RNA secundaire structuur Voorspelling behulp van High-throughput SHAPE

Het algemene doel van deze procedure is de voorspelling van de secundaire RNA-structuur met een resolutie van één nucleotide. Dit wordt bereikt door eerst de gevouwen RNA chemisch te modificeren met een elektrofiel reagens dat S enkele strengen of flexibele gebieden van RNA isoleert. De tweede stap is om reverse transcriptie te gebruiken om sites van het RNA te detecteren die chemisch zijn gemodificeerd.

Vervolgens worden de CD NA-producten van reverse transcriptie gefractioneerd door capillaire elektroforese. De laatste stap is gegevensverwerking en normalisatie. Uiteindelijk wordt RNA-structuursoftware gebruikt om de secundaire RNA-structuur te voorspellen met behulp van de pseudo-vrije energie-beperkingen die zijn afgeleid uit vormanalyse.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van moleculaire biologie, zoals hoe RNA-structuur de functies van katalytische en niet-actuele RNA's bepaalt, en hoe virale RNA-genen de multifunctionele eigenschappen van hun genomen reguleren. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot onze therapie en diagnose van virale ziekten of kanker, omdat inzicht in de secundaire structuur van RNA kan helpen bij het ontwerp van op structuur gebaseerde medicijnen. Hoewel deze methode inzichten biedt in de structuur van RNA's die worden geproduceerd door in vitro transcriptie, kan deze ook in vivo worden toegepast omdat vormreagentia celdoorlaatbaar zijn.

Voordat u met deze procedure begint, bereidt u RNA voor door in vitro transcriptie. Gebruik een commercieel transcriptiekit. RNA's moeten worden bewaard in TE-buffer tussen min 20 en min 80 graden Celsius in een microcentrifugebuisje van 0,5 microliter.

Verdun 12 picomol RNA tot 18 microliter met water en voeg twee microliter van een 10 x renatuurbuffermix toe door op de buis te tikken, gevolgd door kort draaien. Verhit het mengsel in de buis gedurende één minuut tot 85 graden Celsius en koel vervolgens af tot vier graden Celsius met een snelheid van 0,1 graden Celsius per seconde. Voeg 100 microliter water en 30 microliter vijfvoudig opvouwbuffer toe aan het microcentrifugebuisje. Daarna incubeert u de inhoud van de buis gedurende 30 tot 60 minuten op 37 graden Celsius, afhankelijk van het RNA dat wordt gevouwen.

In het algemeen vereisen magnesiumafhankelijke opvouwing van langere en meer gestructureerde RNA's langere incubatietijden. Breng een alivuot van 72 microliter over naar elk van twee microcentrifugebuisjes van 0,5 milliliter, die moeten worden gelabeld als gemodificeerd en controle. De volgende stap is om acht microliter anhydrisch dimethylsulfoxide toe te voegen aan de controlemix en deze opzij te zetten. Voeg vervolgens acht microliter van 10 x en MIA toe aan de gemodificeerde mix.

Incubeer de gemodificeerde en controlemix gedurende 50 minuten op 37 graden Celsius. Voeg acht microliter van drie natriumacetaat pH 5,28 microliter van 100 millimolair EDTA 240 microliter koude ethanol en één microliter van 10 milligram per milliliter. Glycogeen toe aan de gemodificeerde gemengde buis om het gemodificeerde RNA te bezinken. Bewaar de inhoud van de buis twee uur in de koelkast bij min 20 graden Celsius en centrifugeer vervolgens gedurende 30 minuten bij 14.000 G op vier graden Celsius.

Was vervolgens de pellet tweemaal met koud 70% ethanol en centrifugeer gedurende vijf minuten. Verwijder na elke wasbeurt het supernatant met de micropipet en laat het pellet vijf minuten aan de lucht drogen. Bereid bij kamertemperatuur de gemodificeerde en controlemonsters voor op reverse transcriptie in microcentrifugebuisjes van 0,5 milliliter.

Voor de gemodificeerde reactiemix vijf microliter gemodificeerd RNA, zes microliter water en één microliter van een 10 micromolair sci vijf gelabelde primeroplossing. Voor de controlereactiemix vijf microliter controle-RNA, zes microliter water en één microliter van een 10 micromolair sci 5,5 gelabelde primeroplossing. Plaats de buisjes in een thermische cycler en kniel de primer naar het RNA.

Tijdens het knielen bereidt u een 2,5 x RT-mix voor. Voor elke RT-reactiemix goed mengen en incuberen bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten voordat u deze toevoegt aan de knielreacties. Zodra de temperatuur van de knielreacties 50 graden Celsius bereikt, voegt u acht microliter van 2,5 XRT toe.

Meng en incubeer gedurende 50 minuten bij 50 graden Celsius. Hydrolyseer vervolgens het RNA door één microliter van vier molair natriumhydroxide toe te voegen en te verhitten tot 90 graden Celsius gedurende drie minuten. Koel de reacties af op ijs en neutraliseer ze vervolgens door twee microliter van twee molair zoutzuur toe te voegen.

Combineer nu de gemodificeerde en controlereacties en voeg 0,1 volume of één tiende van het totale reactievolume van drie molair natriumacetaat en 100 millimolair EDTA 1,5 volume van koud ethanol en één microliter van 10 milligram per milliliter toe. Glycogeen. Dit resulteert in het neerslaan van het CDNA uit de oplossing. Bewaar de oplossing gedurende twee uur in de koelkast en centrifugeer vervolgens gedurende 30 minuten bij 14.000 G op vier graden Celsius.

Was de pellet tweemaal met koud 70% ethanol, suspendeer de gepelletiseerde CD NA in 40 microliter de-geïoniseerd formaamid door het verhitten tot 65 graden Celsius gedurende 10 minuten, gevolgd door krachtig vortexen gedurende ten minste 30 minuten voor de bereiding van de sequentiereactie in een microcentrifugebuisje van 0,5 milliliter. Meng 40 microliter van de DDA-terminatiemix. Vijf PICA-molen van het DNA-sjabloon, 4,6 microliter van 10 x sease-buffer en 10 microliter van goed-gelezen D twee gelabelde primer. Voeg aan dit mengsel 4,6 microliter QUIN A toe en verdun met water totdat het totale volume 82 microliter is.

Bereid een tweede sequentiereactie op dezelfde manier voor met behulp van DDT en lycor IR 800 gelabelde primer in plaats daarvan. Ga vervolgens verder met PCR-amplificatie volgens de aanbevolen USB-condities. Voeg 16 microliter van drie molair natriumacetaat pH 5,2 16 microliter van 100 millimolair EDTA, é