Name: Ex utero elektroporatie en Whole halfrond Explantaten: Een eenvoudige experimentele methode voor bestudering van vroege corticale ontwikkeling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Leer ex utero elektroporatie en whole hemisphere explantaten voor vroege corticale ontwikkeling met embryonale muizen. Deze methode maakt farmacologische studies en genfunctie-analyses mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund subsidies van NINDS (NS066071) en de NIAAA. (P50AA017823) naar ECO. De auteurs danken dr. Robert Quinn en het personeel van de afdeling Proefdierkunde Middelen voor verzorging van dieren. Wij danken Judson Belmont voor technische ondersteuning, Nicole Belletier voor bijstand als een zomer Undergraduate Research Fellow (SURF). We danken ook dr. David Cameron voor commentaar en bewerkingen op een eerdere versie van het manuscript.

1. Ex utero elektroporaties met Green Fluorescent Protein expressieplasmide <ol><li> Plasmide DNA injectieoplossingen worden bereid met CAG-eGFP DNA 27 verdund tot de uiteindelijke werkende concentratie van 0,33 mg / ml in ddH 2 O. Endo-Free Qiagen Maxi-Preps worden gebruikt om het plasmide te zuiveren van getransformeerde bacteriën. Fast green kleurstof bij ~ 0,02% (w / v final) toegevoegd aan de DNA oplossing als injectie tracer. </li><li> Om het operatiegebied te bereiden, Spuit werktafel, en dissectiemicroscoop podium met een 70% ethanol-oplossing en wrijf ze droog. Spuit chirurgische schaar en pincet met 70% ethanol voor dissectie en droog vegen. </li><li> Timed Zwangere Zwitsers / Webster dammen worden geofferd op E13 door te brengen in een kamer gevuld met CO 2 uit een onder druk cilinder en de dam wordt gecontroleerd totdat alle delen volledig stilstaan ​​gedurende minstens 1 minuut. Na opoffering door CO2 inhalatie de embryo&#39;s uit de uterus en ineen 10 cm Petrischaal met ijskoude Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS). </li><li> Voorzichtig ontleden elk embryo uit de omliggende extra-embryonale membranen en te houden in ijskoud HBSS. </li><li> Breng elke individueel embryo een tweede 10 cm petrischaal met koude HBSS. Gebruik een Hamilton spuit tot 2-3 pi van het DNA fast green mengsel te injecteren in het ventrikel van de linker hersenhelft, zorg te injecteren in een corticaal gebied ruimtelijk gescheiden van de corticale gebied voor toekomstige analyse. </li><li> Om electroporate, Houd het embryo met een tang en licht de positieve peddel van de pincet elektrode op de dorsale middellijn van het hoofd en licht plaats de negatieve peddel onder de embryo kin. Elektroporaties worden bereikt met een BTX830 electroporator geprogrammeerd vijf 30 V pulsen van 50 msec duur gescheiden door 950 msec intervallen leveren. Deze instellingen zijn voor de BTX830 model. Andere systemen kunnen worden gebruikt volgens de fabrikant INSTRUCTIEns. </li></ol> 2. Hele halfrond Explantatie Voorbereiding <ol><li> Na elektroporatie worden de embryo&#39;s teruggeplaatst in ijskoude HBSS. De hersenen worden verwijderd met twee nummer 5 jeweler forceps op de huid en kraakbeenachtige schedel uit de embryo hoofd. Een pincet wordt dan geschoven onder de hersenen om de intacte hersenen uit de schedel. De geëlektroporeerde halfrond (links) wordt vervolgens weggesneden uit de hersenen en de bijgevoegde tussentijdse hersenweefsel verwijderd. Gedurende de dissectie procedure zorg is genomen om geen schade aan de hersenvliezen bovenop de linker corticale halfrond. </li><li> Eenmaal ontleed elk embryo wordt overgedragen in HBSS met behulp van een pipet met een cut 1 ml pipet tip. Het halfrond is zacht verdreven op een collageen gecoate cultuur insert. Tot zes halfrond explantaten zijn gerangschikt mediale zijde naar beneden op elke 24 mm insert. Eenmaal aangebracht, overmaat HBSS wordt uit het inzetstuk en het inzetstuk wordt vervolgens geplaatst in een 35 mm putje van een 6 putjes schaal. De goed bevat EXActly 2,7 ​​ml media: DMEM-F12 medium dat Glutamax en aangevuld met 2% B-27, 1% G5 en 1% penicilline-Strep. Een paar druppels van de media uit de put kan worden gepipetteerd op elkaar explant, maar niet media voeg dan de oorspronkelijke 2,7 ml per putje. </li><li> Nadat de explantaten zijn geplaatst op de Collagen filters 6 well schaaltje met de explantaten wordt in een Billups Rothenberg (BR) kamer (die ook een bevochtigingsinrichting schotel water bevat). A 95% / 5% zuurstof / CO 2 gasmengsel wordt ingebracht in de kamer gedurende ten minste 1 min voor het afdichten van de kamer dicht en loskoppelen van de 95% / 5% zuurstof / CO 2 gastoevoerbuis. De BR kamer wordt vervolgens geplaatst in een 37 ° C incubator weefselkweek voor de rest van de kweekperiode, 1-2 DIV. </li></ol> 3. Fixatie van Explantatie weefsel voor histologie <ol><li> In een zuurkast bereiden Pagano fixatie-oplossing door eerst solubiliserende 8 g paraformaldehyde in 100 ml voorverwarmde (~ 80 &amp; deg; C) ddH 2 O. Voeg 1-3 druppels geconcentreerd NaOH te solubilisatie bevorderen en voorzichtig roeren. Zodra opgelost mengen 8% paraformaldehyde oplossing 1:1 met een oplossing die 500 mM sucrose, 100 mM Hepes, pH 7,4, 50 mM MgCl2, 5 mM KCl een eindconcentratie van 4% paraformaldehyde in 250 mM sucrose 50 mM Hepes , 25 mM MgCl2, 2,5 mM KCl, pH 7,4. </li><li> Om vast te stellen de explantaten de Pagano fix oplossing opwarmen tot 37 ° C. Snel het grootste deel van de DMEM/F12 media goed te verwijderen uit elke cultuur en voeg 5 ml van Pagano Fix aan elk putje van explantaten. Zorg ervoor dat u elke explantatie volledig te bedekken in fix. Oplossing voor 1 uur bij RT. Verwijder geen explantaten van filter voor 1 uur van fixatie. </li><li> Na fixatie verwijderen Pagano fix oplossing en vervangen door Pagano oplossing zonder fix (250 mM sucrose 50 mM Hepes, 25 mM MgCl2, 2,5 mM KCl, pH 7,4). Enkele druppels van 10% natriumazide en bewaar bij 4 ° C tot inbedding. </li></ol> 4. Inbedding en Sectioning voor histologie <ol><li> Bereid een 10% gelatine oplossing kalfshuid door het oplossen van 10 g van kalfshuid gelatine in 100 ml warm water (55-60 ° C). Plaats gelatine-oplossing op een hete plaat is ingesteld op 60 ° C en schud regelmatig tot oplossing gebracht. </li><li> Giet ongeveer 10 ml van de 10% gelatine-oplossing in de bodem van een 10 cm Petrischaal en laat 30 minuten stollen. Dit zal een &quot;pad&quot; voor het inbedden van de explantaten. Deze pads kunnen bereid dagen op voorhand en bewaard bij 4 ° C. Gebruik een liniaal om een ​​raster te tekenen op de bodem van de petrischaal en breng individuele explantaten in elk vakje van het rooster. Resten van Pagano oplossing en het gebruik van een pipet, bedek elk explantatie met warme 10% gelatine-oplossing en laat stollen. Resume langzame toevoeging van gelatine-oplossing totdat elke explantatie is volledig omringd door gelatine, zorg ervoor dat u de pad smelten door de toevoeging van te veel warm gelatine in een keer. Laat de gelatine te verharden voor ~ 1 uur. Eenmaal uitgehard de individuele explantaten kan worden gesneden in kleine blokjes gelatine. De blokken worden vervolgens nagefixeerd in Pagano vast gedurende 24-48 uur voorafgaand aan segmenteermiddelen een vibratome. </li><li> Explantaten in gelatine blokken worden geplaatst reukkwab en doorgesneden in het frontale vlak van 100 pm dikte. De secties worden verzameld en opgeslagen in PBS + 0,1% natriumazide bij 4 ° C tot immunohistochemische verwerking. </li><li> Immunohistochemische detectie wordt uitgevoerd door overdracht van secties in een plaat met 24 putjes (2-3 delen per well). Eerste blok niet-specifieke antilichaambinding door toevoeging van 0,5 ml PBST + B (PBS + 0,5% Triton X 100 en 2% BSA) aan elk putje, incubate 1 uur onder zachtjes schudden. De geschikte primaire antilichaam wordt vervolgens verdund in PBST + B en 0,4 ml per putje toegevoegd voor incubatie gedurende de nacht bij kamertemperatuur. De primaire uitgewassen met PBS wast 3X ten minste 10 minuten elk. Het secundaire antilichaam en 2 ug / ml Hoechst 33342 nucleaire vlek worden verdund in PBST + B en de monsters worden gedurende 2 uur bij KTonder voorzichtig schudden. Drie PBS wassingen (10 min elk) uitgevoerd en de secties zijn gemonteerd op objectglaasjes met een 90% glycerol 50 mM Tris, pH 7,4, fixeermiddelen. </li></ol>

