Name: Large Scale Niet-gerichte metaboloom profilering van Serum door Ultra Performance Liquid Chromatography-massaspectrometrie (UPLC-MS) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Leer niet-gerichte metabolietprofilering van serum op grote schaal met UPLC-MS. Dit protocol omvat monsterbereiding, kwaliteitscontrole en data-analyse voor het identificeren van kleine molecuul biomarkers.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De gepresenteerde tutorial werd uitgevoerd en ontwikkeld binnen de Proteomics and Metabolomics Facility aan de Colorado State University, die gedeeltelijk wordt gefinancierd door de CSU Research Administration Resources for Scholarly Projects.

1. Sample Organisatie
<ol>
	<li>Om een platenplattegrond voor monstervoorbereiding op een spreadsheet te maken, voer in de eerste kolom een monsterlijst in volgorde van laden. In een tweede kolom voer de locaties van de 96-well platen in met de juiste nomenclatuur voor uw autosamplersoftware.</li>
	<li>Bewaar één well in elke plaat voor QC-monsters.</li>
	<li>Als uw LC-autosampler twee platen tegelijk kan verwerken, verdeel de monsterlijst in batches van 190 en bewaar deze informatie in een tweede werkblad.</li>
	<li>Gebruik binnen elk van deze batches de randomisatiefunctie [opmerking: "=rand()" in Excel] om de injectievolgorde te randomiseren. Kopieer en plak nu uw injectievolgorde in het LC-MS monsterwachtrijsoftwaresysteem. Randomisatie moet plaatsvinden tussen batches, binnen batches en moet uniek zijn over injectiereplica's.</li>
</ol>
2. Serum en kwaliteitscontrole (QC) monstervoorbereidingsprocedures
<ol>
	<li>Bereid een 10 ml stamoplossing van QC-monster voor met minimaal vier verbindingen van bekende massa en retentietijden die de chromatografische elutie van het experiment overspannen. (opmerking: cafeïne, reserpine, sulfadimethoxine en terfenadine met een concentratie van 2 μg/ml elk).</li>
	<li>Ontdooi de serummonsters op ijs en vortex voorzichtig gedurende ~5 sec.</li>
	<li>Voorbehandel de punten van een 12-kanaals pipettor met methanol om tip-dripping tijdens het doseren van monsters te voorkomen. Voeg vervolgens 370 μl koude methanol toe aan elk well van een 96-well plaat.</li>
	<li>Breng 100 μl van elk monster over naar de overeenkomstige platenlocatie van de platenplattegronden. Dek de platen af en incubeer gedurende 30 min bij -80 °C om de eiwitten te bezinken.</li>
	<li>Centrifugeer de platen in een 4 °C centrifuge bij 3.200 x g gedurende 30 min. Breng 250 μl supernatant over naar een nieuwe 96-well en herhaal de centrifugatie.</li>
	<li>Breng nu 60 μl aliquoten van het supernatant over naar drie 96-well platen die geschikt zijn voor de UPLC of LC-autosampler.</li>
	<li>Voeg 100 μl QC-monstermix toe aan de gereserveerde wellpositie op de plaat.</li>
	<li>Versluit elke plaat met een kleeffolie. Oplosmiddel kan snel verdampen nadat de well is geprikt, en daarom moeten injecties alleen worden uitgevoerd vanaf elke plaat. Platen in de monsterwachtrij kunnen op korte termijn worden bewaard bij -20 °C.</li>
</ol>
3. UPLC-MS Dataverwerving
<ol>
	<li>Stel de autosampler in op 4 °C en plaats de eerste twee platen in de autosampler.</li>
	<li>Stel de verwervingsmethode in met behulp van een van de twee alternatieve reverse phase gradiënten. Gradient A is gericht op niet-polaire moleculen terwijl gradient B een betere dekking zal bieden van matig polaire moleculen.
	<ol>
		<li>Gradient A: 
		<table border="1">
			<tbody>
				<tr>
					<td>Tijd (min)</td>
					<td>%A</td>
					<td>%B</td>
					<td>curve</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0.0</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td> </td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0.1</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>1.0</td>
					<td>60</td>
					<td>40</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>3.0</td>
					<td>30</td>
					<td>70</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>11.0</td>
					<td>0</td>
					<td>100</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>17.0</td>
					<td>0</td>
					<td>100</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>17.1</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>23.0</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		</li>
		<li>Gradient B 
		<table border="1">
			<tbody>
				<tr>
					<td>Tijd (min)</td>
					<td>%A</td>
					<td>%B</td>
					<td>curve</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>0.0</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td> </td>
				</tr>
				<tr>
					<td>1</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>13</td>
					<td>5</td>
					<td>95</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>16</td>
					<td>5</td>
					<td>95</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>16.05</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
				<tr>
					<td>20</td>
					<td>100</td>
					<td>0</td>
					<td>6</td>
				</tr>
			</tbody>
		</table>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stel de massaspectrometer in om gegevens te verzamelen in positieve modus met scannen van 50-1.200 m/z. Aanvullende specifieke instrumentcondities variëren afhankelijk van het gebruikte systeem. Het volgende vertegenwoordigt de condities die worden gebruikt op onze Waters Xevo G2 Q-TOF massaspectrometer: Collision Energy = 6V; Scan Time = 0,2 sec per scan; Capillary Voltage = 2.200 V; Source Temperature = 150 °C Desolvation Temperature = 350 °C Desolvation Gas Flow (N2) = 800 L/hr).</li>
	<li>Injecteer de QC-monsters vijf keer aan het begin van elke batch van twee platen monsters. Na het conditioneren van het UPLC-MS systeem met de eerste twee injecties, controleer de piekgebied (<25% RSD), retentietijden (+/- 0,05 min) en massanauwkeurigheid (+/- 3 ppm) van de derde tot en met de vijfde injecties. Deze parameters kunnen moeten worden aangepast om te passen bij de specificaties van het instrument dat wordt gebruikt voor dataverwerving.</li>
	<li>Als QC-monsters slagen, verzamel gegevens over serummonsters voor die twee platen. Als QC-monsters mislukken, wordt monstersgegevens niet verzameld totdat het probleem is opgelost en de QC-monsters zijn geslaagd. In ons laboratorium hebben we gevonden dat deze parameters constant stabiel zijn

