Name: Isolatie van Human atriale Myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca 2 + Transients en Membraan Currents (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Leer de isolatie van humane atriale myocyten voor gelijktijdige metingen van calciumtransiënten en membraanstromen. Deze methode helpt onderzoekers de moleculaire basis van hartritmestoornissen te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Daarnaast danken wij de hartchirurgen aan de Universiteit van Heidelberg voor de levering van menselijke atriale weefsel en Claudia Liebetrau, Katrin Kupser en Ramona Nagel voor hun uitstekende technische ondersteuning. Speciale dank ook aan Andy W. Trafford voor zijn nuttige suggesties en adviezen tijdens de oprichting van de Ca 2 + voorbijgaande metingen. De auteurs willen hun diepste dank betuigen aan de leden van de afdeling Farmacologie en Toxicologie (hoofd: Ursula Ravens) van de Technische universiteit van Dresden voor de kans die ze bood ons aan basistechnieken en vaardigheden in cellulaire elektrofysiologie en cardiomyocyte isolement te leren. Onderzoek van de auteurs wordt gesteund door de Duitse Research Foundation (Do769/1-1-3), het Duitse Federale Ministerie van Onderwijs en Onderzoek door het boezemfibrilleren Competence Network (01Gi0204) en het Duitse Centrum voor Cardiovasculair Onderzoek, de Europese Unie via de Europese Network for Translational Research in boezemfibrilleren (EUTRAF, FP7-HEALTH-2010, grootschalige integrerende projecten, Voorstel nr. 261057) en het Europees-Noord-Amerikaanse Boezemfibrilleren Research Alliance (ENAFRA) toekenning van Fondation Leducq (07CVD03). Het schematisch overzicht weergegeven in het videobestand werd geproduceerd met behulp van Servier medische kunst.

