Gelijktijdig Pre-en post-synaptische Elektrofysiologische Opnemen vanaf

Het algemene doel van deze procedure is het verkrijgen van primaire culturen van synaptisch gekoppelde spinale neuronen en spiercellen uit xenopus-embryo's. Dit wordt bereikt door eerst voortplanting bij xenopus te induceren via injectie van humaan choriongonadotrofine bij zowel mannelijke als vrouwelijke kikkers en het verzamelen van bevruchte eieren. De tweede stap bestaat uit het verwijderen van de gelei-laag, het blastoderm en de membranen van embryo's in stadium 22.

Vervolgens worden de spinale neuronen en spieren uit de embryo's geïsoleerd, waarna de huid wordt verwijderd en weggegooid. De laatste stap is het uitplaten van de geïsoleerde cellen in kweekschaaltjes om de vorming van functionele neuromusculaire overgangen mogelijk te maken. Uiteindelijk kunnen functionele synaptische verbindingen worden aangetoond met gelijktijdige gepaarde patchclamp-registraties van neuronen en spiercellen in kweek.

Het mooie van deze techniek is dat het een gemakkelijk toegankelijke synaptische preparatie van vertebraten oplevert. Het kan worden gebruikt om de afgifte van neurotransmitters te monitoren met postsynaptische elektrofysiologische registraties, terwijl gelijktijdig de presynaptische ionconcentraties worden gemeten. Bovendien zijn de methoden helder en eenvoudig, waarbij geen speciale apparatuur buiten een dissectiemicroscoop nodig is, en de culturen kunnen vervolgens bij kamertemperatuur worden bewaard in een eenvoudig kweekmedium.

Deze preparatie kan nuttig zijn bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de synaptische fysiologie, waaronder hoe presynaptische, biochemische en biofysische gebeurtenissen gekoppeld zijn aan de afgifte van neurotransmitters. Daarnaast is het ook nuttig voor de studie naar neuromodulatie, synaptogenese en synaptische plasticiteit. Om deze procedure te starten, bereid je de benodigde oplossingen voor volgens het bijbehorende manuscript. Maak vervolgens ten minste twee microdissectie-instrumenten door een Minuchin-punaise aan het uiteinde van een glazen pastierpipet te lijmen.

Gebruik Sano acryllijm en zorg dat het scherpe uiteinde van de pin ongeveer 0,5 centimeter voorbij het uiteinde van de pipet uitsteekt. Identificeer twee dagen voor het voorbereiden van de culturen een paringsklaar paar XUS door te letten op een prominente roodachtige klauw aika bij het vrouwtje en donkere pigmentatie op het vlakke oppervlak van de voorpoten van het mannetje. Schep vervolgens elke kikker met een net op en houd deze in een gootsteen met het net, met de buikzijde naar beneden, zodat de kikker kan ontsnappen.

Injecteer one milliliter HCG door het net en subcutaan in een van de dorsale lymfezakken om te voorkomen dat de dieren de vers gelegde en bevruchte eieren vertrappen. Plaats een zeefbodem met een maaswijdte van half inch, gemonteerd op one to two inches vanaf de bodem van het aquarium. Plaats vervolgens het kweekpaar samen in een afgedekt 10 gallon aquarium met water.

Laat de kikkers 12 tot 48 uur ongestoord tot er bevruchte eieren op de bodem onder het scherm worden waargenomen. Verwijder vervolgens de dieren uit het aquarium, maar laat de eieren nog ten minste 24 uur ongemoeid. Dit paar kikkers kan na zes weken opnieuw worden gepaard.

Maak vervolgens de embryo's los van de bodem van het reservoir en breng ze over naar vier of vijf kweekschaaltjes van 60 bij 15 millimeter die 10% zoutoplossing bevatten. Sorteer de embryo's per stadium volgens het schema van Nieuwkoop en Faber. Embryo's die er glad uitzien met lichte, bruine en witte tekeningen, zoals die links, zijn ideaal. Daarentegen zijn embryo's met grote zwarte of witte vlekken, zoals die rechts, over het algemeen ongezond en onbruikbaar.

Label en vul in een laminaire flowkast ongeveer tot de helft 360 bij 15 millimeter steriele cultuurschalen met 10% zoutoplossing en één schaal met CMF. Breng met een steriele glazen Pasteurpipet vijf tot 10 embryo's in stadium 22 tot 24 over naar een van de schalen met 10% zoutoplossing. Verwijder onder een stereozoom-dissectiemicroscoop in de kast de gelei-omhulling en het vliezmembraan van elk embryo met twee paren steriele pincetten. Was de naakte embryo's door ze één voor één door de overige twee schalen met 10% zoutoplossing te halen, en breng ze tot slot over naar de schaal met CMF.