<ol><li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+neural+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Principles of neural cell migration.</a> Experientia. 46, 882-891 (1990).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipolar+migration%3A+the+third+mode+of+radial+neuronal+migration+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex.</a> J. Neurosci. 23, 9996-10001 (2003).</li>
<li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nat. Neurosci. , (2004).</li>
<li>Olson, E. C., Kim, S., Walsh, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+neuronal+positioning+and+dendritogenesis+in+the+neocortex+after+cell-autonomous+Dab1+suppression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Impaired neuronal positioning and dendritogenesis in the neocortex after cell-autonomous Dab1 suppression.</a> J. Neurosci. 26, 1767-1775 (2006).</li>
<li>Takahashi, T., Goto, T., Miyama, S., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+neuron+origin+and+neocortical+laminar+fate%3A+relation+to+cell+cycle+of+origin+in+the+developing+murine+cerebral+wall%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sequence of neuron origin and neocortical laminar fate: relation to cell cycle of origin in the developing murine cerebral wall.</a> J. Neurosci. 19, 10357-10371 (1999).</li>
<li>Marin-Padilla, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+prenatal+ontogenesis+of+the+cerebral+cortex+%28neocortex%29+of+the+cat+%28Felis+domestica%29.+A+Golgi+study.+I.+The+primordial+neocortical+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Anat.+Entwicklungsgesch%22%5BJournal%5D)">Early prenatal ontogenesis of the cerebral cortex (neocortex) of the cat (Felis domestica). A Golgi study. I. The primordial neocortical organization.</a> Z. Anat. Entwicklungsgesch. 134, 117-145 (1971).</li>
<li>Nichols, A. J., Olson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reelin+promotes+neuronal+orientation+and+dendritogenesis+during+preplate+splitting%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Reelin promotes neuronal orientation and dendritogenesis during preplate splitting.</a> Cerebral Cortex. 20, 2213-2223 (2010).</li>
<li>Sheppard, A. M., Pearlman, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+reorganization+of+preplate+neurons+and+their+associated+extracellular+matrix%3A+an+early+manifestation+of+altered+neocortical+development+in+the+reeler+mutant+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Abnormal reorganization of preplate neurons and their associated extracellular matrix: an early manifestation of altered neocortical development in the reeler mutant mouse.</a> J. Comp. Neurol. 378, 173-179 (1997).</li>
<li>Manzini, M. C., Walsh, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+disorders+of+cortical+development+tell+us+about+the+cortex%3A+one+plus+one+does+not+always+make+two%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">What disorders of cortical development tell us about the cortex: one plus one does not always make two.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 21, 333-339 (2011).</li>
<li>Jones, L., Fischer, I., Levitt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonuniform+alteration+of+dendritic+development+in+the+cerebral+cortex+following+prenatal+cocaine+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb.+Cortex%22%5BJournal%5D)">Nonuniform alteration of dendritic development in the cerebral cortex following prenatal cocaine exposure.</a> Cereb. Cortex. 6, 431-445 (1996).</li>
<li>Olney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+alcohol+syndrome+at+the+cellular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Addict.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fetal alcohol syndrome at the cellular level.</a> Addict. Biol. 9, 137-149 (2004).</li>
<li>Levitt, P., Reinoso, B., Jones, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+critical+impact+of+early+cellular+environment+on+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Prev.+Med%22%5BJournal%5D)">The critical impact of early cellular environment on neuronal development.</a> Prev. Med. 27, 180-183 (1998).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>O'Rourke, N. A., Dailey, M. E., Smith, S. J., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+migratory+pathways+in+the+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diverse migratory pathways in the developing cerebral cortex.</a> Science. 258, 299-302 (1992).</li>
<li>Elias, L. A., Wang, D. D., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction+adhesion+is+necessary+for+radial+migration+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gap junction adhesion is necessary for radial migration in the neocortex.</a> Nature. 448, 901-907 (2007).</li>
<li>Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Muller, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reelin+regulates+cadherin+function+via+Dab1%2FRap1+to+control+neuronal+migration+and+lamination+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Reelin regulates cadherin function via Dab1/Rap1 to control neuronal migration and lamination in the neocortex.</a> Neuron. 69, 482-497 (2011).</li>
<li>Gotz, M., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+preservation+of+cortical+layers+in+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Formation and preservation of cortical layers in slice cultures.</a> J. Neurobiol. 23, 783-802 (1992).</li>
<li>Cameron, R. S., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+membrane+proteins+that+comprise+the+plasmalemmal+junction+between+migrating+neurons+and+radial+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification of membrane proteins that comprise the plasmalemmal junction between migrating neurons and radial glial cells.</a> J Neurosci. 14, 3139-3155 (1994).</li>
<li>Lizarraga, S. B., Coser, K. R., Sabbagh, M., Morrow, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Study+of+Neuronal+Morphogenesis%3A+Ex+vivo+RNAi+Electroporation+in+Embryonic+Murine+Cerebral+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex.</a> J. Vis. Exp. (63), e3621(2012).</li>
<li>Jossin, Y., Goffinet, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reelin+signals+through+phosphatidylinositol+3-kinase+and+Akt+to+control+cortical+development+and+through+mTor+to+regulate+dendritic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reelin signals through phosphatidylinositol 3-kinase and Akt to control cortical development and through mTor to regulate dendritic growth.</a> Mol. Cell Biol. 27, 7113-7124 (2007).</li>
<li>Jossin, Y., Ogawa, M., Metin, C., Tissir, F., Goffinet, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+SRC+family+kinases+and+non-classical+protein+kinases+C+induce+a+reeler-like+malformation+of+cortical+plate+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibition of SRC family kinases and non-classical protein kinases C induce a reeler-like malformation of cortical plate development.</a> J. Neurosci. 23, 9953-9959 (2003).</li>
