Name: Gelijktijdig Pre-en post-synaptische Elektrofysiologische Opnemen vanaf Xenopus Zenuw-spier Co-culturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Leer hoe u gelijktijdige pre- en postsynaptische patch clamp-opnamen maakt van zenuw-spier co-culturen van Xenopus embryo's. Deze methode maakt het bestuderen van synaptische fysiologie en neurotransmittervrijgating mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gefinancierd door de NSF (0854551).

1. Pre-experimentele Voorbereiding <ol><li> Bereid de volgende oplossingen (zie tabel 1 voor samenstelling): (a) 1 liter NFR (Normal Frog Ringer), (b) 100 ml 10% zoutoplossing, (c) 100 ml CMF (Ca2 + / Mg2 +-vrije oplossing ), (d) 1 ml ITS (Insulin-transferrine-Selenium, Sigma I1884), (e) 100 ml L-15 kweekmedium, (f) 10 ml HCG (humaan choriongonadotrofine Sigma CG-10), (g) 100 ml K +-interne oplossing, (h) 100 ml K +-interne oplossing voor amfotericine B. De osmotische sterkte van oplossing 1 worden gecontroleerd of het ongeveer 260 mOsM met een dampdrukosmometer (bijv. Wescor model # 5100C) . </li><li> Filter steriliseer oplossingen (b) en (c). Solutions (a) (b) en (c) worden opgeslagen tot drie maanden bij 4 ° C. Maak een oplossing (d) door het toevoegen van 1 ml gedeïoniseerd H 2 O aan de injectieflacon met het gevriesdroogde poeder via een 25 gauge naald en spuit filter. Deze laatste oplossing cEen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 30 dagen. </li><li> Pesticide (e) in een laminaire stroming kap door het combineren van alle componenten in een beker of fles. Filter steriliseren de uiteindelijke oplossing en breng 10 ml porties in steriele centrifugebuizen. Bewaren bij -20 ° C. </li><li> Bereid de HCG (oplossing (f)) door het toevoegen van 10 ml gedeïoniseerd H 2 0 aan de injectieflacon met het gevriesdroogde poeder via een 25 gauge naald en spuit filter. Deze laatste oplossing kan worden bewaard bij 4 ° C gedurende 30 dagen. </li><li> Fabriceren tenminste twee microdissectie instrumenten door lijmen Minutien een pin (26.002-10, Fine Science Tools) aan het einde van een glazen Pasteur pipet met cyanoacrylaatlijm. Laat de scherpe uiteinde van de pen te verlengen voorbij het einde van de pipet ongeveer 0,5 cm. </li><li> Twee dagen voor het bereiden van culturen, te induceren fokken met de volgende procedure. Identificeer een fokkerij-ready paar Xenopus door het observeren van een prominente, roodachtige cloaca op de vrouwelijke en donkere pigment op de vlakke surface van de voorpoten van het mannetje. Een voor een, netto elke kikker en houd deze ventrale zijde naar beneden op een spoelbak met het net, zodat het niet kan ontsnappen. Injecteer 1 ml van oplossing (f) via het net en subcutaan in een van de dorsale lymfe zakken. </li><li> Leg de kweekkoppel in een overdekte tien liter tank van het water. Om ervoor te zorgen dat de dieren niet zal de nieuwe afgezet en bevrucht eieren vertrappen, installeert u een afgeschermde verdieping met een maaswijdte van ongeveer ½ &quot;uitgerust ongeveer 1-2 cm boven de bodem van de tank (Figuur 1A). </li><li> Laat kikkers ongestoord 12 tot 48 uur tot de dieren in Amplexus en bevruchte eicellen worden waargenomen op de vloer onder het scherm (Figuur 1B). </li><li> Verwijder de dieren uit de tank, maar laat de eieren ongestoord gedurende ten minste 24 uur langer. Dit paar kikkers opnieuw kunnen worden gekweekt na zes weken. </li><li> Maak de embryo&#39;s van de bodem van de tank en breng ze over naar vier of vijf 60x15 mm cultusure platen met 10% zoutoplossing (oplossing B). Sorteer de embryo&#39;s door fase volgens het schema van Niewkoop en Faber (ref. 20). Nuttige embryo&#39;s zijn die in stap 22-24. Figuur 2A toont een embryo in fase ongeveer 22 terwijl Figuur 2B toont een embryo dat te ver gevorderd in ontwikkeling bruikbaar (ongeveer stadium 28). Het is belangrijk om te kiezen embryo&#39;s die gezond zijn: die zijn glad in het uiterlijk met licht bruin en wit gespikkeld zijn ideaal. Embryo&#39;s die grote zwarte of witte vlekken hebben, zijn over het algemeen ongezond en onbruikbaar. </li></ol> 2. Microdissectie van Xenopus embryo <ol><li> Binnen een laminaire stroming kap, label en vul ongeveer halverwege drie 60x15 mm steriele cultuur gerechten met 10% zoutoplossing, en een met CMF. </li><li> Een steriel glazen Pasteur pipet overdracht vijf tot tien stage 22-24 embryo&#39;s in een van de platen met 10% zoutoplossing. Met behulp van een stereo zoom ontledening microscoop in de kap (0,6-5x met 10 x oculairs), verwijder de gelei vacht en vitelline membraan van elk embryo gebruik van twee paar steriele # 5 pincet (11251-30, Fine Science Tools). (Zie Figuren 3A en 3B). </li><li> Was de naakte embryo door ze, een voor een, door de resterende twee schalen van 10% zoutoplossing en uiteindelijk in het schaaltje met CMF. Gebruik een nieuwe, steriele pipet voor elke overdracht en het minimaliseren van het volume van de oplossing overgebracht van gerecht naar gerecht. </li><li> Beurt elk embryo voorzichtig maar stevig vast met een pincet en met de microdissectie gereedschap gevormd in stap 1.5, verwijder de neurale buis en bijbehorende myotomes die zich aan de dorsale zijde van het dier. Doen door drie plakken, aan elke kant van de locatie van de neurale buis en een derde alleen ventraal (figuur 4A). Zet alle ontleed neurale buis / myotoom een ​​schoon deel van de plaat weg van de dooier granules en ander afval (Figuur 4B). De dorsale-ventrale as en de locaties van de neurale buis en myotomes zijn in figuur 4. </li><li> Na ongeveer vijftien minuten in deze oplossing (CMF) gebruik een tang om de gepigmenteerde huid vrij van de ontleed weefsel op te heffen en gooi deze weg. Na nog eens 30-60 minuten, zullen de cellen vormen een &quot;sand pile&quot; als ze los van elkaar (Figuur 4C). </li></ol> 3. Voorbereiding van zenuw-spier Co-culturen <ol><li> Ontdooi een 10 ml buis van kweekmedium, waarna aseptisch 70 ul ITS en 35 ng / ml BDNF (Sigma B3795). </li><li> Label en vul steriele 35 mm kweekschalen (FD35-100 Wereld precisie-instrumenten) ongeveer halverwege met L-15 kweekmedium (oplossing (e)), een voor ontleed elk embryo. </li><li> Fabriceren een plating pipet grijpen elk uiteinde van een glazen Pasteur pipet terwijl het tapse gedeelte boven een vlam. Trek de uiteinden elkaar tot ongeveer 10 cm en dan afbreken het einde om een ​​fooi van ongeveer 0,2 mm te verkrijgen. </li><li> Gebruik de pipet plating te zuigen de &quot;zandhoop&quot; van een embryo minimaliseren van de hoeveelheid oplossing getrokken. Uitzetting van de cellen op de bodem van een kweekschaal. Plaat de cellen in verschillende lijnen. Let plated ongedifferentieerde cellen (figuur 5A en 5B). </li><li> Laat de gerechten van geplateerde cellen ongestoord gedurende ten minste vijftien minuten zodat de cellen de tijd te hechten aan het gerecht. </li></ol> 4. Patch Clamping zenuw-spier Synapsen <ol><li> Na 12-24 uur in cultuur geplateerde cellen nemen op verschillende morfologische kenmerken: spiercellen worden spoelvormige en spinale neuronen verbreed lange processen (Figuur 6). Functionele synaptische contact tussen neurieten varicosities en spiercellen kan worden bevestigd met gelijktijdige gekoppeld elektrofysiologische opnames. &quot;M&quot;, &quot;S&quot; en &quot;V&quot; verwijzen respectievelijk naar de spiercel, neuronalesoma en presynaptische varicosity. </li><li> Bereid twee patch-elektroden voor opname: een voor de presynaptische varicosity en een voor de spiercel. </li><li> Voor de presynaptische elektrode, een voor amfotericine bevattende oplossing als volgt: voeg 100 ul DMSO tot een 1,5 ml microcentrifuge buis die 5 mg amfotericine B (Sigma A4888). Vortex deze oplossing gedurende 10 sec. Voeg vervolgens 10 pl van deze oplossing een tweede microcentrifugebuis die met 625 pi K +-interne oplossing voor amfotericine B (oplossing (h)) bevat. Vortex zoals hierboven. </li><li> Vul de presynaptische elektrode met het amfotericine bevattende K +-interne bereid in stap 4.3 en het postsynaptische elektrode met K +-internal (oplossing (g)). </li><li> Vervang media in de cultuur schotel met NFR en het weer in een omgekeerde microscoop uitgerust met fasecontrast optiek. </li><li> Plaats beide elektroden net boven hun respectievelijke doelstellingen. Het verkrijgen van de whole-cell configuration de spiercellen elektrode voordat de geperforeerde patch configuratie met varicosity elektrode. </li><li> Om de functionaliteit van de synaps te bevestigen, depolariseren de varicosity met een patch-clamp-versterker (bijv. Axopatch 200B, Molecular Devices) onder software controle (bijvoorbeeld door pCLAMP 9, Molecular Devices) en observeer de gelijktijdige presynaptische en postsynaptische stromingen. Figuur 7 toont gezien de stromingen in reactie op depolariserende stappen van spanning aan de presynaptische varicosity in 10 mV stappen van -30 mV tot +40 mV. De actieve stromen gezien in de presynaptische cel worden gedragen door Na + en Ca2 + en de uiterlijke stromen door K +. Stromingen opgenomen in de postsynaptische cel zijn reacties op neurotransmitter vrij uit de varicosity en meestal door Na + door middel van nicotine acetylcholine receptor kanalen. </li></ol>