Houd vervolgens elk embryo voorzichtig maar stevig vast met een pincet en gebruik het microdissectie-instrument om de neurale buis en de bijbehorende myotomen te verwijderen, die zich aan de meest dorsale zijde van het dier bevinden. Doe dit door drie sneden te maken: één aan beide uiteinden van de locatie van de neurale buis en een derde net ventraal daarvan. Verplaats vervolgens elk gedissecteerde neurale buis-myotoom naar een schoon deel van de schaal, weg van de dooiergranules en ander debris.

Na ongeveer 15 minuten in CMF gebruikt u de pincet om de gepigmenteerde huid van het gedisseceerde weefsel te scheiden en gooit u de huid weg. Na nog eens 30 tot 60 minuten zullen de cellen een zandhoop vormen naarmate ze van elkaar lossociëren. Ontdooi voor deze procedure een buis van 10 milliliter kweekmedium, voeg vervolgens 70 microliters ITS toe in 35 nanogram per milliliter, BDNF-label en vul de 35 millimeter steriele kweekschalen voor ongeveer de helft met L 15 kweekmedium.

Gebruik één kweekschaal voor elk embryo dat u heeft gedissecteerd. Om een platingpipet te maken, houdt u beide uiteinden van een glazen pastierpipet vast en plaatst u het taps toelopende gedeelte boven een vlam. Trek vervolgens de uiteinden ongeveer 10 centimeter uit elkaar.

Breek vervolgens het uiteinde af om een punt van ongeveer 0,2 millimeter te verkrijgen. Gebruik daarna de uitplaatpipet om de zandstapel van één embryo op te zuigen. Let erop dat de hoeveelheid opgezogen oplossing tot een minimum wordt beperkt.

Breng vervolgens de cellen aan op de bodem van een kweekschaal en verdeel ze in verschillende lijnen. Laat de schalen met de geplaatste cellen daarna minstens 15 minuten ongestoord staan, zodat de cellen de tijd hebben om aan de schaal te hechten. Na 12 tot 24 uur in kweek zullen de geplaatste cellen duidelijke morfologische kenmerken ontwikkelen.

Spiercellen worden bijvoorbeeld spoelvormig en spinale neuronen ontwikkelen lange uitlopers. Functioneel synaptisch contact tussen varicositeiten en spiercellen kan worden bevestigd met gelijktijdige gepaarde elektrofysiologische registraties. Bereid hiervoor twee patch-elektroden voor de registratie voor: één voor de presynaptische varicositeit en één voor de spiercel.

Vul vervolgens de presynaptische elektrode met een oplossing die info terin bevat en de postsynaptische elektrode met een interne kaliumoplossing. Vervang daarna het medium in de kweekschaal door NFR. Breng het vervolgens over naar een omgekeerde microscoop die is uitgerust met fasecontrastoptiek, patch de presynaptische varicositeit met de elektrode die amphotericine bevat en de postsynaptische spiercel met de andere elektrode om de functionaliteit van de synaps te bevestigen, depolariseer de varicositeit met een patchclamp-versterker en observeer de gelijktijdige presynaptische en postsynaptische stromen.

Deze figuur toont een vergroting van 5 x van cellen en culturen direct na het uitplaten, en dit is dezelfde cultuur bij 40 x. Hier is de neuromusculaire overgang in cultuur, die het neuronale soma, de presynaptische varicositeit en de postsynaptische spiercel laat zien. Hier worden de presynaptische en postsynaptische stromen weergegeven.

Als reactie op de toepassing van incrementele voltage-stappen van 10 millivolt, gepresenteerd aan de presynaptische varicositeit van minus 30 millivolt tot plus 40 millivolt, was het rustpotentiaal voor beide cellen minus 70 millivolt. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer twee uur worden voltooid. Levensvatige celculturen kunnen vervolgens al na 24 uur worden verkregen en gedurende meerdere dagen worden onderhouden. Deze preparatie wordt al enkele jaren gebruikt en heeft geholpen bij het verklaren van enkele fundamentele eigenschappen van de neuromusculaire transmissie.

We hopen dat deze video bijdraagt aan verdere ontdekkingen door onderzoekers te helpen meer bekend te raken met deze krachtige en eenvoudige techniek.