Het ontwerpen van een Bio-responsieve Robot van DNA Origami

Het algemene doel van deze procedure is het ontwerpen van een robotisch apparaat van DNA-origami met behulp van de CAD nano-software. Dit wordt bereikt door eerst CAD nano te installeren en deze te gebruiken om de algemene vorm van de robot te schetsen. De tweede stap is het ontwerpen van het pad van de scaffold-streng.

Vervolgens worden de staples ingevoegd en bewerkt. De laatste stap is het instellen van controlekenmerken, waaronder de payload, aanhechtingsplaatsen en gates. Ten slotte wordt een lijst met DNA-onderdelen gegenereerd voor bestelling voorafgaand aan de assemblage.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het het ontwerp van DNA-origami-objecten voor diverse toepassingen vereenvoudigt en standaardiseert. De procedure zal worden gedemonstreerd door Alad Bei, een postdoc die in mijn laboratorium werkt aan de dynamiek van DNA-origami-robots. Om met deze procedure te beginnen, downloadt en installeert u CAD nano two en Autodesk Maya 2012.

Volgens de instructies op http slash slash cad nano. org bevat de ontwerpinterface van CAD nano binnen Maya drie panelen. Het bovenste paneel is de roosterweergave waarin de vorm aanvankelijk wordt geschetst.

Dit paneel maakt acties op het niveau van de dubbele helix mogelijk en biedt een doorsnedevue van de vorm. Het onderste paneel is het bewerkingspaneel, waarmee acties op het niveau van een enkele base kunnen worden uitgevoerd. Het rechterpaneel is een door Maya gegenereerd real-time 3D-model van de vorm.

Klik op het honingraat-icoon om in en uit te zoomen op het rooster. In het bovenste paneel kan dit met de muis gebeuren. Scroll respectievelijk omhoog en omlaag.

Begin met het tekenen van het gedeelte in de gewenste vorm op het linkerpaneel. Elke cirkel stelt een dubbele DN voor; om de helices te kiezen die de vorm opbouwen, klikt u eenvoudig met de linkermuisknop op hun centrum. Ga helix voor helix verder totdat de gehele vorm is omlijnd.

Alternatief kan de vorm worden getekend door de linkermuisknop ingedrukt te houden en de omtrek van de vorm continu te tekenen. Bekijk het onderste paneel. Elke helix wordt weergegeven door twee rijen vierkantjes.

De rijen zijn de twee strengen van de dubbele helix. Elke vierkant representeert een base, waarbij de oranje verticale balk bepaalt waar de bewerkingsacties langs een helix plaatsvinden. De basepositie langs het raster wordt weergegeven als een getal boven de oranje balk.

De standaardlengte van het helix-raamwerk is 42 basen. De lengte kan worden verlengd door op een van de grijze pijlpictogrammen in de rechterbovenhoek van het bewerkingspaneel te klikken en de gewenste verlenging te kiezen. Om het werkelijke pad van de scaffold-streng door de vorm te plotten, drukt u op de muisknop.

Begin bij de eerste helix en ga continu over alle helices heen in dezelfde volgorde waarin ze aanvankelijk zijn geselecteerd. Teken een rechthoek rond alle meest linkse randen van het scaffold-pad. Verleng het scaffold-pad door de geselecteerde randen als groep naar de linkerkant van het raster te slepen.

Nadat dit proces is herhaald tot het pad correct is verlengd en de brugpictogrammen zijn geïdentificeerd zoals beschreven in de tekst, bereidt u zich voor om crossovers te maken. Klik met de linkermuisknop op het gewenste brugpictogram. Er wordt een scaffold-crossover gegenereerd, wat betekent dat het scaffold op dit punt van helix naar helix oversteekt.

Herhaal dit proces totdat het steunraamwerk alle helices doorkruist en een gesloten lus vormt die de gehele vorm beslaat, zodat er geen gebieden overblijven die geïsoleerd zijn van de rest van deze vorm. De beschreven robot opent als reactie op een gedefinieerde biologische input om zijn payload bloot te leggen. Het openen vindt plaats op een schelpachtige manier, waarbij twee helften rond twee assen draaien.