<ol><li>Augustine, G. J., Eckert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divalent+cations+differentially+support+transmitter+release+at+the+squid+giant+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Divalent cations differentially support transmitter release at the squid giant synapse.</a> J. Physiol. 346, 257-271 (1984).</li>
<li>Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+action+potential+mechanism+of+amphibian+neurons+isolated+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73, 1641(1976).</li>
<li>Weldon, P. R., Cohen, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+synaptic+ultrastructure+at+neuromuscular+contacts+in+an+amphibian+cell+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Development of synaptic ultrastructure at neuromuscular contacts in an amphibian cell culture system.</a> J. Neurocytol. 8, 239-259 (1979).</li>
<li>Tabti, N., Poo, M. -M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTabti%2C+N+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge, Massachusetts. 137-153 (1991).</li>
<li>Yazejian, B., DiGregorio, D. A., Vergara, J. L., Poage, R. E., Meriney, S. D., Grinnell, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurements+of+presynaptic+calcium+and+calcium-activated+potassium+currents+regulating+neurotransmitter+release+at+cultured+Xenopus+nerve-muscle+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direct measurements of presynaptic calcium and calcium-activated potassium currents regulating neurotransmitter release at cultured Xenopus nerve-muscle synapses.</a> J. Neurosci. 17, 2990(1997).</li>
<li>DiGregorio, D. A., Peskoff, A., Vergara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+action+potential-induced+presynaptic+calcium+domains+at+a+cultured+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Measurement of action potential-induced presynaptic calcium domains at a cultured neuromuscular junction.</a> J. Neurosci. 19, 7846(1999).</li>
<li>Yazejian, B., Sun, X. P., Grinnell, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+presynaptic+Ca2%2B+dynamics+during+neurotransmitter+release+with+Ca2%2B-activated+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tracking presynaptic Ca2+ dynamics during neurotransmitter release with Ca2+-activated K+ channels.</a> Nat. Neurosci. 3, 566(2000).</li>
<li>Sun, X. P., Chen, B. M., Sand, O., Kidokoro, Y., Grinnell, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depolarization-induced+Ca2%2B+entry+preferentially+evokes+release+of+large+quanta+in+the+developing+Xenopus+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Depolarization-induced Ca2+ entry preferentially evokes release of large quanta in the developing Xenopus neuromuscular junction.</a> J. Neurophysiol. 104 (5), 2730-2740 (2010).</li>
<li>Xie, S. P., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+events+in+the+formation+of+neuromuscular+synapse%3A+rapid+induction+of+acetylcholine+release+from+embryonic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Initial events in the formation of neuromuscular synapse: rapid induction of acetylcholine release from embryonic neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7069(1986).</li>
<li>Li, P. P., Chen, C., Lee, C. W., Madhavan, R., Peng, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+filopodial+asymmetry+induced+by+synaptic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Axonal filopodial asymmetry induced by synaptic target.</a> Mol. Biol Cell. 22 (14), 2480-2490 (2011).</li>
<li>Feng, Z., Ko, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+promote+synaptogenesis+at+the+neuromuscular+junction+via+transforming+growth+factor-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Schwann cells promote synaptogenesis at the neuromuscular junction via transforming growth factor-beta1.</a> J. Neurosci. 28 (39), 9599-9609 (2008).</li>
<li>Song, H. J., Ming, G. L., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cAMP-induced+switching+in+turning+direction+of+nerve+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">cAMP-induced switching in turning direction of nerve growth cones.</a> Nature. 17 (6639), 275-279 (1997).</li>
<li>Morimoto, T., Wang, X. H., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+synaptotagmin+modulates+short-term+synaptic+plasticity+at+developing+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Overexpression of synaptotagmin modulates short-term synaptic plasticity at developing neuromuscular junctions.</a> Neuroscience. 82 (4), 969-978 (1998).</li>
<li>Lu, B., Czernik, A. J., Popov, S., Wang, T., Poo, M. M., Greengard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+synapsin+I+correlates+with+maturation+of+the+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression of synapsin I correlates with maturation of the neuromuscular synapse.</a> Neuroscience. 74 (4), 1087-1097 (1996).</li>
<li>Schaeffer, E., Alder, J., Greengard, P., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapsin+IIa+accelerates+functional+development+of+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synapsin IIa accelerates functional development of neuromuscular synapses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 26 (9), 3882-3886 (1994).</li>
<li>Liou, J. C., Tsai, F. Z., Ho, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiation+of+quantal+secretion+by+insulin-like+growth+factor-1+at+developing+motoneurons+in+Xenopus+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Potentiation of quantal secretion by insulin-like growth factor-1 at developing motoneurons in Xenopus cell culture.</a> J. Physiol. 553 (Pt. 3), 719-7128 (2003).</li>
<li>Peng, H. B., Yang, J. F., Dai, Z., Lee, C. W., Hung, H. W., Feng, Z. H., Ko, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+neurotrophins+and+schwann+cell-derived+signals+on+neuronal+survival%2Fgrowth+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential effects of neurotrophins and schwann cell-derived signals on neuronal survival/growth and synaptogenesis.</a> J. Neurosci. 23 (12), 5050-5060 (2003).</li>
<li>Dan, Y., Poo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hebbian+depression+of+isolated+neuromuscular+synapses+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Hebbian depression of isolated neuromuscular synapses in vitro.</a> Science. 12 (5063), 1570-1573 (1992).</li>
<li>Xiao, Q., Xu, L., Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-dependent+regulation+of+neurotransmitter+specification+and+embryonic+neuronal+calcium+spike+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Target-dependent regulation of neurotransmitter specification and embryonic neuronal calcium spike activity.</a> J. Neurosci. 30 (16), 5792-5801 (2010).</li>
<li>Niewkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNiewkoop%2C+PD+%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin)</a>. , North-Holland, Amsterdam. (1967).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Cruciale stappen in de succesvolle co-kweken van motorneuronen en spiercellen zijn het gebruik van passende gefaseerde embryo&#39;s die uit de geïnduceerde kweken van Xenopus kikkers en de zorgvuldige aseptische dissectie van de ongedifferentieerde spinale neuronen en myoblasten. Bevruchte eieren moeten worden met rust gelaten totdat ze ongeveer stadium 10 of zo als het verplaatsen van hen vroeg vaak stopt hun ontwikkeling. Gezonde embryo&#39;s zijn te herkennen aan een glad uiterlijk en een bruine en witte gevlekte kleuren. Stage 22-24 embryo het meest nuttig omdat dit het punt tijdens ontwikkeling vlak na de neurale buis gesloten en voor de myocyten aanzienlijk zijn gedifferentieerd. Daarnaast cellen van oudere embryo&#39;s niet goed dissociëren in CMF. Voorzichtigheid is geboden bij het verwijderen van de vitelline membraan als het een sterke hechting op het embryo. Het membraan moet uit elkaar worden gescheurd met een scherpe tang, zodat het embryo ontstaat intact. Een ander belangrijk precaution is om zorgvuldig de cellen plaatsen op de bodem van de cultuur schotel (in plaats van hen te laten zich daar te vestigen). Deze methode heeft de voorkeur aangezien dit de kans dat de cellen zich aan de kweekschaal. Functionele neurotransmissie tussen zenuw en spier worden bepaald met slechts postsynaptische opname en vaak worden vastgesteld door de observatie van spontane spiercontractie na innervatie. Un-geïnnerveerde spiercellen niet trillen in cultuur. Postsynaptische opname alleen is handig voor het opnemen miniatuur eindplaat stromen of mogelijkheden, maar metingen van evoked afschakelspoel heeft presynaptische stimulatie en de correlatie van pre-en postsynaptische stromingen vereist dubbele patch-clamp. Naast de gepaarde patch opnamewerkwijze hier beschreven, dit preparaat biedt de mogelijkheid om een derde pipet voeren op de neuronale soma 5 Dit maakt het genereren van een actiepotentiaal that kan doorgeven aan de presynaptische varicosity en leiden tot het vrijkomen van neurotransmitter. Bovendien kunnen mogelijke middelen die worden verondersteld te bemiddelen of moduleren synaptische transmissie worden geïntroduceerd aan beide zijden van de synaps: via de spiercel pipet of door diffusie uit een derde pipet geplaatst op de soma.

