Isolatie van Human atriale Myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van menselijke atriale myocyten die geschikt zijn voor gelijktijdige metingen van calciumtransiënten en membraanstromen. Het monster van het rechter atrium wordt verkregen van patiënten die een openhartoperatie ondergaan en wordt snel getransporteerd om met de procedure te beginnen. De eerste stap van de procedure is het reinigen van het weefsel en het snijden ervan in kleine weefselstukjes.

De tweede stap bestaat uit een tweevoudige enzymatische digestie van het weefsel met proteolytische enzymen, resulterend in geïsoleerde atriummyocyten. De laatste stap omvat het laden van de myocyten met een calciumgevoelige fluorescerende kleurstof. Uiteindelijk maakt het gecombineerde gebruik van epifluorescentiemicroscopie en de patchclamp-techniek gelijktijdige registraties mogelijk van calciumtransiënten met membraanstromen of actiepotentialen.

Deze methode kan helpen bij het begrijpen van de moleculaire basis van abnormaliteiten in de cellulaire calciumhuishouding die ten grond liggen aan hartaandoeningen zoals atriumfibrilleren; de methode zal worden gedemonstreerd door Claudia Lira, de senior technicus van ons laboratorium. Het menselijke atriumweefsel, verkregen van patiënten die een openhartoperatie ondergaan voor een coronary artery bypass graft of mitralisklepvervanging, moet snel in transportoplossing naar het laboratorium worden getransporteerd. Verplaats bij aankomst in het laboratorium het weefselmonster en de oplossing naar een schaal van 10 centimeter. Verwijder vervolgens grofweg het vetweefsel met een schaar.

Weeg vervolgens het weefselmonster. Bewaar tussen 200 en 600 milligram voor de celisolatie en vries de rest in vloeibare stikstof in voor biochemische analyse. Breng het weefsel voor celisolatie over in een schaal met koele, calciumvrije oplossing en snijd het weefsel in stukjes van één kubieke millimeter om het weefsel te wassen.

Overbreng dit samen met de calciumvrije oplossing naar het bekerglas met mantel. Verwarm dit tot 37 °C. Voeg zuurstof toe via een leiding die is afgesloten met een pipetpunt om sterk bellen te voorkomen.

Roer het weefsel voorzichtig gedurende ongeveer drie minuten met een magnetische roerstaaf. Laat het weefsel vervolgens bezinken. Zeef nu voorzichtig het supernatant door een nylon gaas van 200 micron.

Het grootste deel van het weefsel moet in het bekerglas blijven. Vul het bekerglas opnieuw aan met een voorverwarmde calciumvrije oplossing van 37 °C. Plaats vervolgens de gefiltreerde weefselstukjes vanuit het gaas met een pincet terug in het bekerglas en herhaal de wasprocedure tweemaal.

Begin dit deel van de procedure door 20 milliliter voorverwarmde enzymoplossing E one (37 °C) te bereiden, die collagenase en protease bevat. Zeef de calciumvrije oplossing na de laatste wasstap zorgvuldig en resuspendeer het gewassen weefsel in de E one-oplossing. Breng het op het gaas verzamelde weefsel terug in het bekerglas.

Roer de suspensie voorzichtig gedurende 10 minuten. Voeg vervolgens 40 µL van 10 mM calciumchloride toe en blijf 35 minuten roeren. Filtreer daarna het supernatant voorzichtig door een nylon gaas.

Het grootste deel van het weefsel moet in het bekerglas blijven. Bereid 20 milliliters enzymoplossing E twee voor die alleen collagenase één bevat, en gebruik deze om het bekerglas aan te vullen. Voeg het op het gaas verzamelde weefsel terug toe aan het bekerglas.

Voeg vervolgens onmiddellijk 40 µL van de 10 mM calciumchloride-oplossing toe tijdens de tweede digestie, waarbij incidenteel een schaar wordt gebruikt om weefselklonters fijn te knippen. Neem na vijf minuten een monster van de suspensie om de dissociatie van de cellen onder een microscoop te controleren. Blijf elke twee tot drie minuten monsters nemen totdat staafvormige gestreepte cardiomyocyten duidelijk zichtbaar zijn.

Stop vervolgens het roeren, zodat het weefsel kan bezinken. Zodra het is bezonken, wordt het supernatant voorzichtig door een nylon gaas in een plastic buis van 50 milliliter gefiltreerd. Suspendeer daarna het weefsel in 20 milliliter bewaaroplossing en voeg de gefiltreerde weefselstukken van het gaas terug toe aan het bekerglas.