<ol><li>Theodoridis, G., Gika, H. G., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometry-Based+Holistic+Analytical+Approaches+for+Metabolite+Profiling+in+Systems+Biology+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometry-Based Holistic Analytical Approaches for Metabolite Profiling in Systems Biology Studies.</a> Mass Spectrom. Rev. 30, 884-906 (2011).</li>
<li>Zelena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+robust+and+repeatable+UPLC-MS+method+for+the+long-term+metabolomic+study+of+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of a robust and repeatable UPLC-MS method for the long-term metabolomic study of human serum.</a> Analytical Chemistry. 81, 1357-1364 (2009).</li>
<li>Michopoulos, F., Lai, L., Gika, H., Theodoridis, G., Wilson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UPLC-MS-based+analysis+of+human+plasma+for+metabonomics+using+solvent+precipitation+or+solid+phase+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">UPLC-MS-based analysis of human plasma for metabonomics using solvent precipitation or solid phase extraction.</a> Journal of Proteome Research. 8, 2114-2121 (2009).</li>
<li>Kamburov, A., Cavill, R., Ebbels, T. M., Herwig, R., Keun, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+pathway-level+analysis+of+transcriptomics+and+metabolomics+data+with+IMPaLA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Integrated pathway-level analysis of transcriptomics and metabolomics data with IMPaLA.</a> Bioinformatics. 27, 2917-2918 (2011).</li>
<li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MetPA%3A+a+web-based+metabolomics+tool+for+pathway+analysis+and+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MetPA: a web-based metabolomics tool for pathway analysis and visualization.</a> Bioinformatics. 26, 2342-2344 (2010).</li>
<li>Johnson, C. H., Gonzalez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+opportunities+of+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Challenges and opportunities of metabolomics.</a> J. Cell. Physiol. 227, 2975-2981 (2012).</li>
<li>Issaq, H. J., Waybright, T. J., Veenstra, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+biomarker+discovery%3A+Opportunities+and+pitfalls+in+analytical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Cancer biomarker discovery: Opportunities and pitfalls in analytical methods.</a> Electrophoresis. 32, 967-975 (2011).</li>
<li>Zhou, B., Xiao, J. F., Tuli, L., Ressom, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC-MS-based+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">LC-MS-based metabolomics.</a> Mol. Biosyst. 8, 470-481 (2012).</li>
<li>Weckwerth, W., Morgenthal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics%3A+from+pattern+recognition+to+biological+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Metabolomics: from pattern recognition to biological interpretation.</a> Drug Discov. Today. 10, 1551-1558 (2005).</li>
<li>Smith, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((METLIN+-+A+metabolite+mass+spectral+database%5BTitle%5D)+AND+%22Ther.+Drug+Monit%22%5BJournal%5D)">METLIN - A metabolite mass spectral database.</a> Ther. Drug Monit. 27, 747-751 (2005).</li>
<li>Culpepper, S. A., Aguinis, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R+is+for+Revolution%3A+A+Cutting-Edge%2C+Free%2C+Open+Source+Statistical+Package%5BTitle%5D)+AND+%22Organ+Res.+Methods%22%5BJournal%5D)">R is for Revolution: A Cutting-Edge, Free, Open Source Statistical Package.</a> Organ Res. Methods. 14, 735-740 (2011).</li>
<li>Sumner, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+minimum+reporting+standards+for+chemical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Proposed minimum reporting standards for chemical analysis.</a> Metabolomics. 3, 211-221 (2007).</li>
<li>Vuckovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+trends+and+challenges+in+sample+preparation+for+global+metabolomics+using+liquid+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Current trends and challenges in sample preparation for global metabolomics using liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Anal. Bioanal. Chem. 403, 1523-1548 (2012).</li>
<li>Garcia-Canaveras, J. C., Donato, M. T., Castell, J. V., Lahoz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+untargeted+metabonomic+analysis+of+human+steatotic+liver+tissue+by+RP+and+HILIC+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry+reveals+important+metabolic+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">A comprehensive untargeted metabonomic analysis of human steatotic liver tissue by RP and HILIC chromatography coupled to mass spectrometry reveals important metabolic alterations.</a> Journal of Proteome Research. 10, 4825-4834 (2011).</li>
<li>Nordstrom, A., Want, E., Northen, T., Lehtio, J., Siuzdak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+ionization+mass+spectrometry+strategy+used+to+reveal+the+complexity+of+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple ionization mass spectrometry strategy used to reveal the complexity of metabolomics.</a> Analytical Chemistry. 80, 421-429 (2008).</li>
<li>Horai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MassBank%3A+a+public+repository+for+sharing+mass+spectral+data+for+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">MassBank: a public repository for sharing mass spectral data for life sciences.</a> J. Mass Spectrom. 45, 703-714 (2010).</li>
<li>Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+metabolite+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Advances in metabolite identification.</a> Bioanalysis. 3, 1769-1782 (2011).</li>
<li>Broeckling, C., Heuberger, A., Prince, J., Ingelsson, E., Prenni, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assigning+precursor-product+ion+relationships+in+indiscriminant+MS%2FMS+data+from+non-targeted+metabolite+profiling+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Assigning precursor-product ion relationships in indiscriminant MS/MS data from non-targeted metabolite profiling studies.</a> Metabolomics. , 1-11 (2012).</li>
<li>Kangas, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+identification+software+%28ISIS%29%3A+a+machine+learning+approach+to+tandem+mass+spectral+identification+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">In silico identification software (ISIS): a machine learning approach to tandem mass spectral identification of lipids.</a> Bioinformatics. 28, 1705-1713 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Deze tutorial dient als startpunt voor het uitvoeren van grootschalige niet-gerichte metabolietprofilering door UPLC-MS. De workflow is gericht op metabolieten die kunnen worden geëxtraheerd met een waterige methanoloplosmiddel, vastgehouden op een C8 of C18 UPLC-kolom en gedetecteerd als positieve ionen. In de situatie waar er geen vooraf bepaalde voorkeur is voor een specifieke metabolietenklasse en een hypothese genererend globaal profiel gewenst is, is dit protocol waardevol omdat het zal resulteren in de detectie va...

