Ex utero elektroporatie en Whole halfrond Explantaten: Een eenvoudige experimentele methode voor bestudering van vroege corticale ontwikkeling

Het algemene doel van deze procedure is het prepareren van volledige cerebrale hemisfeer-explantaten voor de studie van de vroege corticale ontwikkeling. Dit wordt bereikt door eerst muisembryo's te oogsten op embryonale dag 13. Vervolgens wordt het plasmide-DNA-mengsel in het cerebrale ventrikel geïnjecteerd, waarna een ex utero electroporatie wordt uitgevoerd.

Bereid vervolgens een compleet hemisfeer-explantaat voor vanuit het geëlektroporeerde embryo. De laatste stap is het fixeren en coupes maken van het complete hemisfeer-explantaat voor histologische analyses. Uiteindelijk kan het gevolg van mutatie of blootstelling aan toxinen op de ontwikkeling van corticale neuronen worden geëvalueerd via immunohistologische analyses van GFP-expresserende neuronen.

Mijn naam is Eric Olson. Ik ben werkzaam bij de afdeling Neurowetenschappen en Fysiologie hier aan de SUNY Upstate Medical University in Syracuse, en vandaag gaan we u een methode laten zien die wij hebben ontwikkeld, genaamd de whole Hemisphere X explan. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals slice explan, is dat whole hemisphere X explan eenvoudig voor te bereiden zijn en twee dagen organotypische groei bieden.

De methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de neuro-ontwikkeling, zoals de wijze waarop een specifieke mutatie of toxine de vroege corticale ontwikkeling verstoort. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, aangezien het prepareren van het volledige hemisfeer-explan zonder de meningen te beschadigen enige oefening vereist. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, omdat de stappen voor de dissectie en de overdracht van het explan moeilijk aan te leren zijn vanwege de gevoeligheid van het weefsel voor mechanische verstoring.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr. Theresa Ozzi, een postdoc in mijn laboratorium. Gebruik voor dit protocol een commercieel beschikbare kit om de plasmiden te zuiveren. Bereid het plasmid-DNA voor in water met een concentratie van 0.33 mg/mL en voeg fast green-kleurstof toe als injectietracer bij ongeveer 0,02% w/v; desinfecteer altijd de chirurgische instrumenten, de werkruimte en de microscoop.

Reinig met 70% ethanol en offer vervolgens op dag E 13 een vereist aantal Swiss Webster-moederdieren door koolstofdioxide-inhalatie. Plaats de embryo's na verwijdering in een schaal van 10 centimeter met ijskoud HBSS, waarbij de schaal ijskoud wordt gehouden. Disseceer elk embryo zorgvuldig uit de omringende extra-embryonale membranen.

Breng nu elk embryo afzonderlijk over naar een schoon schaaltje met ijskoud HBSS. Injecteer met een Hamilton-spuit twee tot drie µL van het voorbereide DNA in het ventrikel van de linker cerebrale hemisfeer. Injecteer niet in of nabij het corticale gebied dat bedoeld is voor toekomstige analyse.

Om het DNA te elektroporeren, houdt u het embryo voorzichtig vast met een pincet en plaatst u de positieve paddle van de pincetelektrode lichtjes op de dorsale middellijn van de kop. Plaats de negatieve paddle lichtjes onder de kin van het embryo. Voer een programma uit van vijf pulsen van 30 volt, elk met een duur van 50 milliseconden op intervallen van één seconde met behulp van een BTX 830 model, of andere systemen kunnen worden ingesteld volgens de instructies van de fabrikant.

Plaats elk embryo terug in het ijskoude HBSS en ga verder met de preparatie van het volledige hemisfeer-Explan onder een dissectiemicroscoop met behulp van twee pincetten van nummer vijf. Verwijder de huid en de kraakbenige schedel van de kop van het embryo. Schuif vervolgens een pincet onder de hersenen.