Experimentele protocollen moeten worden goedgekeurd door de lokale ethische commissie en alle patiënten moeten schriftelijk toestemming geven. Ons onderzoek werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Medische Faculteit Mannheim, Universiteit van Heidelberg (# 2011-216N-MA) en werd uitgevoerd in overeenstemming met alle institutionele, nationale en internationale richtlijnen voor het menselijk welzijn. Alle patiënten gaven schriftelijk toestemming. 0. Verkrijgen Human Atrial Tissue Tijdens routine canulatie procedures bij patiënten die openhartchirurgie voor cardiopulmonale bypass, wordt het uiteinde van de rechter hartoor meestal verwijderd en kan worden gebruikt voor isolatie van atriale cardiomyocyten. Na excisie het weefselmonster onmiddellijk overgebracht in een 50 ml Falcon buis met steriele Ca 2 +-free transport oplossing die 2,3-butaandion monoxime (Tabel I; BDM, contractiele inhibitor, waardoor myocyten contracture). Met transporttijden tussen 30 en 45 minuten, we hebben niet een duidelijk voordeel van het koelen of zuurstof te herkennen met betrekking tot zowel het aantal en de kwaliteit van geïsoleerde atriale hartspiercellen. In het algemeen het vervoer naar het laboratorium moet zo snel mogelijk. Indien langere vervoerstijd niet kan worden vermeden, transport bij 4 ° C in geoxygeneerde oplossing kan voordelig zijn. 1. Prearrangements <ol><li> Schakel de thermocirculator, dat de temperatuur van de mantel voorziene beker (tabel II) regelt. Zorg ervoor dat de temperatuur in de beker is gelijk aan 37 ° C. Dek het bekerglas af met een glazen deksel op een constante temperatuur in de beker te behouden gedurende de gehele isolatie proces. </li><li> Weeg de Collagenase I en protease XXIV in drie glazen bekers en bewaar deze op kamertemperatuur. De enzymen worden verdund vlak voor gebruik. </li><li> WINKEL 20 ml Ca2 +-vrije oplossing in een petrischaal bij 4 ° C. </li><li>WINKEL 250 ml Ca 2 +-vrije oplossing in een waterbad bij 37 ° C. </li></ol> 2. Reinigen van het Weefsel <ol><li> Overdracht samen het weefselmonster met de transport-oplossing in een petrischaal (~ 10 cm diameter) en verwijder vetweefsel ruwweg met een schaar. </li><li> Weeg het weefselmonster. Tussen 200 en 600 mg worden gebruikt voor celisolatie. Restmateriaal kan worden ingevroren in vloeibare stikstof voor latere biochemische analyse. </li><li> Breng het weefselmonster in de petrischaal met 20 ml Ca2 +-vrije oplossing bij 4 ° C (zie stap 1.3) en hak het weefselmonster in kleine stukjes van ongeveer 1 mm3 groot. </li><li> De volgende stappen worden uitgevoerd bij 37 ° C en onder continu begassen met 100% O2. Een pipet tip kan op de zuurstofslang worden geplaatst om sterke borrelen voorkomen en het genereren van continue luchtstroom. </li><li> Breng de stukken weefsel met de Ca2 +-vrije oplossingvoor het dubbelwandige beker en voorzichtig roeren gedurende 3 min met een magnetische roerstaaf. </li><li> Stop met roeren en laat het weefsel brokken om neer te strijken voor een paar seconden. De stam van de bovenstaande vloeistof voorzichtig door een nylon (200 micrometer, tabel II). Terug de ingetogen weefsel brokken uit het gaas in de beker met behulp van een tang. </li><li> Vul het bekerglas met Ca 2 + gratis oplossing en herhaal de wasstap 2.4 en 2.5 twee keer. </li></ol> 3. Eerste enzymatische spijsvertering <ol><li> Resuspendeer de weefsel brokken met 20 ml Enzymoplossing E1 (Tabel I) die collagenase en protease en zorgvuldig roer gedurende 10 minuten. </li><li> Voeg 40 ul van 10 mM CaCl2-oplossing tot een eindconcentratie van 20 uM Ca2 + te verkrijgen. </li><li> Na 35 min zeef het supernatant voorzichtig door een nylon mesh (200 urn, tabel II) op een manier dat de meeste stukjes weefsel blijven in het bekerglas. Terug rustregende weefsel brokken uit het gaas in de beker. </li></ol> 4. Tweede enzymatische spijsvertering <ol><li> Resuspendeer het weefsel brokken opnieuw met 20 ml enzymoplossing E2 met alleen I collagenase (Tabel I). Voeg 40 ul van 10 mM CaCl2-oplossing direct tot een uiteindelijke concentratie van 20 uM Ca2 + te verkrijgen. </li><li> Tijdens het tweede spijsvertering gebruik schaar om verder te hakken weefsel stolsels af. </li><li> Na 5 min nemen een monster met behulp van een Pasteur pipet om de dissociatie van de cellen te controleren. Herhaal dit elke 2-3 min tot staafvormige, gegroefde hartspiercellen verschijnen. </li><li> Stop met roeren en laat het weefsel brokken om neer te strijken voor ongeveer 20-30 sec. </li><li> Zeef de bovenstaande vloeistof voorzichtig door een nylon (200 micrometer, tabel II) in een 50 ml Falcon buis (buis A). Terug de ingetogen weefsel brokken uit het gaas in de beker. </li><li> Resuspendeer de weefsel brokken in het bekerglas met 20 ml storage oplossing (Tabel I) 10 en verder distantiëren van de cellen door zachte mechanische trituratie met behulp van een 20 ml serologische pipet met dispenser. Probeer te blaasvorming te vermijden, omdat bubbels zijn nadelig voor overleving van de cel en de kwaliteit. </li><li> Zeef de bovenstaande vloeistof voorzichtig door een nylon (200 micrometer, tabel II) in een 50 ml Falcon buis (buis B). </li></ol> 5. Final Voorbereiding en aanpassing van Final Ca 2 + Concentratie <ol><li> Centrifugeer beide Falcon buizen A en B (zie stap 4,5 en 4,7) bij 95 g gedurende 10 minuten. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof uit beide tubes voorzichtig door aspiratie. Zorg ervoor dat de pellet niet te verstoren. Verwijder het supernatant. </li><li> Resuspendeer zowel pellets in 1,5 ml storage-oplossing (Tabel I) elk (kamertemperatuur). </li><li> Voeg twee keer 7,5 ul van 10 mM CaCl2-oplossing in elk Falcon en roer voorzichtig. Incubeer gedurende 10 minuten na elke stap. </li><li>Voeg 15 ul van 10 mM CaCl2-oplossing tot een uiteindelijke Ca2 + concentratie van 0,2 mM te verkrijgen. </li></ol> 6. Laden van Myocyten met de TL-Ca 2 +-indicator Fluo-3 AM (figuur 1) <ol><li> Breng 1,5 ml celsuspensie (buis A en / of buis B) in een 2 ml microcentrifugebuis (Eppendorf buis). </li><li> De volgende stappen moeten worden uitgevoerd met inachtneming van de lichtgevoeligheid van de fluorescerende Ca 2 +-indicator Fluo-3. </li><li> Los 50 pg van het membraan permeabele acetoxymethylester derivaat van Fluo-3 (Fluo-3 AM Tabel III) in 44 pl van het Pluronic F-127 (Tabel III) stock oplossing (20% w / v in watervrij DMSO) om een 1 mM Fluo-3:00 voorraadoplossing, die bij -20 ° C gedurende maximaal 1 week kan worden opgeslagen. </li><li> Voeg 15 ul van de Fluo-03:00 stockoplossing aan de microcentrifugebuis met 1,5 ml celsuspensie (zie stap 6.1) en schudzorgvuldig. </li><li> Incubeer de celsuspensie gedurende 10 min in een optisch ondoorzichtige doos. </li><li> Kort centrifugeren bij ongeveer 6000 rpm. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1,5 ml bad-oplossing (tabel IV). </li><li> Laat de celsuspensie gedurende ongeveer 30 min voor ontestering alvorens te beginnen met experimenten. </li></ol> 7. Gelijktijdige Patch-clamp en epifluorescerende Ca 2 + Metingen Sinds patch-clamp metingen zijn niet het belangrijkste onderwerp van deze beoordeling, verwijzen we de geïnteresseerde lezer naar andere publicaties met een meer diepgaande beschrijving van deze techniek. 11-14 Voor de volledigheid hebben we een korte samenvatting van een protocol voor het meten actiepotentialen of L-type Ca2 + stromen, zowel samen met gelijktijdige Ca 2 +-voorbijgaande opnamen. Tijdens experimenten myocytes worden superfused bij 37 ° C met bad solutiop (Tabel IV) met behulp van een snelle perfusie-systeem (Octaflow IITM, ALA Scientific Instruments, NY). Voor voltage-clamp experimenten worden K + stromen geblokkeerd door toevoeging van 4-aminopyridine (5 mmol / L) en BaCl2 (0,1 mmol / L) aan de badoplossing. Borosilicaatglas micro-elektroden worden gebruikt en moeten tip weerstanden van 2-5 MQ wanneer gevuld met pipet oplossing (tabel V). Naast de Fluo-3:00 laden van de myocyten (zie stap 6) wordt Fluo-3 ook in de pipet-oplossing (Tabel V). Fluorescentie is enthousiast bij 488 nm en uitgezonden licht (&lt;520 nm) omgezet in [Ca 2 +] i in de veronderstelling <img alt="Vergelijking 1" fo:content-width="1.540in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1.jpg" /> waarbij k d = dissociatie constante van Fluo-3 (864 nM), F = Fluo-3 fluorescentie;. F max = Ca 2 +-verzadigde fluorescentie verkregen aan het einde van elk experiment 12 Zowel elektrische signalen en epifluorescerende Ca2 + signalen simultaan opgenomen. Actiepotentialen worden gestimuleerd bij 0,5 Hz in de huidige-clamp-modus met 1 msec stroom pulsen van 1,2 x drempel kracht. L-type Ca2 +-stromen worden gemeten voltage-clamp modus met een holding potentiaal van -80 mV en 100 msec ramp-puls naar -40 mV aan de snelle Na +-stroom, gevolgd door inactiveren 100 msec proef-puls naar 10 mV bij 0,5 Hz.