De termijn "metabolomics" kan veel dingen omvatten. Bijvoorbeeld, een metabolomics experiment kan worden uitgevoerd met behulp van een verscheidenheid aan analytische platforms zoals NMR en zowel gas- als vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie. Bovendien kunnen metabolomics experimenten op een gerichte of niet-gerichte manier worden uitgevoerd, of een combinatie van beide. Een gericht metabolomics experiment zal een gerichte analyse van een panel van moleculen omvatten die belangrijk zijn voor de biologische vraag die ter hand is (bijv. kleine moleculen die betrokken zijn bij de TCA-cyclus zal een nauwkeurige kwantificering van die route mogelijk maken). In deze situatie bepaalt de biologische hypothese de keuze van metabolieten die in de analyse worden gericht en worden de analytische stappen geoptimaliseerd voor de detectie van deze moleculen. Alternatief, een niet-gericht metabolomics experiment genereert hypothesen. In dit geval wordt het experiment op een brede en onbevooroordeelde manier uitgevoerd om de detectie van zoveel mogelijk metabolieten mogelijk te maken. De resultaten van een niet-gericht experiment zullen de volgende stap van het onderzoek aanjagen (wat in veel gevallen een gericht metabolomics werkstroom kan omvatten). Het is ook mogelijk om de twee benaderingen te combineren, in welk geval een experiment op een niet-gerichte manier wordt uitgevoerd terwijl gelijktijdig een panel van bekende moleculen binnen de gegevens wordt gemonitord. 
De tutorial die hier wordt gepresenteerd is specifiek gericht op niet-gericht metaboliet profiel van serum. Zoals hierboven beschreven, biedt de niet-gerichte aanpak een onbevooroordeelde weergave van de detecteerbare metabolieten, kan grote hoeveelheden informatie genereren en uiteindelijk nieuwe ontdekkingen mogelijk maken. Het gebruik van deze aanpak, specifiek het gebruik van ultra-prestatie vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (UPLC-MS), wordt wijdverspreid 1, 2, 3 en omvat de volgende stappen: (1) experimenteel ontwerp (2) monsterverzameling (3) monstervoorbereiding (4) data-acquisitie door UPLC-MS (5) data voorverwerking (piekdetectie, integratie, uitlijning en normalisatie) (6) statistische data-analyse (zowel uni- als multivariate) (7) metabolietidentificatie en (8) biologische interpretatie. 
Momenteel zijn er geen gevestigde standaardmethoden voor UPLC-MS gebaseerde niet-gerichte metaboliet profiel en daaropvolgende data voorverwerkingsstappen. Dit gebrek aan standaardisatie is deels te wijten aan een van de belangrijkste analytische uitdagingen van metaboliet profiel; de chemische diversiteit van het metaboloom. Vanwege deze diversiteit is het onmogelijk voor een enkele extractiemethode of massaspectrometrie acquisitiemethode om een uitgebreide dekking van alle metabolieten in een enkele analyse te bieden. In concept kan metabolietdekking worden gemaximaliseerd door het gebruik van meerdere extracties (bijv. waterig, methanol, chloroform: methanol, etc.) gekoppeld aan verschillende chromatografische condities (bijv. omgekeerde fase, HILIC, etc.) en verschillende ionisatiemodi (bijv. positieve ion, negatieve ion, chemische ionisatie, etc.). Vaak hebben onderzoekers echter geen vooraf bepaalde voorkeur voor een specifieke chemische klasse en dus is de kosten van het uitvoeren van meerdere extracties en instrumentacquisities niet gerechtvaardigd, vooral voor grootschalige experimenten. Daarom werd de video tutorial die hier wordt gepresenteerd ontworpen om een algemene procedure te bieden voor grootschalige niet-gerichte metaboliet profiel van serum door UPLC-MS. Het zal nieuwe en gevestigde laboratoria in staat stellen om deze soorten experimenten uit te voeren en de bouwstenen waarop ze de aanpak kunnen uitbreiden voor verschillende monstersoorten, specifieke chemische klassen of gerichte analyse. Concreet zal dit protocol de volgende stappen omvatten: serum monstervoorbereiding, monsterorganisatie voor grootschalige studies, UPLC-MS data-acquisitie, kwaliteitscontrole (QC) procedures en metabolietidentificatie. Strategieën voor data voorverwerking en statistische analyse worden ook gepresenteerd.
Het protocol zal zich niet richten op de stappen van experimenteel ontwerp, monsterverzameling of biologische data-interpretatie, aangezien dit buiten het bereik van deze tutorial valt. Er bestaan echter veel bronnen in de literatuur voor deze onderwerpen en de auteurs moedigen onderzoekers die nieuw zijn in metabolomics aan om deze grondig te onderzoeken 4, 5, 6, 7, 8, 9. In het bijzonder is experimenteel ontwerp uiterst belangrijk en is cruciaal voor het succes van een niet-gericht metabolomics experiment. Factoren zoals geschikte biologische replicatie en consistentie in monsterverzameling procedure (bijv. tijd op de werkbank, opslagtemperatuur, opslagtijd, invries-ontdooi-cycli, etc.) moeten worden overwogen om een ​​levensvatbaar onderzoek te garanderen en om een ​​gepaste biologische interpretatie van de gegevens mogelijk te maken.

