Gelijktijdig Pre-en post-synaptische Elektrofysiologische Opnemen vanaf Xenopus Zenuw-spier Co-culturen

Het algemene doel van deze procedure is om primaire culturen van synaptisch gekoppelde spinale neuronen en spiercellen uit xenopus-embryo's te verkrijgen. Dit wordt bereikt door eerst het fokken van xenopus te induceren door injectie van humaan chorion in atropine in zowel mannelijke als vrouwelijke kikkers en het verzamelen van bevruchte eieren. De tweede stap is om de jellycoat en fatel en membranen van stadium 22 embryo's te verwijderen.

Vervolgens worden spinale neuronen en spieren geïsoleerd uit de embryo's en wordt de huid verwijderd en weggegooid. De laatste stap is om de geïsoleerde cellen in kweekschalen te plateren en de vorming van functionele neuromusculaire juncties toe te staan. Uiteindelijk kunnen functionele synaptische verbindingen worden aangetoond met gelijktijdige gepaarde patch clamp opnamen van neuronen en spiercellen in cultuur.

De schoonheid van deze techniek is dat deze een gemakkelijk toegankelijke synaptische bereiding van gewervelde dieren oplevert. Het kan worden gebruikt om de neurotransmitterafgifte te monitoren met postsynaptische elektrofysiologische opnamen terwijl gelijktijdig de presynaptische ionenvoorkomst wordt gemeten. Bovendien zijn de methoden duidelijk en eenvoudig, vereisen geen speciaal apparatuur verder dan een dissectief microscoop, en kunnen de kweekjes vervolgens worden bewaard bij kamertemperatuur in een eenvoudig kweekmedium.

Deze voorbereiding kan nuttig zijn om sleutelvraagstukken in het gebied van synaptische fysiologie te beantwoorden, inclusief hoe pre-synaptische, biochemische en biofysische gebeurtenissen zijn gekoppeld aan neurotransmitterafgifte. Bovendien is het ook nuttig voor de studie van neuromodulatie synaptogenese en synaptische plasticiteit Om deze procedure te beginnen, bereidt u de vereiste oplossingen voor volgens de bijbehorende handleiding. Maak vervolgens minimaal twee microdissectie-instrumenten door een minuchin-pin op het uiteinde van een glazen pastiëerpijp te lijmen.

Met Sano acryllijm, laat het scherpe uiteinde van de pin ongeveer 0,5 centimeter verder uitsteken dan het uiteinde van de pijp. Twee dagen voordat u de culturen bereidt, identificeert u een broedklare XUS-paar door een prominente roodachtige klauw aika op de vrouwelijke en donkere pigmentatie op het platte oppervlak van de voorpoten van de mannetjes te observeren. Vang vervolgens elke kikker en houd hem met de buikzijde naar beneden in een gootsteen met het net zodat hij kan ontsnappen.

Injecteer een milliliter HCG door het net en subcutaan in een van de dorsale lymfezakjes om ervoor te zorgen dat de dieren de pas gelegde en bevruchte eieren niet zullen vertrappen. Installeer een gezeefde bodem met een maasgrootte van een halve inch die één tot twee inches past op de bodem van de tank. Plaats vervolgens het broedpaar samen in een afgedekte 10 gallon tank met water.

Laat de kikkers gedurende 12 tot 48 uur ongestoord totdat er bevruchte eieren op de vloer onder het scherm worden waargenomen. Verwijder vervolgens de dieren uit de tank, maar laat de eieren nog minimaal 24 uur ongestoord. Dit paar kikkers kan na zes weken opnieuw worden gefokt.

Los vervolgens de embryo's van de bodem van de tank en breng ze over naar vier of vijf 60 bij 15 millimeter kweekschalen die 10%saline bevatten. Sorteer de embryo's op stadium volgens het schema van nieuwe coupe en Faber. Embryo's die er glad uitzien met licht, bruin en wit modelleren zoals die aan de linkerkant zijn ideaal. Aan de andere kant zijn embryo's met grote zwarte of witte vlekken zoals die aan de rechterkant over het algemeen ongezond en onbruikbaar.

In een laminaire stroomkap label en vul ongeveer halfweg 360 bij 15 millimeter steriele kweekschalen met 10%saline en een met CMF. Gebruik een steriele glazen pastiëerpijp om vijf tot tien, stadium 22 tot 24 embryo's over te brengen naar een van de schalen met 10%saline met de acht van een stereo zoom dissectiemicroscoop binnenin de kap, verwijder de jellycoat en viel membraan van elk embryo met behulp van twee paar steriele pincetten. Was de blote embryo's door ze een voor een door de resterende twee schalen met 10%saline te laten passeren en tenslotte in de schaal met CMF.

Houd vervolgens elk embryo voorzichtig maar stevig vast met een pincet en gebruik het microdissectie-instrument om de neurale buis en de bijbehorende myotomen te verwijderen, die zich op de meest dorsale kant van het dier bevinden. Doe dit door drie sneden te maken, een aan beide uiteinden van de locatie van de neurale buis en een derde net ventraal ervan. Verplaats vervolgens elke gedissecteerde neurale buismyotoom naar een schoon deel van de schaal weg van de dooiergranules en ander puin.

Na ongeveer 15 minuten in CMF, gebruik de pincet om de gepigmenteerde huid los te maken van het gedissekteerde weefsel en gooi de huid weg. Na een extra 30 tot 60 minuten zullen de cellen een zandheuvel vormen terwijl ze loslaten van elkaar. In deze procedure, ontdooi een 10 milliliter buisje kweekmedium, volgends 70 microliters ITS in 35 nanogram per milliliter, BDNF label en vul de 35 millimeter steriele kweekschalen ongeveer halfweg met L 15 kweekmedium.

Gebruik één kweekschaal voor elk embryo dat je hebt gedisseerd. Om een plateerpijp te maken, houd beide uiteinden van een glazen pastiëerpijp vast en plaats het taps toelopende gedeelte boven een vlam. Trek vervolgens de uiteinden ongeveer 10 centimeter uit elkaar.

Breek vervolgens het uiteinde af om de punt van ongeveer 0,2 millimeter te verkrijgen. Gebruik daarna de plateerpijp om de zandheuvel van één embryo op te zuigen. Zorg ervoor dat u de hoeveelheid opgezogen oplossing minimaliseert.

Drijf vervolgens de cellen uit op de bodem van een kweekschaal en plateer ze in verschillende lijnen. Laat de schalen met geplateerde cellen vervolgens minimaal 15 minuten ongestoord staan om de cellen tijd te geven om zich aan de schaal te hechten. Na 12 tot 24 uur in cultuur zullen de geplateerde cellen duidelijke morfologische kenmerken ontwikkelen.

Spiercellen worden bij