<li>Kingsbury, M. A., Rehen, S. K., Contos, J. J., Higgins, C. M., Chun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-proliferative+effects+of+lysophosphatidic+acid+enhance+cortical+growth+and+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Non-proliferative effects of lysophosphatidic acid enhance cortical growth and folding.</a> Nat. Neurosci. 6, 1292-1299 (2003).</li>
<li>Rehen, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+of+embryonic+culture+for+assessing+global+changes+in+brain+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A new method of embryonic culture for assessing global changes in brain organization.</a> J. Neurosci. Methods. 158, 100-108 (2006).</li>
<li>Jossin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+central+fragment+of+Reelin%2C+generated+by+proteolytic+processing+in+vivo%2C+is+critical+to+its+function+during+cortical+plate+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development.</a> J. Neurosci. 24, 514-521 (2004).</li>
<li>O'Dell, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer+6+cortical+neurons+require+Reelin-Dab1+signaling+for+cellular+orientation%2C+Golgi+deployment%2C+and+directed+neurite+growth+into+the+marginal+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Neural.+Dev%22%5BJournal%5D)">Layer 6 cortical neurons require Reelin-Dab1 signaling for cellular orientation, Golgi deployment, and directed neurite growth into the marginal zone.</a> Neural. Dev. 7, 25(2012).</li>
<li>Powrozek, T. A., Olson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-induced+disruption+of+Golgi+apparatus+morphology%2C+primary+neurite+number+and+cellular+orientation+in+developing+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Ethanol-induced disruption of Golgi apparatus morphology, primary neurite number and cellular orientation in developing cortical neurons.</a> Alcohol. , (2012).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Suter, B., Nowakowski, R. S., Bhide, P. G., Caviness, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigating+neocortical+neurogenesis+and+neuronal+specification%3A+a+positional+information+system+encoded+by+neurogenetic+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+The+Official+Journal+of+The+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Navigating neocortical neurogenesis and neuronal specification: a positional information system encoded by neurogenetic gradients.</a> The Journal of Neuroscience : The Official Journal of The Society for Neuroscience. 27, 10777-10784 (2007).</li>
<li>Englund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((and+Tbr1+are+expressed+sequentially+by+radial+glia%2C+intermediate+progenitor+cells%2C+and+postmitotic+neurons+in+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex.</a> J. Neurosci. 25, 247-251 (2005).</li>
<li>Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eomes%3A%3AGFP-a+tool+for+live+imaging+cells+of+the+trophoblast%2C+primitive+streak%2C+and+telencephalon+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo.</a> Genesis. 45, 208-217 (2007).</li>
<li>Pearlman, A. L., Sheppard, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+in+early+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix in early cortical development.</a> Prog. Brain Res. 108, 117-134 (1996).</li>
<li>Milev, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+expression+of+hyaluronan-binding+proteoglycans+in+developing+brain%3A+aggrecan%2C+versican%2C+neurocan%2C+and+brevican%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of expression of hyaluronan-binding proteoglycans in developing brain: aggrecan, versican, neurocan, and brevican.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 247, 207-212 (1998).</li>
<li>Kwan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX5+postmitotically+regulates+migration%2C+postmigratory+differentiation%2C+and+projections+of+subplate+and+deep-layer+neocortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 16021-16026 (2008).</li>
<li>McKenna, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbr1+and+Fezf2+regulate+alternate+corticofugal+neuronal+identities+during+neocortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tbr1 and Fezf2 regulate alternate corticofugal neuronal identities during neocortical development.</a> The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 549-564 (2011).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li>
<li>Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+ventricular+zone+neural+precursors+contributes+to+neuronal+fate+diversity+in+the+postnatal+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex.</a> J. Neurosci. 30, 7028-7036 (2010).</li>
<li>Powrozek, T. A., Zhou, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prenatal+alcohol+exposure+on+the+development+of+the+vibrissal+somatosensory+cortical+barrel+network%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Dev.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of prenatal alcohol exposure on the development of the vibrissal somatosensory cortical barrel network.</a> Brain Res. Dev. Brain Res. 155, 135-146 (2005).</li>
<li>O'Dell, R., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aO%27Dell%2C+R+%22Society+for+Neuroscience%22">Society for Neuroscience</a>. , Washington D.C. (2011).</li>
<li>Tombol, T., Hajdu, F., Somogyi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+Golgi+picture+of+the+layer+VI+cortic-geniculate+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research.+Experimentelle+Hirnforschung.+Experimentation+Cerebrale%22%5BJournal%5D)">Identification of the Golgi picture of the layer VI cortic-geniculate projection neurons.</a> Experimental Brain Research. Experimentelle Hirnforschung. Experimentation Cerebrale. 24, 107-110 (1975).</li>
<li>Brumberg, J. C., Hamzei-Sichani, F., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+physiological+characterization+of+layer+VI+corticofugal+neurons+of+mouse+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Morphological and physiological characterization of layer VI corticofugal neurons of mouse primary visual cortex.</a> Journal of Neurophysiology. 89, 2854-2867 (2003).</li>
<li>Jones, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchrony+in+the+interconnected+circuitry+of+the+thalamus+and+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Synchrony in the interconnected circuitry of the thalamus and cerebral cortex.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1157, 10-23 (2009).</li>
<li>Kowalczyk, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermediate+Neuronal+Progenitors+%28Basal+Progenitors%29+Produce+Pyramidal-Projection+Neurons+for+All+Layers+of+Cerebral+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb.+Cortex%22%5BJournal%5D)">Intermediate Neuronal Progenitors (Basal Progenitors) Produce Pyramidal-Projection Neurons for All Layers of Cerebral Cortex.</a> Cereb. Cortex. , (2009).</li>
<li>Konig, N., Roch, G., Marty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+onset+of+synaptogenesis+in+rat+temporal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomy+and+Embryology%22%5BJournal%5D)">The onset of synaptogenesis in rat temporal cortex.</a> Anatomy and Embryology. 148, 73-87 (1975).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