<table><tbody><tr><td>96 well plates - 500 &mu;l wells</td><td>VWR</td><td>40002-020</td><td>Deze worden gebruikt voor monstervoorbereiding</td></tr><tr><td>96 well plate mats</td><td>VWR</td><td>89026-514</td><td>Deze worden gebruikt voor monstervoorbereiding</td></tr><tr><td>96 well plates - 350 &mu;l wells</td><td>Waters Corporation</td><td>WAT058943</td><td>Deze worden gebruikt voor monsterinjectie</td></tr><tr><td>96 well plate mats</td><td>Waters Corporation</td><td>186000857</td><td>Deze worden gebruikt voor monsterinjectie</td></tr><tr><td>96 well plate heat seals</td><td>Waters Corporation</td><td>186002789</td><td>Deze kunnen worden gebruikt voor monsterinjectie of langetermijnopslag</td></tr><tr><td>96 well plate heat sealer </td><td>Waters Corporation</td><td>186002786</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS grade methanol</td><td>Fluka</td><td>34966</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS grade acetonitrile</td><td>Fluka</td><td>34967</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS grade aater</td><td>Fluka</td><td>39253</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS grade formic acid</td><td>Fluka</td><td>56302</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel electronic pipettor</td><td>VWR</td><td>89000-674</td><td></td></tr><tr><td>Pipett tips</td><td>Eclipse (aangeschaft via Light Labs)</td><td>B-5061/B-4061</td><td></td></tr><tr><td>Chilled centrifuge - Allegra X-12R</td><td>Beckman Coulter</td><td>N/A - contacteer Beckman Coulter</td><td></td></tr><tr><td>Acquity Ultra performance Liquid Chromatography (UPLC) System</td><td>Waters Corporation</td><td>N/A - contacteer Waters Corporation</td><td></td></tr><tr><td>UPLC C8 column (gradient option a)</td><td>Waters Corporation</td><td>186002876</td><td></td></tr><tr><td>UPLC T3 column (gradient option b) </td><td>Waters Corporation</td><td>186003536</td><td></td></tr><tr><td>Xevo G2 Q-TOF Mass spectrometer</td><td>Waters Corporation</td><td>N/A - contacteer Waters Corporation</td><td></td></tr></tbody></table>