De assen worden gevormd door crossovers tussen helix 29 en 30 en helix 61 en nul, wat de enige crossovers tussen die helften zijn en die zich uitsluitend in of nabij de linkerzijde van het rooster bevinden. De rechterzijde zal de gait-strengen bevatten. Verwijder de bestaande crossover tussen helix 29 en 30.

Om de crossover te wissen, klikt u op het knikpunt in een van de strengen. Hierdoor blijft de inkeping (nick) in beide strengen achter op de plaats waar de crossover zich bevond. Om de inkepingen te dichten, houdt u shift ingedrukt en klikt u op elke inkeping, en creëert u een nieuwe crossover tussen helix 29 en 30 zo dicht mogelijk bij de linkerzijde van het raster.

Maak vervolgens een nieuwe crossover tussen helix 61 en nul, zo dicht mogelijk bij de linkerrand van het raster, en definieer vier laadplaatsen die naar de binnenzijde van de robot zijn gericht. De laadplaatsen zullen vertakken vanuit helix 3 27, 34 en 58. Klik voor elke plaats in het bovenste paneel op de helix direct naast deze helices die naar de binnenzijde is gericht.

Hiermee worden de helices aan het raster in het onderste paneel toegevoegd. Klik nog niet voor een tweede keer op deze lijnen om staples toe te voegen en te bewerken. Klik eerst op auto staple.

De software voegt automatisch staple-sequenties in verschillende kleuren toe. Let op dat er staples zijn toegevoegd aan de 3D-vorm in het rechterpaneel. De kleuren van de staples zijn consistent voor het onderste en het rechterpaneel.

Daarnaast bevindt zich in de linkerbenedenhoek van de interface een indicator die aangeeft of nieten te lang, te kort of circulair zijn om automatisch te kunnen worden bewerkt. Om aan deze criteria te voldoen, klikt u op 'auto break'; er opent een dialoogvenster waarin wordt gevraagd om door de gebruiker gedefinieerde parameters voor deze actie. Gebruik de standaardparameters en klik op oké. De software zal de nieten naar beste vermogen onderbreken op basis van deze parameters.

Verwijder alle staple-oversteken tussen helix 29 en 30 en tussen 61 en nul om deze helices te laten scheiden en de robot te laten openen. Het verwijderen van staple-oversteken vereist enige handmatige bewerking om staples te corrigeren die als gevolg van deze actie te kort of onlogisch worden. Om dit correct te doen, volgt u de instructies in het tekstprotocol: verwijder de twee staples op Helix 29 door shift ingedrukt te houden en op de inkeping tussen hen te klikken.

Hetzelfde geldt voor de drie staples op Strand 30 tot aan een enkele staple; staples kunnen handmatig worden verlengd of verkort door op een rand te klikken en deze naar wens te verslepen. Zorg ervoor dat geen enkele staple wordt gecirculariseerd. Herhaal dit proces voor HELOCs zero en 61 en bewerk handmatig alle staples in elke helix.

Zoek de nietjes die door een dikke lijn zijn aangegeven; dit betekent dat ze verder bewerkt moeten worden. Controleer elk nietje en corrigeer indien nodig. Bijvoorbeeld: nietjes die te kort zijn, kunnen worden gewist of, indien mogelijk, worden verlengd.

Klik vervolgens op de loading site-helices in het bovenste paneel en verleng de resulterende scaffold-strengfragmenten in het onderste paneel door op een rand te klikken en deze naar wens te verslepen. Voeg handmatig staples toe aan deze scaffold-fragmenten door de oranje verticale balk op de gewenste positie langs de scaffold te plaatsen, terwijl u shift ingedrukt houdt en klikt over de gidshelices in het linkerpaneel. Hierdoor wordt er bij elke helix een staple-precursor toegevoegd.

Verleng ook de staple-precursoren tot de volledige lengte. Lokaliseer door te klikken en te slepen de rode brugpictogrammen die crossover-punten tussen het gidsstreng en het chassis aangeven. Kies de meest geschikte locatie om een crossover te introduceren en klik op het brugpictogram. Een geschikte locatie vereist minimale bewerkingen van bestaande staples in het chassis.

