Name: Handelbaar Mammalian Cell Infecties met Protozoan-geprimed Bacteriën (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Leer hoe je bacteriën uit protozoaire gastheren oogst en kwantificeert voor infectie van zoogdiercellen. Deze methode gebruikt Legionella mala en GFP-fluorescentie om pathogeniteit nauwkeurig te meten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken dr. Craig Roy en Dr Dario Zamboni voor het verstrekken van een sjabloon voor protozoaire cel infecties. Wij danken dr. Jagdeep Obhrai, Dr Georgiana Purdy, Dr Fred Heffron en Todd Wisner voor apparatuur en reagentia; Dr Lulu Cambronne voor kritische beoordeling van het manuscript. Flow cytometrie werd uitgevoerd bij de OHSU Flowcytometrie Shared Resource faciliteit. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een subsidie ​​van de Medical Research Foundation van Oregon en een NIH subsidie ​​R21 AI088275 (EDC).

1. Voorbereiding van Legionella pneumophila Cultures for Priming Stage Infecties <ol><li> Transformeer alle L. pneumophila stammen die in de bepaling met het plasmide pAM239, codeert voor een isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) induceerbare green fluorescent protein (GFP) 28. Streak de bacteriestammen op ijzer en cysteine ​​aangevuld N-(2-acetamido)-2-aminoethaansulfonzuur (ACES) gebufferde kool gistextractagar (CYEA) met 6,25 pg / ml chlooramfenicol (CM) (voor plasmide onderhoud) en incubeer gedurende 72 uur bij 37 ° C. </li><li> Breng een inoculum van de bacteriestam in aangevuld ACES gebufferde gistextract bouillon (AYE) met 6,25 ug / ml CM en 1 mM IPTG en cultiveren stationaire fase (O / N) in een orbitale schudder bij 37 ° C. </li><li> Bevestigen GFP expressie in de in vitro kweken met fluorescentiemicroscopie. Breng 10 ul van cultuur op een glasplaatje onder een afdekkingslip en beeld met behulp van een 60X objectief met GFP excitatie / emissie cube (AMG EVOS fl). </li><li> Verdun een 100 pi aliquot van elke in vitro kweek tot 1:10 met steriel H2O Een blanco met 100 pi AYE media met 1 mM IPTG en 6,25 ug / ml en cm water. Neem OD600 metingen van de verdunningen met een spectrofotometer (Bio-Rad Smart Spec Plus). Bereken het volume nodig om een goed infecteren met een MOI = 20 voor elke in vitro culture: V = [(amoebe gezaaid) x MOI] / [OD 600 x (verdunningsfactor) x (constant)] = [(1 x 10 6 ) x (20)] / [OD 600 x (10) x (1 x 10 6)] = 2/OD 600. Bacterieconcentratie bepaald als OD 600 = 1.0 = 1 x 10 9 CFU / ml. </li></ol> 2. Priming Stage infectie met behulp van Acanthamoebacastellanii <ol><li> Onderhouden en cultiveren de amoeben in ATCC 712 PYG medium in 175 cm 2 flessen bij kamertemperatuur. </li><li> Vervang media in amoeben culren 24 uur voordat de bacteriële vloeibare kweken. Op dezelfde dag vloeibare bacterieculturen worden gestart, te verzamelen en te tellen cellen op een microscoop met een hemocytometer. </li><li> Verdun het amoeben met vers medium tot een eindconcentratie van 1 x 10 6 cellen / ml. Seed 12-well celkweek-platen met 1 ml van de amoeben met een pipet repeat en incubeer bij kamertemperatuur O / N. </li><li> Na incubatie was de putjes van de 12-well platen celkweek 3x met 1 ml steriele PBS met een 10 ml pipet en een serologische pipet handmatige hulp. </li><li> Na aspiratie van PBS, voeg 1 ml media infecties (ATCC 712 PYG media minus glucose, pepton en gistextract) met 1 mM IPTG en 6,25 