large scale niet-gerichte metaboloom profilering van serum door ultra performance liquid chromatography-massaspectrometrie (uplc-ms)

Large Scale Non-targeted Metabolomic Profiling of Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (UPLC-MS)

Non-doelgerichte metabolietprofilering door ultra performante vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (UPLC-MS) is een krachtige techniek om metabolisme te onderzoeken. De aanpak biedt een onbevooroordeelde en diepgaande analyse die de ontwikkeling van diagnostische tests, nieuwe therapieën en een betere begrip van ziekteprocessen kan mogelijk maken. De inherente chemische diversiteit van het metabool veroorzaakt aanzienlijke analytische uitdagingen en er is geen enkele experimentele aanpak die alle metabolieten kan detecteren. Bovendien vereist de biologische variatie in individueel metabolisme en de afhankelijkheid van metabolisme van omgevingsfactoren grote steekproeven om het juiste statistische vermogen te bereiken dat nodig is voor zinvolle biologische interpretatie. Om deze uitdagingen aan te pakken, beschrijft deze tutorial een analytische workflow voor grootschalige non-doelgerichte metabolietprofilering van serum door UPLC-MS. De procedure omvat richtlijnen voor steekproeforganisatie en -voorbereiding, dataverwerving, kwaliteitscontrole en metabolietenidentificatie en zal betrouwbare dataverwerving voor grote experimenten mogelijk maken en een startpunt bieden voor laboratoria die nieuw zijn in non-doelgerichte metabolietprofilering door UPLC-MS.