<table border="1"><tbody><tr><td> Apparatuur / Supplies </td><td> Verkoper </td><td> Catalogus / Modelnummer </td><td></td></tr><tr><td> Insuline-transferrine-Seleen </td><td> Sigma </td><td> I1884 </td><td></td></tr><tr><td> Humaan choriongonadotrofine </td><td> Sigma </td><td> CG-10 </td><td></td></tr><tr><td> Dampdrukosmometer </td><td> Wescor </td><td> 5100C </td><td></td></tr><tr><td> Minutien Pins </td><td> Fine Science Tools </td><td> 26.002-10 </td><td></td></tr><tr><td> Amfotericine B </td><td> Sigma </td><td> A4888 </td><td></td></tr><tr><td> Tang </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.251-30 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Oplossing Naam </td><td> Recept </td></tr><tr><td> (A) NFR (normale kikker Ringer (in mM) </td><td> 116 NaCl, 2 KCl, 1,8 CaCl2, 5 Na +-HEPES, pH 7,35. </td></tr><tr><td> (B) 10% zoutoplossing </td><td> 10 ml NFR +90 ml gedeïoniseerd H 2 O </td></tr><tr><td> (C) CMF (Ca2 + / Mg2 +-vrije oplossing) </td><td> 125 NaCl, 2 KCl, 1,2 EDTA, 5 Na +-HEPES, pH 7,35. </td></tr><tr><td> (E) L-15 Cultuur Media </td><td> 50 ml L-15 media (Sigma L1518) + 50 ml NFR. </td></tr><tr><td> (G) + K-interne oplossing (in mM) </td><td> 116 KCl, 1 NaCl, 1 MgCl2, 10 EGTA, 5 HEPES, pH 7,3 </td></tr><tr><td> (H) K +-interne oplossing voor amfotericine B (in mM) </td><td> 52 K 2 SO 4, 38 KCl, 1 EGTA, 5 HEPES, pH 7,3 </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table> Table 1.

