Grafeen Coatings voor Biomedische implantaten

Het algemene doel van deze procedure is om een methode te demonstreren om metallische vormgeheugenlegering nitinol te coaten met grafeen voor verbeterde hemocompatibiliteit in implantaatmaterialen die in contact komen met bloed. Dit wordt bereikt door eerst grafeen te laten groeien op koperfolies met behulp van chemische dampfasedepositie. De tweede stap is om de koperfolies weg te eten en het bereide grafeen over te brengen naar nitinol substraten.

Vervolgens worden de met grafeen gecoate nitinol substraten gebruikt voor het kweken van endotheelcellen en gladde spiercellen. Om de cytocompatibiliteit te kwantificeren, is een andere test om de hemocompatibiliteit te controleren door zowel de eiwitten fibrinogeen en albumine op de met grafeen gecoate nitinol substraten te coderen. Uiteindelijk worden micro-raman-spectroscopie, confocale microscopie, in vitro cytotoxiciteitstests en SDS-pagina-eiwitanalyis gebruikt om een succesvolle grafeencoating, verbeterde celmorfologie, verbeterde cellevensvatbaarheid en betere hemocompatibiliteit aan te tonen.

Het grote voordeel van deze techniek of bestaande technieken zoals polymeercoating, is dat grafeencoatingen extreem duurzaam en corrosiebestendig zijn. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de oorsprong van verbeterde stenttechnologieën omdat de inherente materiaaleigenschappen van grafeen worden verwacht om eiwitabsorptie te verminderen en de activering van stollingsfactoren te verminderen als gevolg van eiwitconformatieverandering. Hoewel deze methode inzicht kan geven in grafeen gecoate nitinol stents, kan het ook worden gebruikt voor andere systemen zoals hartkleppen of katheters.

Om te beginnen plaatst u koperfolies van één centimeter bij één centimeter in een kwartsbuisoven van een inch en verwarmt u deze tot 1000 graden Celsius in aanwezigheid van 50 SCCM waterstof en 450 SCC CM argon. Introduceer vervolgens één en vier SCCM methaan in de 1000 graden Celsius oven bij verschillende stroomsnelheden gedurende 20 tot 30 minuten. Koel de monsters af tot kamertemperatuur in de oven onder stromende waterstofargon en methaan.

Na het verwijderen van de monsters uit de oven, snijdt u ze in vierkanten van 4,5 millimeter en gebruikt u PMMA verdund met 4% Anole om de koperfolies bij 4.000 RPM te spincoaten, gevolgd door een warmtebehandeling gedurende vijf minuten bij 150 graden Celsius. Ets de koperfolie met CE 100-ets totdat de koperfolie volledig is geëtst. Spoel gedurende 10 minuten in 10% zoutzuur en vervolgens gedurende 10 minuten in gedeïoniseerd water.

Om de grafeen PMMA-monsters te verkrijgen, brengt u de grafeenmonsters over naar 4,5 vierkante millimeter nitinol substraten. Vervolgens wordt het bij 450 graden Celsius in 300 SCCM argon en 700 SCCM waterstof gedurende twee uur behandeld. Om de PMMA te verwijderen, wast u uiteindelijk de nitinol substraten met aceton om de resterende PMMA op te lossen en het grafeen nikkel-titanium monster te verkrijgen.

Om de toxiciteitstests te beginnen, voegt u puur nitinol toe, één SCCM of vier SCCM grafeen nitinol substraten aan 96-wells platen waarbij de aangegeven SCCM overeenkomt met de methaanstroom die wordt gebruikt in de chemische dampfasedepositiegroei van grafeen. Zaai vervolgens ratten aortische endotheelcellen op tien tot de vijfde cellen per put in enkele van de putten die puur nitinol één SCCM of vier SCCM bevatten. Grafeen nitinol substraten, zaai ratten aortische gladde spiercellen op een vergelijkbare manier in een andere set putten.

Laat de cellen drie dagen of zeven dagen groeien in een incubator bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide en wissel elke andere dag het medium. Op het eindpunt verwijdert u het medium van de putten met gladde spiercellen en voegt u vers medium toe met 0,5 milligram per milliliter MTT aan elke put. Incubeer de cellen gedurende nog eens drie uur.

Vervolgens verwijdert u voorzichtig het medium en voegt u 100 microliter dimethylsulfoxide toe aan elke put. Laat de MTT-kristallen gedurende 10 minuten oplossen en breng de oplossing over naar een andere plaat. Voor de MTS-test verwijdert u het medium uit de putten met endotheelcellen op het eindpunt.

Vervang met 120 microliter MTS-oplossing en incubeer gedurende drie uur. Breng vervolgens de inhoud van de putten over naar een nieuwe plaat. Lees de absorptie op 490 nanometer en bepaal de procentuele levensvatbaarheid door de absorptie te normaliseren op de gemiddelde absorptie van het pure nitinol monster.

Herhaal deze stap minstens vijf keer voor elk monster. Voor confocale beeldvorming van ratten aortische gladde spiercellen, plaatst u de substraten in een achtkamerslide, waarbij u één kamer leeg laat als controle. Zaai vervolgens de cellen in alle kamers met 25.000 cellen per kamer en incubeer gedurende drie dagen bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.

Na het verwijderen van het medium van de slides, hecht u de cellen op het substraat met 4% formaldehyde in PBS-buffer gedurende 20 minuten. Was met PBS en permeeerd met 0,1% Triton X gedurende één minuut. Na het wassen met PBS, voegt u 100 microliter van de LOR 4 88 PHIN-oplossing toe aan 1,9 milliliter PBS-buffer.

Om acton te visualiseren, kleurt u de cellen met 250 microliter LOR 4 88 Phin gedurende 45 minuten en was vervolgens twee keer met PBS-buffer. Kleurt vervolgens de kernen met een fluorescerend montagemedium dat dpi bevat. Verzamel confocale beelden met behulp van een Nikon confocale ti.

Voordat u begint met de albumine- en fibrinogeen-eiwitabsorptie-experimenten, meet u de afmetingen van het substraat met behulp van een schuifmaat. Neem drie metingen voor elke zijde van de ongeveer vierkante monsters en gemiddeld. Om de lengte en breedte te krijgen, plaatst u het pure nitinol monster, het één SCCM grafeen nitinol monster en het vier SCCM grafeen nitinol monster in twee 12.

Welpjesplaatjes voegt u PBS-buffer toe met één milli