Verwijder in de gidshelix het staple-gedeelte dat geen onderdeel is van de ladingsite en verkort het deelnemende gedeelte tot de gewenste lengte. De gewenste lengte moet zowel specificiteit voor het laden van verschillende soorten lading als bindingssterkte bieden. Gewoonlijk is een staart van 18 mer voldoende.

Zorg ervoor dat de niet blijft getrokken door een dunne lijn. Bewerk anders totdat deze zich in het chassis bevindt. Bewerk de gewijzigde nieten indien nodig.

Verwijder de guide, zodat alleen de staple-extensie overblijft. Herhaal deze stappen voor alle ladingsites om de gait-strands te ontwerpen. Lokaliseer eerst de juiste posities voor de gait-strands.

Dit zullen staples zijn op helices 29, 30, 61 en nul. Bekijk bijvoorbeeld de gate-regio van 29 naar 30. Er zijn handige staple-strengen, die helices 29 en 30 flanken aan de rechterkant van het rooster, die als gate-strengen kunnen worden gebruikt.

Let erop dat ze in tegenovergestelde richtingen wijzen. Klik op de rand van een van de potentiële gait-strengen om deze buiten de vorm uit te breken. Als de rand over een scaffold-oversteek ligt, kan de selectie worden vereenvoudigd door ervoor te zorgen dat alleen staples selecteerbaar zijn.

Klik op scaf in de selecteerbare werkbalk rechtsboven in de interface om beide staples uit te breiden zodat de gate-strengen worden gevormd. Bewerk de staples. Indien deze uitbreiding dat vereist, herhaal deze stap dan voor de gate-strengen van helix nul en 61.

Om de scaffoldsequentie te kiezen, klikt u op het zoekinstrument. Plaats de cursor ergens op de scaffoldstreng en klik; er opent een dialoogvenster waarin wordt gevraagd de bron van het scaffold-DNA te kiezen. Klik in het dialoogvenster op M 13 MP 18. Let op dat de gekozen DNA-sequentie is toegevoegd aan de scaffold- en staplestrengen in het onderste paneel.

Exporteer tot slot de staple-sequentie als een spreadsheet door op 'export' in de bovenste werkbalk te klikken en een bestemmingsbestandsnaam voor de staple-lijst te kiezen. Klik op opslaan. Deze video heeft een stapsgewijs proces gedemonstreerd voor het ontwerp van een DNA-origami nanorobot.

De dwarsdoorsnede van de vorm werd hier eerst omtrect. Deze omtrek werd gevolgd door het automatisch bewerken van steunstructuurfragmenten en het voltooien van het volledige pad van de steunstructuur. Hier wordt een algemeen overzicht van de onderste en rechterpanelen getoond, waarin te zien is hoe het 3D-model in realtime verandert naar aanleiding van de bewerkingsacties.

Staple-strengen werden automatisch toegevoegd, zoals te zien is in de blauwdruk na de 'auto staple'-actie. In deze afbeelding zijn de kleuren van de staples in het onderste paneel en het rechterpaneel consistent. De staple-strengen werden vervolgens gebroken volgens door de gebruiker gedefinieerde parameters, zoals hier in de blauwdruk wordt getoond na de 'auto brake'-actie.

Vervolgens werden de staple-strengen handmatig bewerkt om de staples aan te passen aan de gewenste functie van het apparaat. De volledige opening tussen Helix 29 en 30 laat zien dat er in dit ontwerp geen crossovers de twee met elkaar verbinden. Na de handmatige bewerking is in het onderste paneel een weergave te zien van de staples van de laadsite.

Na het verwijderen van de gids-HELOC's, die niet langer nodig zijn, laat deze afbeelding de verlenging zien van twee staples, die zullen dienen als GA-strengen vanuit HELOC's 29 en 30. Let op dat de twee strengen in tegenovergestelde richtingen wijzen, wat essentieel is voor de vorming van de gait-duplex. Dit is de TEM-afbeelding van het uiteindelijke model dat in deze procedure is ontworpen.

Het monster wordt gekleurd met uranylformaat en afgebeeld in een GL-transmissie-elektronenmicroscoop, precies zoals beschreven in eerdere rapporten van de auteurs. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een robot van DNA-origami ontwerpt voor elke toepassing naar keuze.