De basisstappen voor de analyse van een niet-doelgerichte metabolietprofilering via UPLC-MS worden schetsmatig weergegeven in Figuur 1. De ruwe gegevens voor elk monster kunnen worden gevisualiseerd als een base peak-chromatogram. Figuur 2 toont een voorbeeld van een base peak-chromatogram van een serummonster dat is geanalyseerd met gradiëntoptie (a) in de handleiding. Na de hierboven beschreven statistische analyse wordt geprobeerd de metabolieten te identificeren voor alle statistisch...

Non-gerichte metabolietprofilering door ultra-prestatie vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (UPLC-MS) is een krachtige techniek om metabolisme te onderzoeken. Dit artikel schetst een typische werkstroom die wordt gebruikt voor non-gerichte metabolietprofilering van serum, inclusief monsterorganisatie en -voorbereiding, dataverwerving, data-analyse, kwaliteitscontrole en metabolietidentificatie.

Large Scale Niet-gerichte metaboloom profilering van Serum door Ultra Performance Liquid Chromatography-massaspectrometrie (UPLC-MS)

Non-targeted metabolite profiling by ultra performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) is a powerful technique to ...

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van een robuuste, niet-gerichte metabolietprofilering van serum in een grootschalig experiment. Extraheer eerst de metabolieten in een plaatformaat. Stel een robuust QC-monster en een methode vast om de analytische stabiliteit in de loop van de tijd te waarborgen.Verkrijg vervolgens massaspectrale gegevens van de QC- en gerandomiseerde serummonsters in replica, en ga over tot data-preprocessing, statistische analyse en metabolietidentificatie. De resultaten van niet-doelgerichte metabolietprofilering via U-P-L-C-M-S kunnen worden gebruikt om kleine molecuulbiomarkers in serum te identificeren. Het protocol wordt hier gepresenteerd voor de analyse van serum.Het kan echter eenvoudig worden uitgebreid naar de analyse van andere biologische vloeistoffen, zoals urine, weefsel en celkweekextracten. Open een spreadsheet om een plaatmap voor de monsterpreparatie te maken. Voer in de eerste kolom de monsterlijst in in de volgorde van laden. Voer in de tweede kolom de posities van de 96-wellplaat in, gebruikmakend van de juiste nomenclatuur voor uw autosampler-software.Reserveer één well per plaat voor het QC-monster. Als uw lc-autosampler twee platen tegelijk kan verwerken, verdeel dan de monsterlijst in batches van 190 en sla deze informatie op in een tweede werkblad. Randomiseer binnen elk van deze batches de volgorde van de injecties.Kopieer en plak nu uw injectievolgorde in het software-volgsysteem van de LCMS. Reserveer de eerste drie rijen van de monsterwachtrij voor injecties ter conditionering van de kolom. Bereid een voorraad van 10 milliliter QC-monster voor die minimaal vier verbindingen met een bekende massa en retentietijd bevat die over de chromatografische elutie van het experiment verspreid liggen.Ontdooi de serummonsters op ijs en vortex deze voorzichtig gedurende ongeveer vijf seconden. Bevochtig de tips van een 12-kanaals pipet vooraf met methanol om lekken van de tips tijdens het dispenseren van de monsters te voorkomen. Voeg vervolgens 370 µL koude methanol toe aan elke well van een 96-wells transferplaat, en 100 µL van elk monster aan de overeenkomstige locatie op de plaat volgens de plaatoverzichten.Dek de platen af en incubeer ze 30 minuten bij -80 °C. Centrifugeer de platen 30 minuten bij 3.200 ×g en 4 °C om de eiwitten te laten neerslaan. Draag vervolgens 250 µL van de supernatant over naar een nieuwe 96-wells plaat en herhaal de centrifugatiestap.Breng nu aliquots van 60 µL van het snat over naar 3 96-wellplaten die geschikt zijn voor de UPLC- of lc-autosampler. Voeg 100 µL van de QC-monstermix toe aan de gereserveerde well-positie op de plaat. Seal elke plaat met adhesiefilm.Stel de autosampler in op vier graden Celsius. Plaats de eerste twee platen in de autosampler. Stel de acquisitiemethode in met behulp van een van de twee alternatieve reverse phase gradiënten.Gradient A is gericht op apolaire moleculen, terwijl gradient B