Live-Cell Cycle Analysis van
19 mei 2013
Een protocol voor celcyclus analyse gemaakt van live Drosophila Weefsels met behulp van de Attune Acoustic Focussen Cytometer wordt beschreven. Dit protocol geeft tegelijkertijd informatie over de relatieve cel grootte, aantal cellen, DNA-gehalte en celtype via lineage tracing of weefselspecifieke expressie van fluorescerende eiwitten In vivo.
Het algemene doel van deze procedure is om de relatieve celcyclusfase en celgrootte van weefsels met genetisch gemanipuleerde en met GFP of RFP gelabelde celpopulaties in Drosophila te meten. Stel eerst genetische kruisen op om nakomelingen te genereren die cellen bevatten die zijn gelabeld met de gewenste fluorescerende eiwitten en met de gewenste genetische manipulaties in een specifiek weefsel of celpopulatie. Isoleren onder studie de gewenste weefsels uit de nakomelingen van de juiste ontwikkelingsfase, dissocieer vervolgens het weefsel tot een enkele celsuspensie en kleuren met een levensvatbare DNA-kleurstof om de DNA-inhoud te meten.
Analyseer de gekleurde gedissocieerde monsters door middel van flowcytometrie. Uiteindelijk meten de in vivo resultaten veranderingen in celgrootte en celcyclusfase veroorzaakt door de genetische manipulaties onder studie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van de bestaande methode van flowcytometrie op levende drosophila-weefsels met behulp van ultraviolette kleurstoffen is dat de violette kleurstof compatibel is met goedkopere benchtop cytometers met een violette 4 0 5 laser, die met een klein budget kunnen worden gekocht en op laboratoriumschaal worden onderhouden.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het celcyclusveld door informatie te verschaffen over de celcyclusfase en celgrootte die gedetailleerder is dan alleen het meten van de algehele weefselse grootte en proliferatiesnelheid. Het demonstreren van de procedure zullen Kagel en Dan Sun zijn, afgestudeerde studenten uit mijn laboratorium en Olga Guko. Onze technicus verzamelt volwassen larven in het derde larvale stadium op ongeveer 110 tot 120 uur na het leggen van het ei voor de larven dissectie.
Accurate pupil staging is essentieel voor studies tijdens metamorfose voor deze oogst witte pre pupa aan het begin van metamorfose indien nodig, I mesa verzegeld Petri-schaaltje van pupi of een flesje larven in een 37 graden Celsius waterbad Om de warmte te activeren. Chuck flip basis voor lijn tracing klonen. Nadat het Petri-schaaltje is ontsluit, plaats het in een incubator voor het verouderen tot de gewenste ontwikkelingsfase voor de pupil dissectie.
Grijp voorzichtig een pupa bij de voorste punt van de pupilcase waar een luchtbel is om de pupa binnenin te beschadigen, positioneer de zwevende pupa voor een goede greep. Snijd vervolgens met microscharen schoon door de achterste punt van de pupa onder een lichte hoek naar het dorsale deel van het dier om de interne druk vrij te geven zonder de hist fat in de gewenste weefsels in het thorax en hoofd te forceren. Snijd voorzichtig langs het dorsale midden, vermijd het beschadigen van de vleugels en het voorste oogbreincomplex was om hist fat te verwijderen. Verwijder vervolgens de pupil uit de pupilcase door de achterste rand van het pupil epidermis met pincetten vast te pakken en deze uit de pupilcase te trekken.
Breng de gedissecteerde pupa over naar een schone dissectieschaal. Prik met pincetten een klein gaatje in de cuticula voor de oogbreincomplex met een rubberen bulb.
Was voorzichtig PBS dissectie oplossing door de gedeeltelijk gedissecteerde pupa om alle resterende his ized vet en darmweefsel te verwijderen. Om de pupilvleugels te verkrijgen, houd de pupa vast aan de kop met één pincet en gebruik een tweede pincet. Grijp de meest achterste punt van de vleugelcuticula, trek en los deze van de zijkant van het karkas.