We hebben verbeterd en geëvalueerd een experimenteel model - hele halfrond explantaten - voor de studie van de vroege corticale ontwikkeling (E13-E15). Het model nuttig is gebleken voor de analyse van migratie en differentiatie van de excitatoire neuron lijn die laag 6 van de cerebrale cortex 25,37 vormt. De belangrijkste voordelen van het systeem zijn 1) organotypische groei 2 DIV, 2) eenvoud van bereiding en 3) experimentele toegang tot de neuronen voor elektroporatie, farmacologische manipulatie en beeldvo...

De zoogdieren hersenschors vormen door de gecoördineerde proliferatie, migratie en differentiatie van achtereenvolgens gegenereerde neuronen. Elk neuron is geboren in de ventriculaire zone (VZ) en migreert van de VZ in de tussenliggende zone (IZ), de vorming van de corticale plaat (CP) 1. Als ze door verschillende corticale gebieden, de migrerende neuronen tonen verschillende modi van migratie 2,3 die afhangen van het extracellulaire milieu en andere cellulaire elementen (bijv. radiale glia) in de zich ontwikkelende weefsel. Corticale neuronen dan arresteren migratie bovenaan de vormende corticale plaat in de samenvallende processen van neuronale migratie arrestatie en dendritogenesis 4. Corticale ontwikkeling wordt gestart tussen embryonale dag 11-13 (E11-13) 5 tot oprichting van de primordiale plexiform laag 6 of preplate (PP), een laag van pionier neuronen die ligt over de VZ. Aanstaandelaag 6 corticale neuronen (dwz de eerste corticale neuronen geboren in de VZ), dan oriënteren hun somata in een stereotype patroon en samenvloeien tot een aparte laag in de PP 7. Deze gebeurtenissen splitsing van de preplate in een oppervlakkige marginale (toekomstige corticale laag 1) en een diepe zone, waarbij de laatste bestaat uit aansluitplaat cellen (voorbijgaande corticale laag 7). Dit proces, genaamd preplate splitsen, is een fundamentele gebeurtenis in de toekomstige groei van de hersenschors 8. Veel genetische mutaties geïdentificeerd die verstoren de verschillende aspecten van de corticale ontwikkeling 9. Corticale ontwikkeling kan ook negatief worden beïnvloed door blootstelling aan geconsumeerde stoffen als cocaïne 10 en alcohol 11. Omdat corticale afwijkingen die ontstaan ​​tijdens de ontwikkeling zijn waarschijnlijk bijdragen aan neurologische aandoeningen (bijv. autisme, schizofrenie), empirische onderzoeken van storingen aan de corticale ontwikkeling zijn inherently belangrijk. Het is daarom van groot belang om benaderingen vast te stellen corticale ontwikkeling dat een snelle testen van genetische of toxine effecten toestaan, maar dat ook de mogelijke interacties tussen differentiëren neuronen, andere celtypes en extracellulaire matrix (ECM) behouden tijdens deze vroege periode van ontwikkeling van de hersenen 12 studiepunten . Slice explantaten 13 hebben een dergelijk systeem en zijn alom gebruikt voor het testen corticale neuron ontwikkeling 14-16. Echter, slice assays het nadeel dat neuronale migratie en lamineren kan abnormaal mogelijk 17 door schade aan de meningeale cellen die de ontwikkelende hersenen en verankeren de radiale gliale steiger omringen. Als radiale gliale vezels een belangrijk substraat voor corticale neuron migratie 18 verstoring van de basale lamina door het snijden kan plaatselijk verstoren radiale gliale architectuur en leiden tot gewijzigde corticale migratie. Bovendien de sliCED oppervlakken van explantaten biedt een regio van dode cellen die de normale samenstelling van de ECM in deze gebieden kunnen veranderen. Meer recente benaderingen richtten hun analyse op cellen diep in de slice die worden omringd door passende gezonde soorten cellen en ECM. In sommige gevallen deze nieuwere benaderingen vereisen dat de oorspronkelijke dikke plak gekweekte cryo-sectie of paraffine secties na fixatie zodat de relatief normale inwendige van het segment beschikbaar is voor analyse 19-21. Zowel de originele vibratome snijden de live segmenten voor cultuur en de daaropvolgende cryosectioning vaste segmenten voor analyse te maken dient zorg en inspanning voor deze assays werken. Om een eenvoudige en complementaire aanpak voor de studie van de vroege corticale ontwikkeling te bieden, hebben we gewijzigd van een bestaande slice benaderingen 13 tot studies van de vroege corticale ontwikkeling mogelijk te maken. We hebben een whole halfrond explantaat model vergelijkbaar met een bestaande E14 hele halfrond model dat schudden culturen die op 65 omwentelingen per minuut en toegestane organotypische groei gedurende 16-18 uur 22,23. In onze benadering worden volledige halfrond explantaten bovenaan semi-permeabel membraan 13 met een zuurstofrijke atmosfeer cultuur 21,24 tot organotypische corticale groei verlengen gedurende 48 uur. Deze aanpak maakt het ook mogelijk consistente elektroporatie ontwikkelen corticale neuronen. De embryo&#39;s verwijderd uit de baarmoeder en geëlektroporeerd met plasmide DNA te introduceren en de grote hersenen wordt dan ontleed. Elk halfrond is geïsoleerd en geplaatst mediale zijde naar beneden op een collageen gecoate filter. Het explantaat wordt vervolgens gekweekt gedurende 48 uur, een periode die preplate splitsing 8 omvat. Tijdens de kweekperiode, L6 neuronen ontwikkelen van voorloper van gedifferentieerde neuron 25, de juiste positie binnen de corticale plaat. Gedurende deze periode is de ontwikkeling vanneuron wordt omringd door de juiste ECM en celtypen die de desbetreffende cel in vivo zouden voordoen. Dit systeem heeft al bewezen waardevol bij het ​​ontcijferen van de cellulaire gebeurtenissen die ethanol toxiciteit 26, laag 6 vorming en preplate splitsen 7,25 ten grondslag liggen.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 + GlutaMAX</td><td>GIBCO</td><td>10565</td><td></td></tr><tr><td>G5 Supplement 100X</td><td>Invitrogen</td><td>17503-012</td><td></td></tr><tr><td>B27 Serum-Free Suppl. 50X</td><td>Invitrogen</td><td>1504-044</td><td></td></tr><tr><td>Pen / Strep Liquid 100X</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 500 ml</td><td>GIBCO</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>Culture insert collagen coated </td><td>Costar</td><td>3492</td><td></td></tr><tr><td>Bovine skin gelatin </td><td>Sigma</td><td>G9382</td><td></td></tr><tr><td>H&#8211;chst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>7906</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BTX 830 Electroporator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450052</td><td></td></tr><tr><td>Tweezer electrodes 10mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450166</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Billups Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringe (5uL)</td><td>Hamilton</td><td>87930</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringe needle</td><td>Hamilton</td><td>7803-04</td><td>Specificeer 1" en stijl 4</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>FST</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors Tough Cut 9 cm</td><td>FST</td><td>14058-09</td><td></td></tr></tbody></table>