<ol><li>Wakili, R., Voigt, N., Kaab, S., Dobrev, D., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+molecular+pathophysiology+of+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the molecular pathophysiology of atrial fibrillation.</a> J. Clin. Invest. 121, 2955-2968 (2011).</li>
<li>Margaret, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsation%2C+migration+and+division+in+dissociated+chick+embryo+heart+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro.</a> Journal of Experimental Zoology. 128, 573-589 (1955).</li>
<li>Bustamante, J. O., Watanabe, T., Murphy, D. A., McDonald, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+single+atrial+and+ventricular+cells+from+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+Med.+Assoc.+J%22%5BJournal%5D)">Isolation of single atrial and ventricular cells from the human heart.</a> Can. Med. Assoc. J. 126, 791-793 (1982).</li>
<li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-Protein+%CE%B23-subunit+825T+allele+is+associated+with+enhanced+human+atrial+inward+rectifier+potassium+currents%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">G-Protein β3-subunit 825T allele is associated with enhanced human atrial inward rectifier potassium currents.</a> Circulation. 102, 692-697 (2000).</li>
<li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+phosphorylation-dependent+regulation+of+constitutively+active+and+muscarinic+receptor-activated+IK%2CACh+channels+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Differential phosphorylation-dependent regulation of constitutively active and muscarinic receptor-activated IK,ACh channels in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Cardiovasc. Res. 74, 426-437 (2007).</li>
<li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+IK%2CACh+current+may+contribute+to+clinical+efficacy+of+class+I+and+class+III+antiarrhythmic+drugs+in+patients+with+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Naunyn.+Schmiedebergs+Arch.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of IK,ACh current may contribute to clinical efficacy of class I and class III antiarrhythmic drugs in patients with atrial fibrillation.</a> Naunyn. Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 381, 251-259 (2010).</li>
<li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+G+protein-gated+potassium+current+IK%2CACh+is+constitutively+active+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">The G protein-gated potassium current IK,ACh is constitutively active in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 112, 3697-3706 (2005).</li>
<li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-to-right+atrial+inward+rectifier+potassium+current+gradients+in+patients+with+paroxysmal+versus+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Arrhythm.+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Left-to-right atrial inward rectifier potassium current gradients in patients with paroxysmal versus chronic atrial fibrillation.</a> Circ. Arrhythm. Electrophysiol. 3, 472-480 (2010).</li>
<li>Amos, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+between+outward+currents+of+human+atrial+and+subepicardial+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differences between outward currents of human atrial and subepicardial ventricular myocytes.</a> J. Physiol. 491 (Pt. 1), 31-50 (1996).</li>
<li>Feng, J., Xu, D., Wang, Z., Nattel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrarapid+delayed+rectifier+current+inactivation+in+human+atrial+myocytes%3A+properties+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ultrarapid delayed rectifier current inactivation in human atrial myocytes: properties and consequences.</a> Am. J. Physiol. 275, H1717-H1725 (1998).</li>
<li>Voigt, N., Makary, S., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-clamp-based+methods+for+the+detection+of+constitutively+active+acetylcholine-gated+IK%2CACh+channels+in+the+diseased+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Voltage-clamp-based methods for the detection of constitutively active acetylcholine-gated IK,ACh channels in the diseased heart.</a> Methods Enzymol. 484, 653-675 (2010).</li>
<li>Trafford, A. W., Diaz, M. E., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+rapid+and+reversible+method+to+measure+Ca2%2B+buffering+and+time-course+of+total+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+content+in+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">A novel, rapid and reversible method to measure Ca2+ buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in cardiac ventricular myocytes.</a> Pflugers Arch. 437, 501-503 (1999).</li>
<li>Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proarrhythmic+atrial+calcium+cycling+in+the+diseased+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proarrhythmic atrial calcium cycling in the diseased heart.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 740, 1175-1191 (2012).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).</li>
<li>Voigt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+leak+and+increased+Na%2B-Ca2%2B+exchanger+function+underlie+delayed+afterdepolarizations+in+patients+with+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation.</a> Circulation. 125, 2059-2070 (2012).</li>
<li>Berry, M. N., Friend, D. S., Scheuer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+metabolism+of+intact+muscle+cells+isolated+from+adult+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Morphology and metabolism of intact muscle cells isolated from adult rat heart.</a> Circ Res. 26, 679-687 (1970).</li>
<li>Farmer, B. B., Mancina, M., Williams, E. S., Watanabe, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+calcium+tolerant+myocytes+from+adult+rat+hearts%3A+review+of+the+literature+and+description+of+a+method%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Isolation of calcium tolerant myocytes from adult rat hearts: review of the literature and description of a method.</a> Life Sci. 33, 1-18 (1983).</li>
<li>Zimmerman, A. N., Hulsmann, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+influence+of+calcium+ions+on+the+permeability+of+the+cell+membranes+of+the+isolated+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart.</a> Nature. 211, 646-647 (1966).</li>
<li>Bielecki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+changes+in+pH+of+the+perfusion+fluid+on+the+occurrence+of+the+calcium+paradox+in+the+isolated+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Res%22%5BJournal%5D)">The influence of changes in pH of the perfusion fluid on the occurrence of the calcium paradox in the isolated rat heart.</a> Cardiovasc. Res. 3, 268-271 (1969).</li>
<li>Kramer, J. H., Chovan, J. P., Schaffer, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+taurine+on+calcium+paradox+and+ischemic+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of taurine on calcium paradox and ischemic heart failure.</a> Am. J. Physiol. 240, H238-H246 (1981).</li>
<li>Rich, T. L., Langer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+depletion+in+rabbit+myocardium.+Calcium+paradox+protection+by+hypothermia+and+cation+substitution%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Calcium depletion in rabbit myocardium. Calcium paradox protection by hypothermia and cation substitution.</a> Circ. Res. 51, 131-141 (1982).</li>
<li>Isenberg, G., Klockner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+tolerant+ventricular+myocytes+prepared+by+preincubation+in+a+%22KB+medium%22%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a "KB medium".</a> Pflugers Arch. 395, 6-18 (1982).</li>
<li>Diaz, M. E., Trafford, A. W., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+exogenous+calcium+buffers+on+the+systolic+calcium+transient+in+rat+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">The effects of exogenous calcium buffers on the systolic calcium transient in rat ventricular myocytes.</a> Biophys. J. 80 (01), 1915-1925 (2001).</li>
<li>Worthington, K., Worthington, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWorthington%2C+K+%22Worthington+Enzyme+Manual%22">Worthington Enzyme Manual</a>. , (1993).</li>
<li>Christ, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology-specific+effects+of+the+IKur%2FIto%2FIK%2CACh+blocker+AVE0118+on+ion+channels+in+human+chronic+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pathology-specific effects of the IKur/Ito/IK,ACh blocker AVE0118 on ion channels in human chronic atrial fibrillation.</a> Br. J. Pharmacol. 154, 1619-1630 (2008).</li>
<li>Dobrev, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+downregulation+of+G-protein-coupled+inward+rectifying+K%2B+current+IK%2CACh+in+chronic+human+atrial+fibrillation%3A+decrease+in+GIRK4+mRNA+correlates+with+reduced+IK%2CACh+and+muscarinic+receptor-mediated+shortening+of+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of downregulation of G-protein-coupled inward rectifying K+ current IK,ACh in chronic human atrial fibrillation: decrease in GIRK4 mRNA correlates with reduced IK,ACh and muscarinic receptor-mediated shortening of action potentials.</a> Circulation. 104, 2551-2557 (2001).</li>
<li>Hatem, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+compartments+of+sarcoplasmic+reticulum+participate+in+the+excitation-contraction+coupling+process+in+human+atrial+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Different compartments of sarcoplasmic reticulum participate in the excitation-contraction coupling process in human atrial myocytes.</a> Circ. Res. 80, 345-353 (1997).</li>
<li>Heidbuchel, H., Vereecke, J., Carmeliet, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+different+potassium+channels+in+human+atrium.+Contribution+to+the+basal+potassium+conductance%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Three different potassium channels in human atrium. Contribution to the basal potassium conductance.</a> Circ. Res. 66, 1277-1286 (1990).</li>
<li>Hove-Madsen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+fibrillation+is+associated+with+increased+spontaneous+calcium+release+from+the+sarcoplasmic+reticulum+in+human+atrial+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Atrial fibrillation is associated with increased spontaneous calcium release from the sarcoplasmic reticulum in human atrial myocytes.</a> Circulation. 110, 1358-1363 (2004).</li>
<li>Molina, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+adenosine+monophosphate+phosphodiesterase+type+4+protects+against+atrial+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Cyclic adenosine monophosphate phosphodiesterase type 4 protects against atrial arrhythmias.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 59, 2182-2190 (2012).</li>
</ol>