gelijktijdig pre-en post-synaptische elektrofysiologische opnemen vanaf<em&gt; xenopus</em&gt; zenuw-spier co-culturen

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Veel informatie over de koppeling van presynaptische ionenstromen met de release van neurotransmitter is verkregen van ongewervelde voorbereidingen, met name de inktvis gigantische synaps 1. Met uitzondering van het preparaat beschreven, enkele vertebrate preparaten bestaan ​​waarin het mogelijk is om gelijktijdige metingen van neurotransmitters en presynaptische ionenstromen. Xenopus embryo motoneuronen en spiercellen kunnen worden gekweekt samen eenvoudige kweekmedium bij kamertemperatuur ze functionele synapsen vormen in twaalf tot vierentwintig uur, en kan worden gebruikt voor zenuwen en spieren cel ontwikkeling en synaptische interacties bestuderen enkele dagen (tot overgroei optreedt). Enkele voordelen van deze co-culturen over andere gewervelde preparaten omvatten de eenvoud van bereiding, de mogelijkheid om de culturen en werk bij kamertemperatuur behouden en de toegankelijkheid van de gereed gevormde synapsen 2-4. De voorbereiding is op grote schaal gebruikt om de biofysische eigenschappen van presynaptische ionenkanalen en de regulering van afgifte van transmitter vijf-acht bestuderen. Bovendien heeft het preparaat gegeven tot andere toepassingen waaronder de studie van neurietuitgroei en synaptogenese 9-12, moleculaire mechanismen van neurotransmitters 13-15, de rol van diffundeerbare boodschappers in neuromodulatie 16,17 en in vitro synaptische plasticiteit 18 - 19.

Figuur 4B toont de dorsaal aanzicht van een geïsoleerd ruggenmerg / myotoom direct na het verwijderen van een stadium 22 Xenopus embryo. Figuur 4C toont dat na verwijdering en huid incubatie in Ca 2 +-Mg2 +-vrije oplossing (CMF, oplossing ( c)), cellen dissociëren in een &quot;zandhoop&quot; en zijn klaar voor plating. Onmiddellijk na plating in kweekmedium cellen vertonen weinig morfologische variabiliteit (Figuur 5B), maar nemen verschillende vormen na vierentwintig uur in cultuur. Spiercellen worden spoelvormige terwijl neuronen blijven terwijl sferische zich neurieten die uitgebreide varicosites bij synapsen met spiercellen (Figuur 6). Gelijktijdig gepaarde patch opname van de presynaptische en postsynaptische varicosity spiercel (Figuur 7) onthult de presynaptische binnen en naar buiten stromen in verband met het vrijkomen van neurotransmitter en de resultant prikkelend postsynaptische stromingen. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig1.jpg" alt="Figuur 1"/> Figuur 1 A:.. Fokken paar kikkers in het koppelen emmer bovenop het scherm B: Kikkers in Amplexus met bevruchte eieren. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig2.jpg" alt="Figuur 2"/> Figuur 2 A:.. &quot;Geschikt&quot; stage 22 embryo B: &quot;niet geschikt&quot; stadium 28 embryo. Schaal balk vertegenwoordigt 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig3.jpg" alt="Figuur 3"/> Figuur 3 A:. Fase 22 embryo vóór verwijdering van vitelline membraan en gelei vacht. De pijl wijst naar de buitenrand van de gelei vacht. De vitelline membraan hecht goed naar de embryo en is vrijwel onzichtbaar B:. Bare embryo. Schaal balk vertegenwoordigt 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig4.jpg" alt="Figuur 4"/> Figuur 4 A: Stage 22 embryo met een stippellijn aangegeven te worden ontleed deel B:.. Acuut geïsoleerd dorsale gedeelte van embryo; &quot;d&quot; en &quot;v&quot; verwijzen naar de dorsale en ventrale aspecten van de embryo&#39;s, terwijl &quot;m&quot; en &quot;n&quot; geeft de geschatte locatie van de neurale buis en mytomes C:. &quot;Sand pile&quot; cellen na 60 min in CMF. Schaalbalk is 1 mm voor A en 0,5 mm voor B en C. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig5.jpg" alt="Figuur 5"/> Figuur 5 A:. 5x vermogen gezien in kweek onmiddellijk na plateren. B: Zelfde cultuur bij 40x. Schaalbar vertegenwoordigt 40 urn voor A en 5 urn voor B. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig6.jpg" alt="Figuur 6"/> Figuur 6. Neuromusculaire junctie in cultuur identificatie van neuronale soma (S), presynaptische varicosity (V), en postsynaptische spiercellen (M). Schaalmaat: 5 pm. <img src="/files/ftp_upload/50253/50253fig7.jpg" alt="Figuur 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50253/50253fig7highres.jpg"/> Figuur 7. Presynaptische (boven) en postsynaptische (onder) stromen waargenomen in reactie op verzoek van 10 mV incrementele spanningsverschillen aan de presynaptische varicosity van -30 mV tot +40 mV. Spanningsverschillen naast enkele presynaptisch sporen aangegeven. De holding potentieel voor beide cellen was -70 mV.