ex utero elektroporatie en whole halfrond explantaten: een eenvoudige experimentele methode voor bestudering van vroege corticale ontwikkeling

Ex utero Electroporation and Whole Hemisphere Explants: A Simple Experimental Method for Studies of Early Cortical Development

Corticale ontwikkeling brengt complexe interacties tussen neuronen en niet-neuronale elementen waaronder precursor cellen, bloedvaten, meninges en bijbehorende extracellulaire matrix. Omdat ze een geschikte organotypische omgeving worden corticale slice explantaten vaak gebruikt om de interacties die neuronale differentiatie en ontwikkeling controleren onderzoeken. Hoewel nuttig, kan de slice explantaat model last hebben van nadelen waaronder afwijkende cellulaire lamineren en migratie. Hier rapporteren geheel hersenhelft explant voor studies van vroege corticale ontwikkeling die gemakkelijker te bereiden dan corticale schijfjes en shows consistente organotypische migratie en lamineren. In dit modelsysteem vroege lamineren en migratiepatronen normaal doorgaan gedurende twee dagen in vitro, inclusief de periode van preplate splitsen, waarbij potentiële corticale laag zes vormen. Vervolgens hebben we ontwikkelden een ex utero elektroporatie (EUEP)aanpak die ~ 80% succes bij de opsporing van GFP expressie om neuronen te ontwikkelen in de dorsale mediale cortex bereikt. De hele halfrond explantatie model maakt vroege corticale ontwikkeling toegankelijk voor elektroporatie, farmacologische interventie en live imaging benaderingen. Deze methode vermijdt het voortbestaan ​​operatie vereist van in utero elektroporatie (IUEP) benaderingen, terwijl het verbeteren van zowel de transfectie en areal gericht consistentie. Deze werkwijze vergemakkelijkt experimentele studies van neuronale proliferatie, migratie en differentiatie.