Worthington Biochemische Corp ondersteund deze publicatie door het bedekken van de productiekosten van een videobestand. De financiers hadden geen rol in de onderzoeksopzet, dataverzameling en-analyse, besluit tot publicatie, of voorbereiding van het manuscript.

Hier beschrijven we een werkwijze voor het isoleren van menselijke atriale myocyten van rechts hartoren verkregen van patiënten die een openhartoperatie. Om deze myocyten gebruiken voor metingen van cytosolische Ca 2 + pasten wij een eerder beschreven werkwijze 4-11 door niet EGTA de opslagoplossing. Al in 1970 werd geconstateerd dat hoewel myocyten dissociëren bij aanwezigheid van Ca 2 + tijdens de spijsvertering, ze waren in contractuur en niet-levensvatbaar. 16,17 Daarom wordt celisolatie uitgevoerd in Ca 2 +-free oplossing. De herintroductie van fysiologische concentraties van Ca 2 + resulteerde in een snelle Ca2 + influx en celdood. Dit is beschreven als de Ca2 + paradox verschijnsel dat oorspronkelijk werd waargenomen in geperfundeerde harten door Zimmerman en Hulsman. 18 Modificaties van de isolatiemedia waaronder vermindering van de pH tot 7,0, &lt;sup&gt; 19 toevoeging van taurine 20 of van kleine hoeveelheden Ca 2 + (zie stap 3.2 en 4.1), 21 alsmede opslag van geïsoleerde myocyten in EGTA met storage-oplossing 22 zijn voorgesteld de Ca 2 + paradox. 17 te voorkomen Het is echter bekend dat Ca2 + buffering door EGTA reduceert de amplitude van het L-type Ca2 + stroom-geïnduceerde Ca2 + voorbijgaande amplitudes en resulteert in een bifasisch verval van de Ca2 + transiënten. 23 Daarom hebben we weggelaten EGTA het gehele isolatie proces om Ca2 + transiënten verkrijgen met karakteristieke eigenschappen en monofasische vervalt. Om de cellen tegen de Ca 2 + paradox verhoogden we de uiteindelijke Ca2 + concentratie van de storage oplossing stapsgewijs tot 0,2 mM. De keuze van collagenase is waarschijnlijk de meest kritische stap voor een succesvolle myocyten isolatie. Conventionele collagenases zijn ruwe bereidingen uit Clostridium histolyticum en bevatten collagenase naast een aantal andere proteasen, polysaccharidases en lipasen. Algemeen genomen samenstelling collagenase worden onderverdeeld in verschillende soorten. Worthington 24 collagenase type I en II met succes gebruikt voor de isolatie van menselijke atriale myocyten. 4-10,15,25-30 In het hier beschreven protocol aanbevolen het gebruik van collagenase Type I, maar we waren ook in staat om aanvaardbare hoeveelheid levensvatbare cellen met behulp van collagenase type II te verkrijgen. Zelfs binnen een collagenase Type er een significante variatie van partij tot partij met betrekking tot de enzymactiviteit. Deze variaties vereisen zorgvuldige batch selectie en het testen van de verschillende partijen om isolatieprocedure optimaliseren. De online beschikbare batch-selectietool van Worthington Biochemical Corp ( <a href="http://www.worthington-biochem.com/cls/match.php" target="_blank">http://www.worthington-bio</a>chem.com / cls / match.php) worden gebruikt om beschikbare batches vinden met een samenstelling die geschikt gebleken voor de isolatie van menselijke atriale myocyten zijn. Momenteel gebruiken we collagenase type I met 250 U / mg collagenase activiteit, 345 U / mg caseinase activiteit, 2,16 U / mg clostripain activiteit en 0,48 U / mg tryptic activiteit (lot # 49H11338). De cellen verkregen volgens de in dit manuscript beschreven procedure kan worden gebruikt binnen 8 hr voor patch-clamp studies, Ca2 + voorbijgaande metingen en een combinatie van beide. 15 Bovendien zijn deze cellen mogelijk metingen van cellulaire contractie in respons op elektrische veld stimulatie of elektrische stimulatie met behulp van de patch-clamp pipet (ongepubliceerde waarnemingen).

Studeren elektrofysiologische eigenschappen van de cardiale ionenkanalen met de patch-clamp techniek en de verkenning van cellulaire Ca 2 + handling afwijkingen vereisen geïsoleerde hartspiercellen. Deze worden gewoonlijk verkregen bij de in vitro blootstelling van hartweefsel monsters spijsverteringsenzymen (collagenase, hyaluronidase, peptidase etc.). Aangezien het eerste rapport van isolatie van levensvatbare hartspiercellen in 1955 2 een grote hoeveelheid protocollen ontwikkeld om enkele atriale en ventriculaire hartspiercellen oogsten van verschillende species, waaronder muis, rat, konijn, hond, cavia en mens. In deze review richten we ons op de isolatie van humane atriale myocyten. Betrekking tot de procedures voor de isolatie van myocyten van andere soorten wordt verwezen naar het &quot;Worthington Tissue Dissociation guide&quot; die door Worthington Biochemical Corp, USA ( <a href="http://www.tissuedissociation.com" target="_blank">www.tissuedissociation.com</a> ). et al.. 3 Hier geven we een stap voor stap beschrijving van een techniek, die is aangepast van een eerder gepubliceerde methode, teneinde werkwijze vinden atriale myocyten niet alleen geschikt voor patch-clamp experimenten maar ook voor gelijktijdige intracellulaire Ca2 + metingen. 4-11