Deze video toont de procedures die worden gebruikt om primaire culturen van embryonale groeien<em&gt; Xenopus</em&gt; Zenuw-en spiercellen en het nut van dit preparaat voor gelijktijdig maken van pre-en postsynaptische patch clamp opnamen.

Gelijktijdig Pre-en post-synaptische Elektrofysiologische Opnemen vanaf<em&gt; Xenopus</em&gt; Zenuw-spier Co-culturen

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

Het algemene doel van deze procedure is het verkrijgen van primaire culturen van synaptisch gekoppelde spinale neuronen en spiercellen uit xenopus-embryo's. Dit wordt bereikt door eerst voortplanting bij xenopus te induceren via injectie van humaan choriongonadotrofine bij zowel mannelijke als vrouwelijke kikkers en het verzamelen van bevruchte eieren. De tweede stap bestaat uit het verwijderen van de gelei-laag, het blastoderm en de membranen van embryo's in stadium 22.Vervolgens worden de spinale neuronen en spieren uit de embryo's geïsoleerd, waarna de huid wordt verwijderd en weggegooid. De laatste stap is het uitplaten van de geïsoleerde cellen in kweekschaaltjes om de vorming van functionele neuromusculaire overgangen mogelijk te maken. Uiteindelijk kunnen functionele synaptische verbindingen worden aangetoond met gelijktijdige gepaarde patchclamp-registraties van neuronen en spiercellen in kweek.Het mooie van deze techniek is dat het een gemakkelijk toegankelijke synaptische preparatie van vertebraten oplevert. Het kan worden gebruikt om de afgifte van neurotransmitters te monitoren met postsynaptische elektrofysiologische registraties, terwijl gelijktijdig de presynaptische ionconcentraties worden gemeten. Bovendien zijn de methoden helder en eenvoudig, waarbij geen speciale apparatuur buiten een dissectiemicroscoop nodig is, en de culturen kunnen vervolgens bij kamertemperatuur worden bewaard in een eenvoudig kweekmedium.Deze preparatie kan nuttig zijn bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de synaptische fysiologie, waaronder hoe presynaptische, biochemische en biofysische gebeurtenissen gekoppeld zijn aan de afgifte van neurotransmitters. Daarnaast is het ook nuttig voor de studie naar neuromodulatie, synaptogenese en synaptische plasticiteit. Om deze procedure te starten, bereid je de benodigde oplossingen voor volgens het bijbehorende manuscript. Maak vervolgens ten minste twee microdissectie-instrumenten door een Minuchin-punaise aan het uiteinde van een glazen pastierpipet te lijmen.Gebruik Sano acryllijm en zorg dat het scherpe uiteinde van de pin ongeveer 0,5 centimeter voorbij het uiteinde van de pipet uitsteekt. Identificeer twee dagen voor het voorbereiden van de culturen een paringsklaar paar XUS door te letten op een prominente roodachtige klauw aika bij het vrouwtje en donkere pigmentatie op het vlakke oppervlak van de voorpoten van het mannetje. Schep vervolgens elke kikker met een net op en houd deze in een gootsteen met het net, met de buikzijde naar beneden, zodat de kikker kan ontsnappen.Injecteer one milliliter HCG door het net en subcutaan in een van de dorsale lymfezakken om te voorkomen dat de dieren de vers gelegde en bevruchte eieren vertrappen. Plaats een zeefbodem met een maaswijdte van half inch, gemonteerd op one to two inches vanaf de bodem van het aquarium. Plaats vervolgens het kweekpaar samen in een afgedekt 10 gallon aquarium met water.Laat de kikkers 12 tot 48 uur ongestoord tot er bevruchte eieren op de bodem onder het scherm worden waargenomen. Verwijder vervolgens de dieren uit het aquarium, maar laat de eieren nog ten minste 24 uur ongemoeid. Dit paar kikkers kan na zes weken opnieuw worden gepaard.Maak vervolgens de embryo's los van de bodem van het reservoir en breng ze over naar vier of vijf kweekschaaltjes van 60 bij 15 millimeter die 10% zoutoplossing bevatten. Sorteer de embryo's per stadium volgens het schema van Nieuwkoop en Faber. Embryo's die er glad uitzien met lichte, bruine en witte tekeningen, zoals die links, zijn ideaal. Daarentegen zijn embryo's met grote zwarte of witte vlekken, zoals die rechts, over het algemeen ongezond en onbruikbaar.Label en vul in een laminaire flowkast ongeveer tot de helft 360 bij 15 millimeter steriele cultuurschalen met 10% zoutoplossing en één schaal met CMF. Breng met een steriele glazen Pasteurpipet vijf tot 10 embryo's