De embryonale knaagdier cortex vertoont een dwarse neurogenetische gradiënt gedurende de ontwikkelingsperiode, zodanig dat laterale neocortex is ongeveer 1 dag volwassener dan dorsale mediale neocortex 28. Het grootste deel van laag 6 neuronen aldus verkregen (dwz vertonen hun laatste S-fase) op E12 in laterale cortex (ook wel Field 40 5) en E13 in de dorsale mediale cortex (ook wel Field 1 5). Preplate splitsen begint na ongeveer 1 dag Laag 6 neuron generatie en dus wordt ingew...

Dit protocol beschrijft een verbeterde explantaat procedure die inhoudt dat<em&gt; Ex utero</em&gt; Elektroporatie, dissectie en de cultuur van volledige hersenhelften uit de embryonale muis. De voorbereiding vergemakkelijkt farmacologische studies en analyses van gen-functie tijdens de vroege corticale ontwikkeling.

Ex utero elektroporatie en Whole halfrond Explantaten: Een eenvoudige experimentele methode voor bestudering van vroege corticale ontwikkeling

Cortical development involves complex interactions between neurons and non-neuronal elements including precursor cells, blood vessels, meninges and ...

Het algemene doel van deze procedure is het prepareren van volledige cerebrale hemisfeer-explantaten voor de studie van de vroege corticale ontwikkeling. Dit wordt bereikt door eerst muisembryo's te oogsten op embryonale dag 13. Vervolgens wordt het plasmide-DNA-mengsel in het cerebrale ventrikel geïnjecteerd, waarna een ex utero electroporatie wordt uitgevoerd.Bereid vervolgens een compleet hemisfeer-explantaat voor vanuit het geëlektroporeerde embryo. De laatste stap is het fixeren en coupes maken van het complete hemisfeer-explantaat voor histologische analyses. Uiteindelijk kan het gevolg van mutatie of blootstelling aan toxinen op de ontwikkeling van corticale neuronen worden geëvalueerd via immunohistologische analyses van GFP-expresserende neuronen.Mijn naam is Eric Olson. Ik ben werkzaam bij de afdeling Neurowetenschappen en Fysiologie hier aan de SUNY Upstate Medical University in Syracuse, en vandaag gaan we u een methode laten zien die wij hebben ontwikkeld, genaamd de whole Hemisphere X explan. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals slice explan, is dat whole hemisphere X explan eenvoudig voor te bereiden zijn en twee dagen organotypische groei bieden.De methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de neuro-ontwikkeling, zoals de wijze waarop een specifieke mutatie of toxine de vroege corticale ontwikkeling verstoort. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, aangezien het prepareren van het volledige hemisfeer-explan zonder de meningen te beschadigen enige oefening vereist. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, omdat de stappen voor de dissectie en de overdracht van het explan moeilijk aan te leren zijn vanwege de gevoeligheid van het weefsel voor mechanische verstoring.De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Theresa Ozzi, een postdoc in mijn laboratorium. Gebruik voor dit protocol een commercieel beschikbare kit om de plasmiden te zuiveren. Bereid het plasmid-DNA voor in water met een concentratie van 0.33 mg/mL en voeg fast green-kleurstof toe als injectietracer bij ongeveer 0,02% w/v; desinfecteer altijd de chirurgische instrumenten, de werkruimte en de microscoop.Reinig met 70% ethanol en offer vervolgens op dag E 13 een vereist aantal Swiss Webster-moederdieren door koolstofdioxide-inhalatie. Plaats de embryo's na verwijdering in een schaal van 10 centimeter met ijskoud HBSS, waarbij de schaal ijskoud wordt gehouden. Disseceer elk embryo zorgvuldig uit de omringende extra-embryonale membranen.Breng nu elk embryo afzonderlijk over naar een schoon schaaltje met ijskoud HBSS. Injecteer met een Hamilton-spuit twee tot drie µL van het voorbereide DNA in het ventrikel van de linker cerebrale hemisfeer. Injecteer niet in of nabij het corticale gebied dat bedoeld is voor toekomstige analyse.Om het DNA te elektroporeren, houdt u het embryo voorzichtig vast met een pincet en plaatst u de positieve paddle van de pincetelektrode lichtjes op de dorsale middellijn van de kop. Plaats de negatieve paddle lichtjes onder de kin van het embryo. Voer een programma uit van vijf pulsen van 30 volt, elk met een duur van 50 milliseconden op intervallen van één seconde met behulp van een BTX 830 model, of andere systemen kunnen worden ingesteld volgens de instructies van de fabrikant.Plaats elk embryo terug in het ijskoude HBSS en ga verder met de preparatie van het volledige hemisfeer-Explan onder een dissectiemicroscoop met behulp van twee pincetten van nummer vijf. Verwijder de huid en de kraakbenige schedel van de kop van het embryo. Schuif vervolgens een pincet onder de hersenen.Om de intacte hersenen uit de schedel te verwijderen, wordt het geëlektroporeerde hemisfeer gedisseceerd, inclusief het vastzittende weefsel van de middenhersenen. Let erop dat de meningen bovenop de gedisseceerde corticale hemisfeer niet beschadigd raken. Naar onze ervaring is de dissectie en verwijdering van de geëlektroporeerde hemisfeer zonder de meningen te beschadigen de moeilijkste stap om onder de knie te krijgen.Overbreng na dissectie elke hemisfeer naar vijf milliliter ijskoud HBSS met behulp van een verbreed pipetpuntje van één milliliter. Indien nodig kunnen de embryo's bewaard worden in afzonderlijke wells van een 12-wells weefkweekschaal. Breng vervolgens voorzichtig maximaal zes hemisferen over naar een met collageen gecoate kweek van 24 millimeter.Plaats de insert met de mediale zijde naar beneden en arrangeer deze. Vul nu een putje van 35 millimeter van een six-well dish met 2,7 milliliters aangevuld medium. Verwijder alle overtollige HBSS uit de insert en plaats de insert in het putje met het medium; pipetteer een paar druppels van het medium uit het putje op de bovenkant van elk explantaat.Verhoog het volume van het medium niet. We hebben vastgesteld dat het essentieel is om een paar druppels kweekmedium bovenop de X-explantaten te plaatsen, zodat de X-explantaten niet volledig met medium bedekt zijn. Dit kan betekenen dat er tot wel 400 µL wordt toegevoegd aan de 2,7 ml medium bovenop het X-explantaat.Plaats de schaal in een billups rothenberg-kamer