Dissocieer de cellen verder door middel van zachte mechanische agitatie. Gebruik een pipet van 20 milliliter en probeer beluchting te vermijden. Zeef vervolgens het supernatant voorzichtig door een nylon gaas; centrifugeer na het zeven beide supernatantfracties bij 90 5G gedurende 10 minuten.

Om de cellen te pelletteren, worden de supernatanten door aspiratie verwijderd zonder het pellet te verstoren. Suspendeer elk pellet in 1,5 milliliters bewaaroplossing bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 7,5 microliters van een 10 millimolaire calciumchloride-oplossing toe aan elke buis en wacht 10 minuten.

Voeg vervolgens nog eens 7,5 µL calciumchloride toe en wacht nog 10 minuten. Voeg na het wachten een derde volume van 15 µL 10 mM calciumchloride toe om de uiteindelijke concentratie calciumchloride in de oplossing op 0,2 mM te brengen. Het doel van deze isolatie is het verkrijgen van cellen die geschikt zijn voor intracellulaire calciummetingen.

Het is daarom een strikte vereiste om alle calciumgebufferde oplossingen, zoals EGGA, weg te laten uit de bewaarloesing. Breng 1,5 milliliters van de celsuspensie over in een microcentrifugebuis van twee milliliter. De volgende stappen moeten worden uitgevoerd met inachtneming van de lichtgevoeligheid van de fluorescerende calciumindicator.

FluO-3. Maak eerst een 1 mM FluO-3-stoomoplossing. Deze oplossing kan tot één week worden bewaard bij -20 °C.

Voeg vervolgens 15 µL van de flu oh 3:00 AM-stamoplossing toe aan de 1,5 mL celstuspensie. Agiteer het mengsel voorzichtig en incubeer de suspensie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in een ondoorzichtige doos. Centrifugeer het weefsel na de incubatie kortstondig bij ongeveer 6.000 RPM.

Verwijder vervolgens het supernatant en resuspendeer het pellet in 1,5 milliliters badoplossing. Laat de celsuspensie ongeveer 30 minuten staan voor de-esterificatie voordat de experimenten worden gestart. Ga daarna verder met gelijktijdige patch clamp- en epifluorescentie calciummetingen volgens het beschreven protocol.

Myocyten werden geïsoleerd uit atriumweefsel en gekwantificeerd op een cell finder microscoopglas. De gemiddelde celopbrengsten wijzen duidelijk op een tendens naar lagere celopbrengsten in monsters van patiënten met chronisch atriumfibrilleren. Met Flu oh drie geladen myocyten werden gestimuleerd bij 0,5 hertz in current clamp configuratie om actiepotentialen op te wekken; ongeveer 90% van de onderzochte cellen vertoonde regelmatige contracties.

Als reactie op deze stimulatie maakt de overschakeling naar fluorescentiemicroscopie de actiepotentiaal-getriggerde calciumvrijgave uit het sarcoplasmatisch reticulum zichtbaar, wat de cellulaire contractie initieert. Representatieve opnames van patiënten met sinusritme en atriumfibrilleren laten zien dat actiepotentialen van patiënten gewoonlijk een spike- en koepelvorm hebben, terwijl triangulatie en verkorting van de actiepotentiaal typische kenmerken zijn van atriumremodellering.

Bij patiënten met atriumfibrilleren onthulden gelijktijdig geregistreerde intracellulaire calciumtransiënten verhoogde diastolische calciumgehalten en een verminderde amplitude van de calciumtransiënt in myocyten van atriumfibrilleringspatiënten om L-type calciumstromen te registreren. Kaliumstromen werden geblokkeerd met vier-aminopyridine en bariumchloride. De cellen werden gestimuleerd op 0,5 Hz in een voltage-clamp-configuratie met een holdingpotentiaal van -80 mV, met een ramp van 100 ms naar -40 mV en een testpuls van 100 ms naar 10 mV.

Representatieve opnamen tonen aan dat atriumfibrilleren geassocieerd is met een verminderde L-type calciumstroom. Opnieuw was het diastolische calciumniveau verhoogd, terwijl de amplitude van de calciumtransiënt lager was bij atriumfibrilleren.

Toepassing van de niet-selectieve bèta-adrenoreceptoragonist isoprenaline verhoogde de amplitudes van de L-type calciumstromen en de cytosolische calciumtransiënt. In beide groepen suggereert dit dat de cellen beschikken over een intacte bèta-adrenerge signaaltransductiecascade. De resultaten tonen aan dat deze methode hoogwaardige calciumtolerante myocyten oplevert, die geschikt zijn voor gelijktijdige patchclamp- en calciumtransiëntmetingen.

Daarnaast kunnen de verkregen myocyten nuttig zijn voor metingen van celverkorting, immuunkleuring of TTU-kleuring.