Snijd vervolgens of trek de vleugel aan de scharnier los om hem van het lichaam te verwijderen en leg hem in een stapel weg van de karkassen en ander materiaal om de pupilogen of hersenen te verkrijgen. Was de pupa tot het oogbreincomplex loskomt en vrij is van de pupa. Trek voorzichtig met een pincet het pupiloog weg van de hersenen en bewaar het gewenste weefsel. Gebruik een gesmeerde pasti-pijp om de gedissecteerde weefsels voorzichtig over te brengen.
Incubeer de buizen met schudden bij 23 graden Celsius bij 500 RPM gedurende 70 minuten. Vorm vervolgens voorzichtig gedurende vijf seconden op een gemiddelde snelheid en breng de monsters terug naar de shaker voor nog eens 15 tot 20 minuten. Vorm monsters nogmaals gedurende vijf seconden op gemiddelde snelheid voor hersenen en pupilogen.
Ouder dan 36 uur. Een PF dissocieert weefsels in DNA-kleurstofoplossing bij 23 graden Celsius bij 500 RPM gedurende 45 tot 60 minuten. Dissocieer vervolgens een voor een handmatig grote stukken weefsel door over te brengen naar een dissectieschaal samen met ongeveer 50 microliter DNA-kleurstofoplossing.
Pipet snel op en neer met een handmatig getekende pasti-pijp van ongeveer 100 tot 150 micrometer opening. Pool de gedissocieerde exemplaren in een vijf milliliter buisje. Incubeer een extra 30 minuten bij 23 graden Celsius met schudden bij 500 RPM.
Controleer visueel of de monsters volledig zijn gedissocieerd. Houd er rekening mee dat de acellulaire transparante pupilvleugelcuticula zich niet zal associëren. Begin de fax-analyse door het monster op de cytometer te laden.
Selecteer vervolgens kanalen om voorwaartse verstrooiing en zijdelingse verstrooiing te detecteren die de celgrootte en membraancomplexiteit aangeven. Om de D-cyclus violette kleuring van het DNA te detecteren, moet u VL een hoogte, breedte en oppervlakte meten van violette laserexcitatie. Selecteer ook het blauwe laserkanaal een oppervlakte om GFP-fluorescentie te meten.
Voor RFP-analyse gebruiken we het blauwe laserkanaal drie. Dit kanaal op de attune is geoptimaliseerd voor RFP-detectie. Stel de poorten in om de analyse te beperken tot de geselecteerde populatie en om puin en verklumpingen uit de analyse te beperken die stopplotten genereert met poort één, sluit puin en verklumpingen uit in de plot van SSC versus FSC in de plot van VL één oppervlakte versus VL één met gebruik van GA twee om ongekleurde cellen uit te sluiten sub G één apoptotische cellen en celklonten op basis van identificatie van singlets.
GA drie omvat cellen binnen poorten één en twee die GFP-negatief zijn op de plot van fluorescentie versus DNA-inhoud op basis van VE L één hoogte. Volgende gaat vier omvat cellen binnen poorten één en twee die GFP-positief zijn op de
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het analyseren van de celcyclus van levende Drosophila-weefsels met behulp van de Attune Acoustic Focusing Cytometer. Hiermee kunnen celgrootte, aantal, DNA-gehalte en celtype gelijktijdig worden beoordeeld via lineage tracing of weefselspecifieke expressie van fluorescerende eiwitten.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Celbiologie
- Genetica
- Flowcytometrie
Achtergrond
- Het begrijpen van de dynamiek van de celcyclus is essentieel voor het bestuderen van de ontwikkelingsbiologie.
- Drosophila dient als modelorganisme voor genetische manipulatie.
- Fluorescerende eiwitten zoals GFP en RFP maken de visualisatie van specifieke celpopulaties mogelijk.
- Flowcytometrie maakt een kwantitatieve analyse van celpopulaties mogelijk.
Doel van de studie
- Om de relatieve fasen van de celcyclus in genetisch gemanipuleerde Drosophila-weefsels te meten.
- Om de celgrootte in relatie tot genetische modificaties te beoordelen.
- Om bestaande flowcytometrie-technieken te verbeteren door gebruik te maken van minder dure apparatuur.
Gebruikte methoden
- Stel genetische kruisingen op om nakomelingen met fluorescentie-gelabelde cellen te produceren.
- Isoleer het gewenste weefsel en maak een suspensie van enkelvoudige cellen.