die een bevochtigingsschaal met water bevat en gedurende ten minste één minuut is verzadigd met 95% oxygen. Sluit de kamer luchtdicht af en koppel de gastoevoerslang los. Plaats de kamer gedurende twee dagen in een incubator van 37 degree Celsius, waarna de prepl splitting zal hebben plaatsgevonden.Ter voorbereiding. Maak kussentjes voor het inbedden van de explanaten. Maak een 10% kalfshuidgelatine-oplossing bij 60 °C.Zodra de stof is opgelost, giet u ongeveer 10 milliliters van de oplossing in een schaal van 10 centimeter. Bewaar de resterende oplossing bij 60 degrees Celsius voor later gebruik. Laat de pads, indien nodig, een half uur uitharden.Ze kunnen enkele dagen bij vier graden Celsius worden bewaard, maar moeten voor gebruik worden opgewarmd tot kamertemperatuur. Bereid op de dag van de fixatie in een zuurkast de Pagano, het fixatief en de Pagano-oplossing zonder fixatief. Warm de fixatie-oplossing op tot 37 graden Celsius.Haal de explantaten voorzichtig en snel uit de incubator zonder de weefsels te verstoren. Verwijder het grootste deel van het medium en vervang dit door vijf milliliters voorverwarmd fixatief. Zorg ervoor dat elk explantaat volledig is ondergedompeld.Fixeer de weefsels gedurende één uur bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens het fixatief en vervang dit door Pagano-oplossing. Zonder fixatief.Voeg een paar druppels 10% natriumazide toe aan elke put. De weefsels kunnen nu worden bewaard bij vier graden Celsius totdat ze op een inbeddingskussen worden ingebed. Teken met behulp van een liniaal een raster op de bodem van de schaal.Maak vierkantjes van twee tot drie centimeter. Breng de individuele explantaten over naar het inbeddingskussen. Pipetteer alle resterende oplossing weg en bedek elk explantaat met een warme 10% gelatineoplossing.Laat het stollen. Wanneer het gestold is, voegt u langzaam meer gelatineloping toe totdat elk explantaat volledig is omringd. Voorkom dat het kussentje smelt, wat kan gebeuren als er in één keer te veel gelatine wordt toegevoegd.Laat de gelatine nu ongeveer een uur uitharden. Zodra deze is uitgehard, kan de individuele explan in kleine blokjes gelatine worden gesneden voordat er coupes worden gemaakt. Het is belangrijk om de blokjes een dag of twee na te fixeren in Pagano-fixeerder.Positioneer bij het snijden de explantaten met de bulbus olfactorius naar boven en maak coupes in het coronale vlak met een dikte van 100 micrometer. Verzamel de coupes in gekoelde PBS met 0,1% natriumazide.Bewaar de coupes bij vier graden Celsius totdat ze kunnen worden gekleurd met de beschreven techniek. Complete explantaten van de hemisfeer werden voorbereid bij E 13 voorafgaand aan de splitsing van de prelaat. In de dorsale neocortex.Het weefsel bevatte een transgen dat onrijpe neuronen van de excitatoire corticale lijn rapporteert. Corticale explantaten uit hetzelfde nest werden sequentieel gedurende een periode van twee dagen in vitro gefixeerd door middel van drop-fixatie en verwerkt voor een daaropvolgende histologische analyse. Op het eerste analysemoment, DIV nul, had de splitsing van de prepl in veld één nog niet plaatsgevonden bij DIV.De CP werd duidelijk en bleef groeien tot 2D IV. Zo ondersteunden de volledige hemisfeer-explantaten, die aanvankelijk op E 13 werden gekweekt, gedurende twee dagen de rijping van de cerebrale cortex en legden zij de voorafgaande splitsing in de dorsale neocortex vast om een normale histologische ontwikkeling in de dorsale neocortex te bevestigen. 2D IV-explantaten werden immunogekleurd voor chondroïtinesulfaat, proteoglycanen en componenten van de extracellulaire matrix. Twee banden van immunoreactiviteit in de dorsale cortex wezen op een correcte splitsing van de PPP in MZ en SP tijdens de in vitro kweekperiode.De PP werd gesplitst door L zes corticale neuronen die CTIP twee en TBR R één tot expressie brachten. Het immunokleuringspatroon van deze markers bevestigt de juiste expressie van deze transcriptiefactoren in de nieuw gevormde cp. Samen bevestigen deze analyses de ORGANOTYPISCHE vroege corticale ontwikkeling in het gehele hemisfeer-explant; met gebruik van het volledige beschreven protocol werden de linker ventrikels van intacte E 13 embryo's geïnjecteerd.De expressie van GFP in de geëlektroporeerde en verwerkte neurale precursorcellen in de vz kon worden waargenomen. Hoewel er cellen met een intense GFP-expressie werden gezien in de IZ en cp, werden er belangrijker nog talrijke GFP-positieve neuronen, aangeduid met pijlpunten, waargenomen aan de bovenzijde van de vormende CP met opkomende dendrieten en axonen. De discrete laag op de interface tussen de CP en MZ duidt op een correcte migratie, arrestatie en laminatie.De dendrieten strekten zich uit in de MZ, terwijl cortico-ugale axonen zich uitstrekten onder de CP en in de iz. De differentiërende cellen waren GFP-positieve cellen in verschillende stadia van maturiteit, waaronder neuronen met een bipolaire morfologie naast radiogliale vezels en daaronder multipolaire neuronen in de iz. De dendrieten strekten zich ook uit in de MZ, waar het ECM-eiwit reelin op passende wijze immunolokaliseert.Zo maken de condities van de elektroporatie en het explantaat een normale ontwikkeling van corticale neuronen mogelijk. Zoals verwacht werden de vormende cp bevolkt door post-mitotische GFP-positieve neuronen. Bijgevolg kan het protocol betrouwbaar L zes corticale neuronen targeten voor studies naar hun migratie en rijping.Uitgebreid gebruik van deze procedure heeft geleid tot een succespercentage van 79%. 195 van de 248 pogingen waren geschikt voor beeldvorming en analyse. De helft van de mislukkingen was te wijten aan het uitblijven van GFP-expressie of het missen van het doelsegment van GFP zodra de methode onder de knie was.Deze techniek kan in 90 minuten worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te oefenen met de dissecties, zodat de geëlektroporeerde hemisferen na deze procedure gecultiveerd kunnen worden met intacte meninges. Andere methoden, zoals time-lapse microscopie, kunnen worden toegepast om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de wijze waarop specifieke mutaties de neuronale migratie of dendritogenese verstoren.