Om de intacte hersenen uit de schedel te verwijderen, wordt het geëlektroporeerde hemisfeer gedisseceerd, inclusief het vastzittende weefsel van de middenhersenen. Let erop dat de meningen bovenop de gedisseceerde corticale hemisfeer niet beschadigd raken. Naar onze ervaring is de dissectie en verwijdering van de geëlektroporeerde hemisfeer zonder de meningen te beschadigen de moeilijkste stap om onder de knie te krijgen.

Overbreng na dissectie elke hemisfeer naar vijf milliliter ijskoud HBSS met behulp van een verbreed pipetpuntje van één milliliter. Indien nodig kunnen de embryo's bewaard worden in afzonderlijke wells van een 12-wells weefkweekschaal. Breng vervolgens voorzichtig maximaal zes hemisferen over naar een met collageen gecoate kweek van 24 millimeter.

Plaats de insert met de mediale zijde naar beneden en arrangeer deze. Vul nu een putje van 35 millimeter van een six-well dish met 2,7 milliliters aangevuld medium. Verwijder alle overtollige HBSS uit de insert en plaats de insert in het putje met het medium; pipetteer een paar druppels van het medium uit het putje op de bovenkant van elk explantaat.

Verhoog het volume van het medium niet. We hebben vastgesteld dat het essentieel is om een paar druppels kweekmedium bovenop de X-explantaten te plaatsen, zodat de X-explantaten niet volledig met medium bedekt zijn. Dit kan betekenen dat er tot wel 400 µL wordt toegevoegd aan de 2,7 ml medium bovenop het X-explantaat.

Plaats de schaal in een billups rothenberg-kamer die een bevochtigingsschaal met water bevat en gedurende ten minste één minuut is verzadigd met 95% oxygen. Sluit de kamer luchtdicht af en koppel de gastoevoerslang los. Plaats de kamer gedurende twee dagen in een incubator van 37 degree Celsius, waarna de prepl splitting zal hebben plaatsgevonden.

Ter voorbereiding. Maak kussentjes voor het inbedden van de explanaten. Maak een 10% kalfshuidgelatine-oplossing bij 60 °C.

Zodra de stof is opgelost, giet u ongeveer 10 milliliters van de oplossing in een schaal van 10 centimeter. Bewaar de resterende oplossing bij 60 degrees Celsius voor later gebruik. Laat de pads, indien nodig, een half uur uitharden.

Ze kunnen enkele dagen bij vier graden Celsius worden bewaard, maar moeten voor gebruik worden opgewarmd tot kamertemperatuur. Bereid op de dag van de fixatie in een zuurkast de Pagano, het fixatief en de Pagano-oplossing zonder fixatief. Warm de fixatie-oplossing op tot 37 graden Celsius.

Haal de explantaten voorzichtig en snel uit de incubator zonder de weefsels te verstoren. Verwijder het grootste deel van het medium en vervang dit door vijf milliliters voorverwarmd fixatief. Zorg ervoor dat elk explantaat volledig is ondergedompeld.

Fixeer de weefsels gedurende één uur bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens het fixatief en vervang dit door Pagano-oplossing. Zonder fixatief.

Voeg een paar druppels 10% natriumazide toe aan elke put. De weefsels kunnen nu worden bewaard bij vier graden Celsius totdat ze op een inbeddingskussen worden ingebed. Teken met behulp van een liniaal een raster op de bodem van de schaal.

Maak vierkantjes van twee tot drie centimeter. Breng de individuele explantaten over naar het inbeddingskussen. Pipetteer alle resterende oplossing weg en bedek elk explantaat met een warme 10% gelatineoplossing.

Laat het stollen. Wanneer het gestold is, voegt u langzaam meer gelatineloping toe totdat elk explantaat volledig is omringd. Voorkom dat het kussentje smelt, wat kan gebeuren als er in één keer te veel gelatine wordt toegevoegd.

Laat de gelatine nu ongeveer een uur uitharden. Zodra deze is uitgehard, kan de individuele explan in kleine blokjes gelatine worden gesneden voordat er coupes worden gemaakt. Het is belangrijk om de blokjes een dag of twee na te fixeren in Pagano-fixeerder.