een verbeterde dekking biedt voor matig polaire moleculen. Stel de massaspectrometer in om gegevens te verzamelen in positieve modus, met een scan van 50 tot 1200 massa-ladingsverhouding.Aanvullende specifieke instrumentcondities zullen variëren afhankelijk van het gebruikte systeem aan het begin van elke twee platen met monsters. Injecteer de QC-monsters vijf keer handmatig. Gebruik de derde tot en met vijfde QC-injecties om te controleren op een piekarea met een RSD van minder dan 25%, een retentietijd van plus of minus 0,05 minuten en een massa-nauwkeurigheid van plus of minus drie parts per million.Deze parameters moeten mogelijk worden aangepast aan de specificaties van het instrument dat wordt gebruikt voor de data-acquisitie. Als de QC-monsters voldoen, worden de data van de serummonsters voor deze twee platen verzameld zodra de acquisitie van de volledige dataset is voltooid. Voer featuredetectie, uitlijning en normalisatie uit van de massaspectrometriegegevens voor de volledige dataset.Voer vervolgens een statistische analyse uit om moleculaire kenmerken van biologisch belang te bepalen. Deze stappen worden beschreven in het tekstprotocol. De volgende workflow is een conceptueel overzicht van het proces voor metabolietidentificatie.Een alternatieve strategie wordt beschreven in het tekstprotocol. Gebruik software om een molecuulformule te voorspellen op basis van de exacte massa en de isotopische distributie van de significante moleculaire kenmerken. Zoek vervolgens de exacte massametingen op in interne of publieke metabolieten-databanken.Databases filteren de kandidaat-metabolietidentificaties op basis van massafout van de voorspelde molecuulformule, retentietijd, in-source fragmentatie en biologische relevantie in de trends die zijn waargenomen met betrekking tot het experimentele ontwerp. Dit resulteert in een vermoedelijke metabolietidentificatie. Absolute identificatie vereist dat de nauwkeurige massa, retentietijd en fragmentatie van de experimentele verbinding overeenkomen met die van een authentieke standaard van de vermoedelijke metaboliet.Wijs ten slotte een betrouwbaarheidsniveau toe aan alle gerapporteerde metabolietidentificaties op basis van de aanbevelingen van het Metabolomics Standards Initiative. Deze workflow beschrijft de basisstappen van de analyse voor het uitvoeren van een niet-doelgerichte metabolietprofileringsexperiment via U-P-L-C-M-S. De ruwe gegevens kunnen worden gevisualiseerd als een base peak chromatogram.Dit voorbeeld toont een serummonster dat na statistische analyse via gradiënt is geanalyseerd. Voor alle biologisch relevante en statistisch significante moleculaire kenmerken wordt geprobeerd de metaboliet te identificeren. Hier is cafeïne in menselijk serum geïdentificeerd door de chromatografische retentietijd, de accurate massa en het fragmentatiepatroon van het experimentele moleculaire kenmerk te vergelijken met die van een authentieke standaard van de vermeende metaboliet.Dit is een voorbeeld van een metabolite-identificatie van niveau één. Na het bekijken van deze video heeft u een goed begrip van hoe u de analytische stabiliteit waarborgt tijdens grootschalige, non-targeted metabolite-profiling van serum met behulp van UPLC-ms. Analytische stabiliteit is echter slechts één belangrijk aspect van een succesvol metabolite-profiling-experiment. Het experimentele ontwerp en de daaropvolgende data-analyse en interpretatie zijn evenzeer kritisch.Buiten het bereik van deze videotutorial worden deze onderwerpen echter geïntroduceerd en besproken in het tekstprotocol.

large-scale-non-targeted-metabolomic-profiling-serum-ultra

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Ongerichte metabolomics biedt een hypothese genererende momentopname van een metabool profiel. Dit protocol zal de extractie en analyse van metabolieten uit cellen, serum of weefsel tonen. Een reeks van metabolieten worden onderzocht met behulp van vloeistof-vloeistof fase-extractie, microflow UltraPerformance vloeistofchromatografie / hoge-resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS) gekoppeld aan differentiële analyse software.