ex-utero-electroporation-whole-hemisphere-explants-simple

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In Utero Intraventriculaire injectie en elektroporatie van de E15 muizenembryo&#39;s

In utero elektroporatie is een waardevolle methode voor het transfecteren neuronale stamcellen in vivo. Afhankelijk van de plaatsing van de elektroden en de ontwikkeling meetpunt van elektroporatie, kunnen bepaalde subsets van corticale cellen worden gericht. Gerichte cellen kunnen vervolgens worden geanalyseerd in vivo of in vitro voor de effecten van genetische manipulatie.

In utero Elektroporatie gevolgd door primaire neuronale Cultuur voor het bestuderen van Gene Functie in subset van de corticale neuronen

Een genoverdracht methode in de zich ontwikkelende hersenen van muizen wordt beschreven door middel van een unieke chirurgische methode en de speciale vorm van de elektroden. Deze unieke techniek maakt het mogelijk transfectie van plasmide DNA tijdelijk en ruimtelijk, die veel neurowetenschappers zullen helpen bij het bestuderen van ontwikkeling van de hersenen.

Muis In Utero Elektroporatie: Gecontroleerde spatiotemporele Gene Transfectie

Om een ​​snelle evaluatie van de functie van genen in de ontwikkeling van cerebrale cortex voeren beschrijven we werkwijzen...

Methoden voor Studie van Neuronale Morphogenesis:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi Elektroporatie in Embryonale Murine Cerebral Cortex

Dit artikel beschrijft in detail een protocol bij electroporate in utero de cerebrale cortex en de hippocampus bij E14.5 bij muizen. We tonen ook aan dat dit een waardevolle methode om dendrieten en stekels te bestuderen in deze twee cerebrale regio's.

Visualisatie en genetische manipulatie van dendrieten en stekels in de muis Cerebral cortex en de hippocampus met behulp van<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

Hier presenteren we een protocol dat een hulpmiddel biedt om regulerende mechanismen van specifieke genen tijdens de ontwikkeling van de hippocampus te onderzoeken. Het gebruik van ex utero elektroporatie en organotypische plakcultuur maakt de op- en neerregulatie van de expressie van genen van belang in enkele cellen mogelijk en volgt hun lot tijdens de ontwikkeling.

Ex Utero Electroporatie en Organotypische Slice Cultuur van de muis hippocampus Tissue

Dit protocol beschrijft in detail hoe specifiek te transfecteren verschillende regio's in het centrale zenuwstelsel van C57BL/6 via in utero elektroporatie. Inbegrepen in dit protocol zijn gedetailleerde instructies voor transfecties van regio's die zich ontwikkelen tot de cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, laterale septumkern en striatum.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Laterale Septal Nucleus- en Striatum-specifieke<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporatie in de C57BL / 6 muis

Dit manuscript biedt protocollen die gebruik maken van in de baarmoeder elektroporatie (IUE) om de structurele connectiviteit van neuronen te beschrijven op het single-cell niveau en de prikkelbaarheid van fluorescent gelabelde neuronen. Histologie wordt gebruikt dendritische en axonale uitsteeksels karakteriseren. Whole-cell opname in acute plakjes wordt gebruikt om prikkelbaarheid te onderzoeken.

In Utero Elektroporatie benaderingen om de prikkelbaarheid van neuronale subpopulaties en Single-cell Connectivity Studie

Hier bieden we een goedkope en betrouwbare methode voor het genereren van electroporated brein organotypic segment culturen van muis embryo's geschikt voor confocale microscopie en live-imaging technieken.

Ex Utero Electroporation en Organotypic Slice culturen van muis embryonale hersenen voor Live-Imaging van GABAergic interneuronen migreren

Dubbel in utero elektroporatie maakt het richten van celpopulaties die ruimtelijk en tijdelijk gescheiden. Deze techniek is nuttig om interacties tussen die celpopulaties te visualiseren met behulp van fluorescerende eiwitten in normale omstandigheden, maar ook na functionele experimenten om genen van belang te verstoren.

Dubbel in utero-elektroporatie om tijdelijk en ruimtelijk gescheiden celpopulaties te targeten

Leer ex utero elektroporatie en whole hemisphere explantaten voor vroege corticale ontwikkeling met embryonale muizen. Deze methode maakt farmacologische studies en genfunctie-analyses mogelijk.

Ex utero elektroporatie en Whole halfrond Explantaten: Een eenvoudige experimentele methode voor bestudering van vroege corticale ontwikkeling (Video) | JoVE Journal

Ex utero elektroporatie en Whole halfrond Explantaten: Een eenvoudige experimentele methode voor bestudering van vroege corticale ontwikkeling

Meer video's verkennen