in stadium 22 tot 24 over naar een van de schalen met 10% zoutoplossing. Verwijder onder een stereozoom-dissectiemicroscoop in de kast de gelei-omhulling en het vliezmembraan van elk embryo met twee paren steriele pincetten. Was de naakte embryo's door ze één voor één door de overige twee schalen met 10% zoutoplossing te halen, en breng ze tot slot over naar de schaal met CMF.Houd vervolgens elk embryo voorzichtig maar stevig vast met een pincet en gebruik het microdissectie-instrument om de neurale buis en de bijbehorende myotomen te verwijderen, die zich aan de meest dorsale zijde van het dier bevinden. Doe dit door drie sneden te maken: één aan beide uiteinden van de locatie van de neurale buis en een derde net ventraal daarvan. Verplaats vervolgens elk gedissecteerde neurale buis-myotoom naar een schoon deel van de schaal, weg van de dooiergranules en ander debris.Na ongeveer 15 minuten in CMF gebruikt u de pincet om de gepigmenteerde huid van het gedisseceerde weefsel te scheiden en gooit u de huid weg. Na nog eens 30 tot 60 minuten zullen de cellen een zandhoop vormen naarmate ze van elkaar lossociëren. Ontdooi voor deze procedure een buis van 10 milliliter kweekmedium, voeg vervolgens 70 microliters ITS toe in 35 nanogram per milliliter, BDNF-label en vul de 35 millimeter steriele kweekschalen voor ongeveer de helft met L 15 kweekmedium.Gebruik één kweekschaal voor elk embryo dat u heeft gedissecteerd. Om een platingpipet te maken, houdt u beide uiteinden van een glazen pastierpipet vast en plaatst u het taps toelopende gedeelte boven een vlam. Trek vervolgens de uiteinden ongeveer 10 centimeter uit elkaar.Breek vervolgens het uiteinde af om een punt van ongeveer 0,2 millimeter te verkrijgen. Gebruik daarna de uitplaatpipet om de zandstapel van één embryo op te zuigen. Let erop dat de hoeveelheid opgezogen oplossing tot een minimum wordt beperkt.Breng vervolgens de cellen aan op de bodem van een kweekschaal en verdeel ze in verschillende lijnen. Laat de schalen met de geplaatste cellen daarna minstens 15 minuten ongestoord staan, zodat de cellen de tijd hebben om aan de schaal te hechten. Na 12 tot 24 uur in kweek zullen de geplaatste cellen duidelijke morfologische kenmerken ontwikkelen.Spiercellen worden bijvoorbeeld spoelvormig en spinale neuronen ontwikkelen lange uitlopers. Functioneel synaptisch contact tussen varicositeiten en spiercellen kan worden bevestigd met gelijktijdige gepaarde elektrofysiologische registraties. Bereid hiervoor twee patch-elektroden voor de registratie voor: één voor de presynaptische varicositeit en één voor de spiercel.Vul vervolgens de presynaptische elektrode met een oplossing die info terin bevat en de postsynaptische elektrode met een interne kaliumoplossing. Vervang daarna het medium in de kweekschaal door NFR. Breng het vervolgens over naar een omgekeerde microscoop die is uitgerust met fasecontrastoptiek, patch de presynaptische varicositeit met de elektrode die amphotericine bevat en de postsynaptische spiercel met de andere elektrode om de functionaliteit van de synaps te bevestigen, depolariseer de varicositeit met een patchclamp-versterker en observeer de gelijktijdige presynaptische en postsynaptische stromen.Deze figuur toont een vergroting van 5 x van cellen en culturen direct na het uitplaten, en dit is dezelfde cultuur bij 40 x. Hier is de neuromusculaire overgang in cultuur, die het neuronale soma, de presynaptische varicositeit en de postsynaptische spiercel laat zien. Hier worden de presynaptische en postsynaptische stromen weergegeven.Als reactie op de toepassing van incrementele voltage-stappen van 10 millivolt, gepresenteerd aan de presynaptische varicositeit van minus 30 millivolt tot plus 40 millivolt, was het rustpotentiaal voor beide cellen minus 70 millivolt. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in ongeveer twee uur worden voltooid. Levensvatige celculturen kunnen vervolgens al na 24 uur worden verkregen en gedurende meerdere dagen worden onderhouden. Deze preparatie wordt al enkele jaren gebruikt en heeft geholpen bij het verklaren van enkele fundamentele eigenschappen van de neuromusculaire transmissie.We hopen dat deze video bijdraagt aan verdere ontdekkingen door onderzoekers te helpen meer bekend te raken met deze krachtige en eenvoudige techniek.