<table><tbody><tr><td> </td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Transportoplossing&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Albumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td>&lt;em&gt;Bewaaroplossing&lt;/em&gt;: 1%</td></tr><tr><td>BDM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31550</td><td>&lt;em&gt;Transportoplossing&lt;/em&gt;: 30</td></tr><tr><td>DL-β-hydroxyboterzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6501</td><td>&lt;em&gt;Bewaaroplossing&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>&lt;em&gt;Transportoplossing&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca²⁺-vrije oplossing&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzymoplossing E1 en E2&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Bewaaroplossing&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>L-glutaminezuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1251</td><td>&lt;em&gt;Bewaaroplossing&lt;/em&gt;: 70</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Transportoplossing&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca²⁺-vrije oplossing&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzymoplossing E1 en E2&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Bewaaroplossing&lt;/em&gt;: 20</td></tr><tr><td>KH₂PO₄</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>&lt;em&gt;Transportoplossing&lt;/em&gt;: 1,2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca²⁺-vrije oplossing&lt;/em&gt;: 1,2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzymoplossing E1 en E2&lt;/em&gt;: 1,2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Bewaaroplossing&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>MgSO₄</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9397</td><td>&lt;em&gt;Transportoplossing&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca²⁺-vrije oplossing&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzymoplossing E1 en E2&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td>&lt;em&gt;Transportoplossing&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca²⁺-vrije oplossing&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzymoplossing E1 en E2&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>&lt;em&gt;Transportoplossing&lt;/em&gt;: 100&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca²⁺-vrije oplossing&lt;/em&gt;: 100&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzymoplossing E1 en E2&lt;/em&gt;: 100</td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86330</td><td>&lt;em&gt;Transportoplossing&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca²⁺-vrije oplossing&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzymoplossing E1 en E2&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Bewaaroplossing&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td><a href="http://www.worthington-biochem.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Worthington</a></td><td>4196</td><td>&lt;em&gt;Enzymoplossing E1 en E2&lt;/em&gt;: 286 U/ml</td></tr><tr><td>Protease XXIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8038</td><td>&lt;em&gt;Enzymoplossing E1 en E2&lt;/em&gt;: 5 U/ml*</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Transportoplossing&lt;/em&gt;: 7,00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca²⁺-vrije oplossing&lt;/em&gt;: 7,00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzymoplossing E1 en E2&lt;/em&gt;: 7,00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Bewaaroplossing&lt;/em&gt;: 7,40</td></tr><tr><td>bijgesteld met</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Transportoplossing&lt;/em&gt;: 1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca²⁺-vrije oplossing&lt;/em&gt;: 1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzymoplossing E1 en E2&lt;/em&gt;: 1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Bewaaroplossing&lt;/em&gt;: 1 M KOH</td></tr><tr><td colspan="4">Concentraties in mM tenzij anders vermeld. BDM, 2,3-butaandionmonoxiem. *Protease XXIV is alleen opgenomen in enzymoplossing E1.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabel I. Oplossingen.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nylon gaas (200 &amp;#956;m)</td><td>VWR-Germany</td><td>510-9527</td><td></td></tr><tr><td>Gemanchetteerd reactiebekerglas</td><td>VWR</td><td>KT317000-0050</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabel II. Specifieke apparatuur.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3 AM (speciale verpakking)</td><td>Invitrogen</td><td>F-1242</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabel III. Stoffen voor belading van myocyten met Fluo-3 AM.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-aminopyridine*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A78403</td><td>&lt;em&gt;Badoplossing&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>BaCl₂*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342920</td><td>&lt;em&gt;Badoplossing&lt;/em&gt;: 0,1</td></tr><tr><td>CaCl₂ &amp;#215; 2H₂O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td>&lt;em&gt;Badoplossing&lt;/em&gt;: 2</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>&lt;em&gt;Badoplossing&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td>&lt;em&gt;Badoplossing&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Badoplossing&lt;/em&gt;: 4</td></tr><tr><td>MgCl &amp;#215; 6H₂O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td>&lt;em&gt;Badoplossing&lt;/em&gt;: 1</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>&lt;em&gt;Badoplossing&lt;/em&gt;: 140</td></tr><tr><td>Probenecide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761</td><td>&lt;em&gt;Badoplossing&lt;/em&gt;: 2</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Badoplossing&lt;/em&gt;: 7,35</td></tr><tr><td>bijgesteld met</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Badoplossing&lt;/em&gt;: 1 M HCl</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabel IV. Badoplossing voor patch-clamp.&lt;/strong&gt; *4-aminopyridine en BaCl waren alleen opgenomen voor voltage-clamp experimenten.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DL-aspartaat K⁺-zout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2025</td><td>&lt;em&gt;Pipetopplossing&lt;/em&gt;: 92</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>&lt;em&gt;Pipetopplossing&lt;/em&gt;: 0,02</td></tr><tr><td>GTP-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9002</td><td>&lt;em&gt;Pipetopplossing&lt;/em&gt;: 0,1</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td>&lt;em&gt;Pipetopplossing&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Pipetopplossing&lt;/em&gt;: 48</td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>&lt;em&gt;Pipetopplossing&lt;/em&gt;: 1</td></tr><tr><td>Na₂ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td>&lt;em&gt;Pipetopplossing&lt;/em&gt;: 4</td></tr><tr><td>Fluo-3**</td><td>Invitrogen</td><td>F3715</td><td>&lt;em&gt;Pipetopplossing&lt;/em&gt;: 0,1</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>7,20</td></tr><tr><td>bijgesteld met</td><td></td><td></td><td>1 M KOH</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabel V. Pipetopplossing voor patch-clamp*. &lt;/strong&gt;*Op experimentele dagen wordt de pipetopplossing op ijs bewaard tot gebruik. **Fluo-3 wordt op experimentele dagen toegevoegd vanuit een 1 mM stockoplossing.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van human atriale myocyten voor gelijktijdige metingen van ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; transients en membraan currents

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

De studie van de elektrofysiologische eigenschappen van de cardiale ionenkanalen met de patch-clamp techniek en de verkenning van cardiale cellulaire Ca 2 + behandeling van afwijkingen vereist geïsoleerde hartspiercellen. Bovendien is de mogelijkheid om myocyten onderzoeken van patiënten met behulp van deze technieken is een waardevol vereiste om de moleculaire basis van hartaandoeningen zoals atriale fibrillatie (AF) te helderen. 1 Hier beschrijven we een werkwijze voor het isoleren van menselijke atriale myocyten die geschikt zijn voor beide patch-clamp studies en gelijktijdige meting van intracellulaire Ca2 + concentraties. Eerst worden rechts hartoren verkregen van patiënten die een openhartoperatie gesneden in kleine stukjes weefsel (&quot;chunk method&quot;) en in Ca2 +-vrije oplossing gewassen. Dan het weefsel brokken verteerd in collagenase en protease bevattende oplossingen met 20 uM Ca2 +. Daarna, de geïsoleerde myocyten zijn harvested door filtratie en centrifugering van de weefselsuspensie. Tenslotte wordt de Ca2 +-concentratie in de cel opslagoplossing stapsgewijs aangepast tot 0,2 mM. We kort de betekenis van Ca 2 + te bespreken en Ca 2 + buffering tijdens de isolatie proces en bieden ook representatief opnames van actiepotentialen en membraan stromen, zowel samen met gelijktijdige Ca 2 + voorbijgaande metingen, uitgevoerd in deze geïsoleerde myocyten.