Positioneer bij het snijden de explantaten met de bulbus olfactorius naar boven en maak coupes in het coronale vlak met een dikte van 100 micrometer. Verzamel de coupes in gekoelde PBS met 0,1% natriumazide.

Bewaar de coupes bij vier graden Celsius totdat ze kunnen worden gekleurd met de beschreven techniek. Complete explantaten van de hemisfeer werden voorbereid bij E 13 voorafgaand aan de splitsing van de prelaat. In de dorsale neocortex.

Het weefsel bevatte een transgen dat onrijpe neuronen van de excitatoire corticale lijn rapporteert. Corticale explantaten uit hetzelfde nest werden sequentieel gedurende een periode van twee dagen in vitro gefixeerd door middel van drop-fixatie en verwerkt voor een daaropvolgende histologische analyse. Op het eerste analysemoment, DIV nul, had de splitsing van de prepl in veld één nog niet plaatsgevonden bij DIV.

De CP werd duidelijk en bleef groeien tot 2D IV. Zo ondersteunden de volledige hemisfeer-explantaten, die aanvankelijk op E 13 werden gekweekt, gedurende twee dagen de rijping van de cerebrale cortex en legden zij de voorafgaande splitsing in de dorsale neocortex vast om een normale histologische ontwikkeling in de dorsale neocortex te bevestigen. 2D IV-explantaten werden immunogekleurd voor chondroïtinesulfaat, proteoglycanen en componenten van de extracellulaire matrix. Twee banden van immunoreactiviteit in de dorsale cortex wezen op een correcte splitsing van de PPP in MZ en SP tijdens de in vitro kweekperiode.

De PP werd gesplitst door L zes corticale neuronen die CTIP twee en TBR R één tot expressie brachten. Het immunokleuringspatroon van deze markers bevestigt de juiste expressie van deze transcriptiefactoren in de nieuw gevormde cp. Samen bevestigen deze analyses de ORGANOTYPISCHE vroege corticale ontwikkeling in het gehele hemisfeer-explant; met gebruik van het volledige beschreven protocol werden de linker ventrikels van intacte E 13 embryo's geïnjecteerd.

De expressie van GFP in de geëlektroporeerde en verwerkte neurale precursorcellen in de vz kon worden waargenomen. Hoewel er cellen met een intense GFP-expressie werden gezien in de IZ en cp, werden er belangrijker nog talrijke GFP-positieve neuronen, aangeduid met pijlpunten, waargenomen aan de bovenzijde van de vormende CP met opkomende dendrieten en axonen. De discrete laag op de interface tussen de CP en MZ duidt op een correcte migratie, arrestatie en laminatie.

De dendrieten strekten zich uit in de MZ, terwijl cortico-ugale axonen zich uitstrekten onder de CP en in de iz. De differentiërende cellen waren GFP-positieve cellen in verschillende stadia van maturiteit, waaronder neuronen met een bipolaire morfologie naast radiogliale vezels en daaronder multipolaire neuronen in de iz. De dendrieten strekten zich ook uit in de MZ, waar het ECM-eiwit reelin op passende wijze immunolokaliseert.

Zo maken de condities van de elektroporatie en het explantaat een normale ontwikkeling van corticale neuronen mogelijk. Zoals verwacht werden de vormende cp bevolkt door post-mitotische GFP-positieve neuronen. Bijgevolg kan het protocol betrouwbaar L zes corticale neuronen targeten voor studies naar hun migratie en rijping.

Uitgebreid gebruik van deze procedure heeft geleid tot een succespercentage van 79%. 195 van de 248 pogingen waren geschikt voor beeldvorming en analyse. De helft van de mislukkingen was te wijten aan het uitblijven van GFP-expressie of het missen van het doelsegment van GFP zodra de methode onder de knie was.

Deze techniek kan in 90 minuten worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te oefenen met de dissecties, zodat de geëlektroporeerde hemisferen na deze procedure gecultiveerd kunnen worden met intacte meninges. Andere methoden, zoals time-lapse microscopie, kunnen worden toegepast om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de wijze waarop specifieke mutaties de neuronale migratie of dendritogenese verstoren.