simultaneous-pre-post-synaptic-electrophysiological-recording-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier beschrijven we elektrofysiologische methoden voor het meten van synaptische transmissie bij de neuromusculaire junctie van Drosophila larve. Evoked release wordt kunstmatig geïnitieerd door het stimuleren van de motorische neuron axonen, en de transmissie door middel van de NMJ kan worden gemeten door de postsynaptische respons opgeroepen in de spier.

Elektrofysiologische methoden voor opname Synaptic Potentials van de NMJ van Drosophila Larven

Toepassing van elektrofysiologie toegankelijke synapsen biedt een kwantificeerbare maat van synaptische activiteit, nuttig bij het analyseren van synaptische mutanten. Dit artikel beschrijft een dissectie methode die wordt gebruikt om de neuromusculaire verbindingen (NMJ) van...

Ontleden en opnemen van The C. Elegans neuromusculaire junctie

Elektrofysiologische opname in de Drosophila Embryo

De opener spier van de rivierkreeft been wordt gepresenteerd voor het historisch belang en experimentele veelzijdigheid in de spieren fenotype, synaptische fysiologie en plasticiteit.

Bekijk de historische en fysiologie demonstratie op het NMJ van de rivierkreeft Opener Muscle

Dit artikel legt uit hoe u elektrofysiologische opnames van synaptische reacties gedrag op de extensoren spier in de wandel-poot van een kreeft en hoe de zenuwuiteinden zijn gevisualiseerd op de bruto-morfologische verschillen tussen hoog-en laag-output zenuwuiteinden te tonen.

Fysiologische Opnamen van hoge en lage Output NMJs op de Crayfish Leg Extensor Muscle

Deze nieuwe methode maakt het gelijktijdig intracellulaire opname van een volwassen muis motoneuron en de meting van de kracht die door de spiervezels. De gecombineerde onderzoek van de elektrische en mechanische eigenschappen van motoreenheden in normale en genetisch gemodificeerde dieren is een doorbraak voor de studie van het neuromusculaire systeem.

Gelijktijdig Intracellulaire opnemen van een lumbale motoneuron en de kracht die door de motor in de volwassen muis<em&gt; In vivo</em

This video presents electrophysiological recordings from organotypic co-cultures of spinal cord slices, captured using a multi-electrode array or MEA device. These recordings assess neuronal regeneration between the slices. The synchronized electrical activity observed confirms successful neural regeneration.

Electrophysiological Recordings For Assessing Neuronal Regenerations in Co-cultured Spinal Cord Slices

This video demonstrates the procedure of using the multielectrode array (MEA) to measure synaptic physiology in 3D coculture spheres. This method allows to understand the neural network dynamics and synaptic network burst activity within the 3D spheres.

Utilizing Multielectrode Arrays to Measure Synaptic Physiology in 3D Coculture Spheres

In dieren met grote geïdentificeerde neuronen...

Extracellulair Het identificeren van Motor Neuronen voor een Muscle Motor Pool in<em&gt; Aplysia californica</em

Synaptic stromingen kunnen focally worden opgenomen van de gevisualiseerde synaptic los op de Drosophila derde instar larven motorische eindplaat. Deze techniek maakt het mogelijk de activiteiten van een enkele synaptic bouton worden gecontroleerd.

Focal Macropatch opnames van Synaptic stromingen uit de larvale Drosophila motorische eindplaat

In dit artikel bespreken we drie hersenen preparaten die worden gebruikt voor het opnemen van de klem van het flard van hele cel om te studeren het retinotectal circuit van Xenopus laevis kikkervisjes. Elk preparaat, met zijn eigen specifieke voordelen, draagt bij aan de experimentele werkwillig van de Xenopus tadpole als een model om te studeren van neurale functie.

Preparaten en protocollen voor de hele cel Patch klem opname van Xenopus laevis Tectal neuronen

Leer hoe u gelijktijdige pre- en postsynaptische patch clamp-opnamen maakt van zenuw-spier co-culturen van Xenopus embryo's. Deze methode maakt het bestuderen van synaptische fysiologie en neurotransmittervrijgating mogelijk.

Gelijktijdig Pre-en post-synaptische Elektrofysiologische Opnemen vanaf

Meer video's verkennen