Figuur 2A toont drie representatieve voorbeelden uit geïsoleerde mensenrecht atriale myocyten. Te kwantificeren de cel opbrengst pipet we 10 ul van celsuspensie (stap 5.5) op een CellFinder microscoopdia ( <a href="http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html" target="_blank">http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html</a> ). Gemiddelde cel opbrengsten in figuur 2B tonen duidelijk aan dat er een tendens tot lagere opbrengsten in cel chronische AF (CAF) patiënten monsters (A, lengte: 16,5 ± 3,1 cellen/10 gl (n = 29) versus 5,1 ± 2,3 cellen/10 gl (n = 10) in SR en caf respectievelijk, p &lt;0,05; buis B: 17,9 ± 3,9 cellen/10 gl (n = 29) versus 5,9 ± 2,0 cellen/10 gl (n = 9) in SR en caf, respectievelijk p = 0.107). Representatieve voorbeelden van de actie-potentiaal metingen en gelijktijdige opnames cytosolisch Ca2 + transiënten zijn aangegeven in figuur 3. In ongeveer 90% van de onderzochte cellen, thij actie-potentiële-geactiveerd Ca2 + vrijstelling veroorzaakt duidelijk en gewone mobiele weeën. Zoals eerder gemeld, de rust membraanpotentiaal, die een aanvaarde indicator voor cellulaire integriteit, gemiddeld ongeveer -73,9 ± 2,7 mV (n = 23/10 myocyten / patiënten) en -77,7 ± 1,8 mV (n = 19/8 myocyten / patiënten ) in respectievelijk SR en CAF (p&gt; 0.05). 15 Figuur 4 toont vertegenwoordiger gelijktijdige opnames van voltage-gated L-type Ca 2 + stromen en cytosolische Ca 2 + transiënten. Toepassing van de niet-selectieve β-adrenoceptor agonist isoprenaline (1 uM) verhoogt amplitudes van zowel Ca I, L en cytosolische Ca2 + transiënten, suggereert intacte β-adrenerge signaaltransductie cascade. <img alt="Figuur 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1.jpg" /> Figure 1. Stroomschema van de myocytes Fluo-03:00 laad-protocol (zie stap 6,1-6,5). m / v, massa / volume. <img alt="Figuur 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2.jpg" /> Figuur 2. A, geïsoleerde humane rechter atrium myocyten na een uur opslagoplossing. B, gemiddelde ± SEM van de cel opbrengst geteld in 10 pi cellen in bewaarvloeistof (zie stap 5.5). n verwijst naar het aantal preparaten in elke groep. * P &lt;0,05. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3.jpg" /> Figuur 3. Vertegenwoordiger opnames van actie-potentiële-triggered Ca 2 +-transiënten (CAT) in een atriale myocyt van een sinusritme en een chrONIC boezemfibrilleren patiënt. Top: Ingespoten membraan stroom (M) voor stimulatie (0,5 Hz). Hieronder: Gelijktijdig opnemen van membraanpotentiaal (V M), en getriggerd CaT (onderaan). (Opnieuw geplot met toestemming van Voigt et al.. 2012) 15 <img alt="Figuur 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4.jpg" /> Figuur 4. Vertegenwoordiger opnames van isoprenaline (1 uM) effect op L-type Ca2 + stroom-triggered Ca 2 +-transiënten (CAT) in een atriale myocyten van een sinus ritme en chronisch boezemfibrilleren patiënt. Top: Voltage-clamp-protocol (0.5 Hz). Hieronder: Gelijktijdig opnemen van de totale netto-membraan stroom (I M), hoofdzakelijk als gevolg van L-type Ca 2 + stroom (midden) en getriggerd CaT (onderaan). (Opnieuw geplot met toestemming van Voigt,et al.. 2012) 15 <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table1.jpg" alt="Tabel 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table1highres.jpg" /> Tabel I. Solutions. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table2.jpg" alt="Tabel 2" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table2highres.jpg"/> Tabel II. Specifieke apparatuur. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table3.jpg" alt="Tabel 3" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table3highres.jpg"/> Tabel III. Stoffen voor het laden van myocyten met Fluo-03:00. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table4.jpg" alt="Tabel 4" fo:content-width = &quot;2.5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50235/50235table4highres.jpg&quot; /&gt; Tabel IV. Bad oplossing voor patch-clamp. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table5.jpg" alt="Tabel 5" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table5highres.jpg"/> Tabel V. Pipette oplossing voor patch-clamp *.

Wij beschrijven de isolatie van menselijke atriale myocyten die kunnen worden gebruikt voor intracellulaire Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Metingen in combinatie met elektrofysiologische patch-clamp studies.

Isolatie van Human atriale Myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transients en Membraan Currents