Ongerichte Metabolomics uit biologische grondstoffen gebruiken UltraPerformance Liquid Chromatography-hoge resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS)

Metaboliet profilering is waardevol geweest in de studie van het metabolisme in gezondheid en ziekte. Gebruik te maken van de normale fasen vloeistofchromatografie gekoppeld aan een hoge resolutie massaspectrometrie met polariteit schakelen en een snelle duty cycle, beschrijven we een protocol bij de polaire metabole samenstelling van biologisch materiaal met een hoge gevoeligheid, nauwkeurigheid en resolutie te analyseren.

Een strategie voor de gevoelige, Large Scale Quantitative Metabolomics

De betrouwbaarheid van de resultaten in metabolomics experimenten afhankelijk van de effectiviteit en de reproduceerbaarheid van de monstervoorbereiding. Beschreven is een strenge en diepgaande methode die extractie van metabolieten van biologische vloeistoffen maakt met de mogelijkheid om later te analyseren tot duizenden verbindingen, of gewoon de verbinding klassen van belang.

Multi-step Voorbereiding Techniek om meerdere Metabolite Compound Klassen voor In-diepte en Informatieve Metabolomic Analyse Recover

Een protocol voor het metabool profiel van biologische monsters door capillaire elektroforese-massaspectrometrie met behulp van een sheathless poreuze tip interface design wordt gepresenteerd.

Sheathless capillaire elektroforese-massaspectrometrie voor metabole of Biological Samples

We presenteren een protocol om te kwantificeren nauwkeurig eiwitten met isobaar etikettering, uitgebreide fractionering, bioinformatica tools en kwaliteitscontrole stappen in combinatie met vloeibare chromatografie geïnterfacet met een hoge resolutie massaspectrometer.

Diepe Proteoom profilering door isobaar Labeling, uitgebreide vloeistofchromatografie, massaspectrometrie en Software-bijgewoonde kwantificering

Een gedetailleerd protocol wordt beschreven voor de scheiding, identificatie en karakterisering van proteoforms in EiwitSteekproeven met behulp van capillaire zone elektroforese-electrospray ionisatie-tandem massaspectrometrie (CZE-ESI-MS/MS). Het protocol kan worden gebruikt voor de hoge-resolutie karakterisatie van proteoforms in simple EiwitSteekproeven en de grootschalige identificatie van proteoforms in complexe Proteoom monsters.

Grootschalige topdown Proteomics met behulp van capillaire Zone elektroforese Tandem massaspectrometrie

Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer methode voor uitgebreide drug surveillance waarmee voor de betere resolutie en detectie van grote panelen van drugs van misbruik en hun metabolieten, met kwaliteitscontrole op basis van multisegment injectie-capillair elektroforese-massaspectrometrie.

High-throughput en uitgebreide Drug Surveillance met behulp van spectrometrie van de massa van het Multisegment injectie-capillaire elektroforese

Een methode voor de ongerichte analyse van tarwekorrels metabolieten en lipiden wordt gepresenteerd. Het protocol omvat een acetonitril metabolietextractiemethode en omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometriemethodologie, met acquisitie in positieve en negatieve elektrospray ionisatiemodi.

Ongerichte vloeibare chromatografie-massaspectrometrie-gebaseerde metabolomics analyse van tarwekorrel

De protocollen beschrijven hoogwaardige vloeistofchromatografiemethoden gekoppeld aan brekingsindex of massaspectrometrische detectie voor het bestuderen van metabole reacties in complexe op lysaat gebaseerde celvrije systemen.

Vloeistofchromatografie gekoppeld aan brekingsindex of massaspectrometrische detectie voor metabolietprofilering in op lysaat gebaseerde celvrije systemen

Het doel van dit protocol is om fenolische metabolieten in plasma te detecteren met behulp van een semi-gerichte chromatografie-massaspectrometriemethode.

Semi-gerichte ultra-high-performance chromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie analyse van fenolische metabolieten in plasma van oudere volwassenen

Leer niet-gerichte metabolietprofilering van serum op grote schaal met UPLC-MS. Dit protocol omvat monsterbereiding, kwaliteitscontrole en data-analyse voor het identificeren van kleine molecuul biomarkers.

Large Scale Niet-gerichte metaboloom profilering van Serum door Ultra Performance Liquid Chromatography-massaspectrometrie (UPLC-MS) (Video) | JoVE Journal

Large Scale Niet-gerichte metaboloom profilering van Serum door Ultra Performance Liquid Chromatography-massaspectrometrie (UPLC-MS)

Meer video's verkennen