- Kleur de cellen met een vitale DNA-kleurstof om de DNA-inhoud te meten.
- Analyseer de monsters met flowcytometrie om de celgrootte en de fase van de celcyclus te bepalen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie en analyse van levende Drosophila-weefsels.
- Kwantitatieve gegevens over celgrootte en cyclusfasen verkregen.
- Aangetoonde compatibiliteit van de methode met budgetvriendelijke cytometers.
- Validatie van de effectiviteit van fluorescent eiwitlabeling voor lineage tracing.
Conclusies
- Dit protocol biedt een betrouwbare methode voor het analyseren van celcyclusdynamiek in Drosophila.
- Het biedt voordelen ten opzichte van traditionele methoden, waardoor het toegankelijk is voor diverse onderzoekslaboratoria.
- Toekomstige toepassingen kunnen worden uitgebreid naar andere modelorganismen en celtypen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Dit protocol maakt een kwantitatieve beoordeling van de celcyclusdynamiek en celgrootte in genetisch gemanipuleerde Drosophila-weefsels mogelijk met behulp van een flowcytometer voor op het laboratoriumblad. Het ondersteunt doelwitvalidatie door genetische verstoringen te koppelen aan fenotypes van celproliferatie in vivo. De methode vergroot het voorspellend vertrouwen in vroege ontdekkingsfasen door mechanistische readouts van pathway-activiteit te bieden.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door verschuivingen in de celcyclusfase in lineage-getraceerde cellen te meten.
- Operationele waarde: Maakt functionele validatie van genetische targets mogelijk via proliferatie- en grootte-fenotypes.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door genetische modulatie te correleren met celcyclusresultaten.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarzetten van de assay: Genereert gedissocieerde, gekleurde single-cell suspensies die compatibel zijn met flowcytometrie.
- Kwantitatieve output: Levert DNA-gehalte, forward scatter en fluorescentie-uitlezingen voor analyse van de celcyclus en celgrootte.
- Reproduceerbaarheid: Maakt gebruik van gestandaardiseerde gating-strategieën om debris en doubletten uit te sluiten voor een betrouwbare discriminatie van populaties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Modelleert geconserveerde celcyclusregulatoren in Drosophila ter ondersteuning van studies naar menselijke signaalpaden.
- Translationele continuïteit: Verbindt in vivo genetische manipulatie met kwantificeerbare proliferatie-fenotypes.
- Mechanische risicoreductie: Verduidelijkt of genetische targets de G1/S-overgang of de mitotische progressie beïnvloeden.
Integratie van pipeline en workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van genetische hypothesetoetsing tot fenotypische screening en mechanistische validatie.
- Ontdekkingsbiologie: Test hoe genetische manipulaties de progressie van de celcyclus in specifieke weefsels beïnvloeden.
- Screening: Bereidt gestandaardiseerde cel-suspensies voor voor reproduceerbare flowcytometrische analyse.
- Analytica: Meet het DNA-gehalte en de forward scatter om celcyclusfasen en celgrootte te kwantificeren.
- Translationeel onderzoek: Koppelt in vivo fenotypes aan celcyclusresultaten voor validatie van signaalpaden.
- Herbruikbaarheid in de onderneming: Vestigt een overdraagbare workflow voor celcyclusanalyse in diverse Drosophila-weefsels.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door genotype te koppelen aan fenotypes van de celcyclus en celgrootte.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van een kleurstof die compatibel is met violette lasers en een benchtop-cytometer voor een toegankelijke en schaalbare implementatie.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroeg in de ontdekkingsfase kwantitatieve proliferatiegegevens te leveren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk op basis van de sterkte van de verstoring van de celcyclus.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in Drosophila-genetica, weefseldissectie en flowcytometrie.
- Is afhankelijk van violette laser-excitatie en passende cytometerinstellingen voor DyeCycle Violet-detectie.
- Vereist gestandaardiseerde gating-strategieën om debris, dubletten en ongekleurde cellen uit te sluiten.
- Omvat optimalisatie van dissociatietijden en kleuringscondities voor verschillende weefseltypes.
- Beperkt tot weefsels die efficiënt kunnen worden gedissocieerd zonder de integriteit van epitopen of fluorescerende eiwitten aan te tasten.