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van menselijke atriale myocyten die geschikt zijn voor gelijktijdige metingen van calciumtransiënten en membraanstromen. Het monster van het rechter atrium wordt verkregen van patiënten die een openhartoperatie ondergaan en wordt snel getransporteerd om met de procedure te beginnen. De eerste stap van de procedure is het reinigen van het weefsel en het snijden ervan in kleine weefselstukjes.De tweede stap bestaat uit een tweevoudige enzymatische digestie van het weefsel met proteolytische enzymen, resulterend in geïsoleerde atriummyocyten. De laatste stap omvat het laden van de myocyten met een calciumgevoelige fluorescerende kleurstof. Uiteindelijk maakt het gecombineerde gebruik van epifluorescentiemicroscopie en de patchclamp-techniek gelijktijdige registraties mogelijk van calciumtransiënten met membraanstromen of actiepotentialen.Deze methode kan helpen bij het begrijpen van de moleculaire basis van abnormaliteiten in de cellulaire calciumhuishouding die ten grond liggen aan hartaandoeningen zoals atriumfibrilleren; de methode zal worden gedemonstreerd door Claudia Lira, de senior technicus van ons laboratorium. Het menselijke atriumweefsel, verkregen van patiënten die een openhartoperatie ondergaan voor een coronary artery bypass graft of mitralisklepvervanging, moet snel in transportoplossing naar het laboratorium worden getransporteerd. Verplaats bij aankomst in het laboratorium het weefselmonster en de oplossing naar een schaal van 10 centimeter. Verwijder vervolgens grofweg het vetweefsel met een schaar.Weeg vervolgens het weefselmonster. Bewaar tussen 200 en 600 milligram voor de celisolatie en vries de rest in vloeibare stikstof in voor biochemische analyse. Breng het weefsel voor celisolatie over in een schaal met koele, calciumvrije oplossing en snijd het weefsel in stukjes van één kubieke millimeter om het weefsel te wassen.Overbreng dit samen met de calciumvrije oplossing naar het bekerglas met mantel. Verwarm dit tot 37 °C. Voeg zuurstof toe via een leiding die is afgesloten met een pipetpunt om sterk bellen te voorkomen.Roer het weefsel voorzichtig gedurende ongeveer drie minuten met een magnetische roerstaaf. Laat het weefsel vervolgens bezinken. Zeef nu voorzichtig het supernatant door een nylon gaas van 200 micron.Het grootste deel van het weefsel moet in het bekerglas blijven. Vul het bekerglas opnieuw aan met een voorverwarmde calciumvrije oplossing van 37 °C. Plaats vervolgens de gefiltreerde weefselstukjes vanuit het gaas met een pincet terug in het bekerglas en herhaal de wasprocedure tweemaal.Begin dit deel van de procedure door 20 milliliter voorverwarmde enzymoplossing E one (37 °C) te bereiden, die collagenase en protease bevat. Zeef de calciumvrije oplossing na de laatste wasstap zorgvuldig en resuspendeer het gewassen weefsel in de E one-oplossing. Breng het op het gaas verzamelde weefsel terug in het bekerglas.Roer de suspensie voorzichtig gedurende 10 minuten. Voeg vervolgens 40 µL van 10 mM calciumchloride toe en blijf 35 minuten roeren. Filtreer daarna het supernatant voorzichtig door een nylon gaas.Het grootste deel van het weefsel moet in het bekerglas blijven. Bereid 20 milliliters enzymoplossing E twee voor die alleen collagenase één bevat, en gebruik deze om het bekerglas aan te vullen. Voeg het op het gaas verzamelde weefsel terug toe aan het bekerglas.Voeg vervolgens onmiddellijk 40 µL van de 10 mM calciumchloride-oplossing toe tijdens de tweede digestie, waarbij incidenteel een schaar wordt gebruikt om weefselklonters fijn te knippen. Neem na vijf minuten een monster van de suspensie om de dissociatie van de cellen onder een microscoop te controleren. Blijf elke twee tot drie minuten monsters nemen totdat staafvormige gestreepte cardiomyocyten duidelijk zichtbaar zijn.Stop vervolgens het roeren, zodat het weefsel kan bezinken. Zodra het is bezonken, wordt het supernatant voorzichtig door een nylon gaas in een plastic buis van 50 milliliter gefiltreerd. Suspendeer daarna het weefsel in 20 milliliter bewaaroplossing en voeg de gefiltreerde weefselstukken van het gaas terug toe aan het bekerglas.Dissocieer de cellen verder door middel van zachte mechanische agitatie. Gebruik een pipet van 20 milliliter en probeer beluchting te vermijden. Zeef vervolgens het supernatant voorzichtig door een nylon gaas; centrifugeer na het zeven beide supernatantfracties bij 90 5G gedurende 10 minuten.Om de cellen te pelletteren, worden de supernatanten door aspiratie verwijderd zonder het pellet te verstoren. Suspendeer elk pellet in 1,5 milliliters bewaaroplossing bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 7,5 microliters van een 10 millimolaire calciumchloride-oplossing toe aan elke buis en wacht 10 minuten.Voeg vervolgens nog eens 7,5 µL calciumchloride toe en wacht nog 10 minuten. Voeg na het wachten een derde volume van 15 µL 10 mM calciumchloride toe om de uiteindelijke concentratie calciumchloride in de oplossing op 0,2 mM te brengen. Het doel van deze isolatie is het verkrijgen van cellen die geschikt zijn voor intracellulaire calciummetingen.Het is daarom een strikte vereiste om alle calciumgebufferde oplossingen, zoals EGGA, weg te laten uit de bewaarloesing. Breng 1,5 milliliters van de celsuspensie over in een microcentrifugebuis van twee milliliter. De volgende stappen moeten worden uitgevoerd met inachtneming van de lichtgevoeligheid van de fluorescerende calciumindicator.FluO-3. Maak eerst een 1 mM FluO-3-stoomoplossing. Deze oplossing kan tot één week worden bewaard bij -20 °C.Voeg vervolgens 15 µL van de flu oh 3:00 AM-stamoplossing toe aan de 1,5 mL celstuspensie. Agiteer het mengsel voorzichtig en incubeer de suspensie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in een ondoorzichtige doos. Centrifugeer het weefsel na de incubatie kortstondig bij ongeveer 6.000 RPM.Verwijder vervolgens het supernatant en resuspendeer het pellet in 1,5 milliliters badoplossing. Laat de celsuspensie ongeveer 30 minuten staan voor de-esterificatie voordat de experimenten worden gestart. Ga daarna verder met gelijktijdige patch clamp- en epifluorescentie calciummetingen volgens het beschreven protocol.Myocyten werden geïsoleerd uit atriumweefsel en gekwantificeerd op een cell finder microscoopglas. De gemiddelde celopbrengsten wijzen duidelijk op een tendens naar lagere celopbrengsten in monsters van patiënten met chronisch atriumfibrilleren. Met Flu oh drie geladen myocyten werden gestimuleerd bij 0,5 hertz in current clamp configuratie om actiepotentialen op te wekken; ongeveer 90% van de onderzochte cellen vertoonde regelmatige contracties.Als reactie op deze stimulatie maakt de overschakeling naar fluorescentiemicroscopie de actiepotentiaal-getriggerde calciumvrijgave uit het sarcoplasmatisch reticulum zichtbaar, wat de cellulaire contractie initieert. Representatieve opnames van patiënten met sinusritme en atriumfibrilleren laten zien dat actiepotentialen van patiënten gewoonlijk een spike- en koepelvorm hebben, terwijl triangulatie en verkorting van de actiepotentiaal typische kenmerken zijn van atriumremodellering.Bij patiënten met atriumfibrilleren onthulden gelijktijdig geregistreerde intracellulaire calciumtransiënten verhoogde diastolische calciumgehalten en een verminderde amplitude van de calciumtransiënt in myocyten van atriumfibrilleringspatiënten om L-type calciumstromen te registreren. Kaliumstromen werden geblokkeerd met vier-aminopyridine en bariumchloride. De cellen werden gestimuleerd op 0,5 Hz in een voltage-clamp-configuratie met een holdingpotentiaal van -80 mV, met een ramp van 100 ms naar -40 mV en een testpuls van 100 ms naar 10 mV.Representatieve opnamen tonen aan dat atriumfibrilleren geassocieerd is met een verminderde L-type calciumstroom. Opnieuw was het diastolische calciumniveau verhoogd, terwijl de amplitude van de calciumtransiënt lager was bij atriumfibrilleren.Toepassing van de niet-selectieve bèta-adrenoreceptoragonist isoprenaline verhoogde de amplitudes van de L-type calciumstromen en de cytosolische calciumtransiënt. In beide groepen suggereert dit dat de cellen beschikken over een intacte bèta-adrenerge signaaltransductiecascade. De resultaten tonen aan dat deze methode hoogwaardige calciumtolerante myocyten oplevert, die geschikt zijn voor gelijktijdige patchclamp- en calciumtransiëntmetingen.Daarnaast kunnen de verkregen myocyten nuttig zijn voor metingen van celverkorting, immuunkleuring of TTU-kleuring.

