dus niet kunt oplossen met standaard elektrofysiologie, overweeg dan om in plaats daarvan SS Mase elektrofysiologie te gebruiken.

introduction-to-solid-supported-membrane-based-electrophysiology

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Planar lipidendubbellagen, ook wel kunstmatige lipidendubbellagen, kunt u om te studeren ionengeleidende kanalen in een goed gedefinieerde omgeving. Hier tonen we de individuele stappen die nodig zijn om de bilaag kamer voor te bereiden, de elektroden en hoe om te testen dat de bilaag is geschikt voor single-channel metingen.

Voorbereiding van de Kunstmatige dubbellagen voor Elektrofysiologie Experimenten

We zullen zien hoe het effect van een enkele puntmutatie op de functie van een ionkanaal studie.

Mutagenese en Functionele analyse van ionenkanalen heteroloog Uitgedrukt in zoogdiercellen

Dit is een demonstratie van hoe biologische membranen kan worden begrepen het gebruik van elektrische modellen. We tonen ook aan procedures voor de registratie actiepotentialen uit het ventrale zenuw snoer van de rivierkreeft voor student-georiënteerde laboratoria.

Modelleren van biologische membranen met Circuit Boards en meten van elektrische signalen in Axonen: Student Laboratorium Oefeningen

Dit protocol beschrijft een techniek genaamd whole-cell patch clamp electrophysiology, een methode om elektrische eigenschappen van Mauthner neuronen en andere reticulospinale cellen in zebravisembryo's te bestuderen.

Whole-Cell Patch Clamp Electrophysiology: een methode om elektrische eigenschappen van neuronen te bestuderen

Multi-elektrode patch-clamp vormen een complexe taak. Hier laten we zien hoe, door het automatiseren van veel van de experimentele stappen is het mogelijk om het proces dat tot kwalitatieve verbetering van de prestaties en het aantal opnamen versnellen.

Een Computer-assisted Multi-elektrode Patch-clamp System

Gesloten-lus protocollen worden steeds gebruikelijker in de moderne elektrofysiologie. We presenteren een eenvoudige, veelzijdige en goedkope manier om complexe elektrofysiologische protocollen uit te voeren in corticale piramidale neuronen in vitro, met behulp van een desktopcomputer en een digitale acquisitiekaart.

Real-time Electrofysiologie: Met behulp van Closed-loop protocollen bij Probe Neuronale Dynamics and Beyond

Dit manuscript beschrijft de toepassingen van proton-Ionselectieve electroden en patch klemmen van methoden voor het meten van de activiteit van proton vervoerssystemen. Deze methoden zijn sommige beperkingen van technieken gebruikt bij het bestuderen van proton vervoersactiviteit, zoals matige gevoeligheid, resolutie van de tijd en onvoldoende intracellulaire milieu controle.

Toepassing van electrofysiologie meting op het bestuderen van de activiteit van Electro-neutrale Transporters

Hier presenteren we een protocol voor de vorming van lipide-bilayers met behulp van een contact zeepbel dubbelgelaagde methode. Een water-zeepbel is geblazen in een organisch oplosmiddel, waarbij een monolayer wordt gevormd op het grensvlak water / olie. Twee pipetten zijn gemanipuleerd om het dok van de belletjes vormen een dubbelgelaagde.

Lipide dubbelgelaagde experimenten met Contact Bubble Bilayers voor Patch-Clampers

Dit protocol schetst geavanceerde materiaalfabricage en ex vivo rattenhartmethoden voor optische en elektrische bidirectionele bio-interfacing, waardoor nauwkeurige hartstimulatie, registratie en infarctmodellering voor bio-elektronicaonderzoek mogelijk zijn.

Bidirectionele elektrische en opto-elektronische interfaces in gezonde en ischemische ex vivo rattenharten

Hier presenteren we een protocol om een uniek tweelaags microfluïdisch apparaat te fabriceren om de elektromechanische regulatie van de homeostase van epitheelweefsel te bestuderen. Het apparaat past statische fysiologische elektrische stromen toe die loodrecht op het weefselvlak staan, wat van invloed is op de adhesie, proliferatie en extrusie van cellen tot cel. Beeldvorming van levende cellen en mechanische stressmetingen onthullen mechanismen van deze processen.

Onthullende elektromechanische controle van weefselhomeostase met behulp van een tweelaags microfluïdisch apparaat

Er wordt een experimenteel protocol gepresenteerd om gramicidine A-gedoopeerde druppelinterface-dubbellagen samen te stellen, elektrisch te stimuleren en te analyseren. Relaties tussen lipide-eiwitstructuur en -functie worden gekwantificeerd door veranderingen in membraanoppervlakte, ionische flux en enkelkanaalgeleidbaarheid te meten, en deze responsen te relateren aan plasticiteitsachtige veranderingen in ionische geleiding in een membraanmodel geïnspireerd door elektrische synapsen.

Lipid-eiwitmembraan structuur-functie karakterisering met behulp van druppelinterface-dubbellagen

Leer SSM-gebaseerde elektrofysiologie voor het karakteriseren van elektrogene membraantransporteurs. Deze methode detecteert ladingsverplaatsing via vaste ondersteunde membraanelektroden en is ideaal voor basisonderzoek en drug discovery.

Inleiding tot de vaste Ondersteunde Membrane Gebaseerd Electrofysiologie

Meer video's verkennen