isolation-human-atrial-myocytes-for-simultaneous-measurements-ca2

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Kv dysfunctie wordt geassocieerd met hartritmestoornissen. Om de moleculaire mechanismen die leiden tot dergelijke aritmieën we een systematische protocol gebruiken voor isolatie van atriale en ventriculaire hartspiercellen uit Kv kanaal bijkomende subunit knockout muizen. Geïsoleerde cardiomyocyten kan vervolgens direct worden gebruikt voor cellulaire elektrofysiologische studies, biochemische of immunofluorescentie (IF) testen.

Isolatie en Kv Channel Opnamen in Murine atriale en ventriculaire cardiomyocyten

Huidige kennis over de cellulaire basis van hartziektes vertrouwt vooral op studies op diermodellen. Hier beschrijven we en validatie van een nieuwe methode om enkele levensvatbare hartspiercellen te verkrijgen van kleine chirurgische monsters van menselijk ventriculair myocard. Menselijke hartspiercellen en kan worden gebruikt voor elektrofysiologische studies en drugstesten.

Isolatie en functionele karakterisering van Human ventriculaire cardiomyocyten van Fresh Chirurgische Samples

Methoden worden gedemonstreerd voor de isolatie van de sinusknoop myocyten (SAM) van volwassen muizen voor patch clamp elektrofysiologie of imaging studies. Geïsoleerde cellen kunnen direct worden gebruikt of kunnen in kweek worden gehandhaafd expressie van eiwitten van belang, zoals genetisch gecodeerde reporters mogelijk.

Methoden voor de isolatie, Cultuur en functionele karakterisering van de sinusknoop Myocytes van volwassen muizen

Dit protocol beschrijft de elektrofysiologische evaluatie van lymfkliertest atria met behulp van een optische mapping systeem met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie, met inbegrip van dubbele opnamen van de membraan spanning en Ca2 + voorbijgaande onder geprogrammeerd stimulatie door middel van een speciale elektrode-katheter.

Elektrofysiologische beoordelingvan lymfkliertest Atria met hoge resolutie optische Mapping

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd, Langendorff gebaseerde procedure voor de isolatie van eencellige atriale cardiomyocytes van een rat model van metabole syndroom-gerelateerde hartfalen met bewaarde ejectie Fractie. Een handmatige regulering van de intraluminale druk van cardiale Holten is geïmplementeerd om de opbrengst van functioneel intact myocytes geschikt voor excitatie-contractie-koppeling studies.

Isolatie van atriale Cardiomyocytes van een Rat Model van metabole syndroom-gerelateerde hartfalen met bewaarde ejectie Fractie

Dit protocol wordt gebruikt om enkelvoudige atriale cardiomyocyten van het volwassen muis hart te isoleren met behulp van een Brok digestie benadering. Deze aanpak wordt gebruikt om te isoleren van rechts of links atriale myocyten die kunnen worden gebruikt voor het karakteriseren van Atrium myocyten elektrofysiologie in Patch-clamp studies.

Isolatie van atriale Myocyten van volwassen muizen

Gepresenteerd is een protocol voor de isolatie van menselijke en dierlijke ventriculaire cardiomyocyten van vibratome-cut myocardische plakjes. Hoge opbrengsten van calciumtolerante cellen (tot 200 cellen/mg) kunnen worden verkregen uit kleine hoeveelheden weefsel (&lt;50 mg). Het protocol is van toepassing op myocardium dat tot 36 uur aan koude ischemie wordt blootgesteld.

Isolatie van human ventriculaire cardiomyocyten van Vibratome-Cut Myocardial Slices

Een methode wordt beschreven voor de gelijktijdige isolatie van myocyten en niet-myocyten van zowel de atria als ventrikels van een enkel volwassen muizenhart. Dit protocol resulteert in consistente opbrengsten van zeer levensvatbare cardiale myocyten en niet-myocyten en beschrijft optimale celspecifieke kweekomstandigheden voor fenotyping en in vitro analyse.

Gelijktijdige isolatie en cultuur van atriale myocyten, ventriculaire myocyten en niet-myocyten uit een volwassen muizenhart

Muismodellen maken het mogelijk om belangrijke mechanismen van aritmogenese te bestuderen. Voor dit doel zijn cardiomyocyten van hoge kwaliteit nodig om patchklemmetingen uit te voeren. Hier wordt een methode beschreven om murine atriale en ventriculaire myocyten te isoleren via retrograde enzymgebaseerde Langendorff-perfusie, die gelijktijdige metingen van calciumtransiënten en L-type calciumstroom mogelijk maakt.

Isolatie van hoogwaardige murine atriale en ventriculaire myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca2+ transiënten en L-type calciumstroom

Dit protocol beschrijft modificaties van de Langendorff-methode, waaronder de diepte van aorta-cannulatie voor gelijktijdige isolatie van atriale en ventriculaire myocyten van volwassen muizen.

Modificaties van de Langendorff-methode voor gelijktijdige isolatie van atriale en ventriculaire myocyten van volwassen muizen

Leer de isolatie van humane atriale myocyten voor gelijktijdige metingen van calciumtransiënten en membraanstromen. Deze methode helpt onderzoekers de moleculaire basis van hartritmestoornissen te begrijpen.

Isolatie van Human atriale Myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca

Meer video's verkennen