ug / ml cm in elk putje. Incubeer de platen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Infect putjes bij een MOI = 20. Centrifugeer de plaat bij 400 xg gedurende 5 min (Eppendorf 5810R) en drijven in een 37 ° C waterbad gedurende 5 minuten. Breng de plaat op een 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende 18 uur. </li><li> Bevestig de infecties met behulp van live cell imaging op een fluorescentiemicroscoop voorafgaand aan cellysis en oogst van bacteriën te hosten. </li></ol> 3. Zaaien THP-1-cellen voor Target Cell Stage Infectie <ol><li> (Begin dit proces 24 uur voorafgaand aan het opzetten van vloeibare bacteriële culturen). Cultiveren THP-1-cellen in een 75 cm2 cultuur flessen tot bijna confluentie in RPMI 1640 medium met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS). </li><li> Tel de suspensiecellen met een hemocytometer verdunnen THP-1 cellen in RPMI 1640 medium met 10% FBS en 100 ng / ml forbol-12-myristaat-13-acetaat (PMA) tot een concentratie van 1 x 10 6 cellen / ml en plaat in 1 ml aliquots van 12-well platen celkweek. Incubeer de platen gedurende 48 uur bij 37 ° C, 5% CO2. </li></ol> 4. Verwerking van bacteriën voor Target Cell Stage Infectie na de Priming Stage Infectie <ol><li> Zuig het materiaal uit de primer amoeben. </li><li> Lyse de amoebae met 500 pl ijskoud steriel ultra gefiltreerde (UF) H 2 O en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. </li><li> Pool de lysaten volgens type stam en een E 512 nm gemeten voor elk van de gepoolde lysaten met fluorescentie plaatlezer (Molecular Devices SpectraMax Gemini EM) nemen. </li><li> Bereken een OD 600 meting voor de gepoolde lysaten: calcOD 600 = 0.0008 (E 512 - lysaat achtergrond) + 0,0019. De formule is eerder bepaald door een directe vergelijking grafieken van zowel de OD 600 en E 512 nm metingen van verdunningen van L. pneumophila wild-type GFP expressie van stationaire fase in vitro kweek (Figuur 1 *). De lysaten van geïnfecteerde amoebe, onder dezelfde experimentele omstandigheden als de geïnfecteerde amoebe, worden gebruikt als blanco en voorzien van een correctiewaarde (bijv. lysaat achtergrond), dat is opgenomen in de vergelijking. De omvang die nodig to een goed infecteren met een MOI = 20 wordt berekend voor elk lysaat pool: V = [(THP-1 geplaatste) x MOI] / [calcOD 600 x (constant)] = [(1 X 10 6) x (20)] / [calcOD 600 x (1 x 10 6)] = 20 / calcOD 600. </li><li> Was de THP-1 cellen 3x met PBS en voeg 1 ml vers RPMI 1640 (10% FBS) in elk putje. Incubate THP-1-cellen gedurende 1 uur bij 37 ° C, 5% CO2. </li><li> Infect de THP-1 cellen in de berekende MOI met de gepoolde lysaten. Laat een reeks kommetjes blijven geïnfecteerde, die als een negatieve controle voor flowcytometrische analyse. Verwerking van de priming fase moet worden afgerond in minder dan 30 minuten. De lysaten worden op ijs bewaard om veranderingen in bacteriële genexpressie beperkt vóór infectie. </li><li> Centrifugeer de plaat, zweven om de temperatuur te verhogen, en incubeer als in de priming stadium. </li><li> Een uur na de infectie, verwijdert u de media door aspiratie en wassen putten 3x met PBS om extracellulaire bacteriën te verwijderen. </li><li> Fre Voeg 1 mlsh RPMI 1640 (10% FBS) in de putjes en de plaat terug in de incubator. De tijd onmiddellijk na de media vervangen dient als tijdstip nul (T 0). Incubeer de THP-1-cellen 14-16 uur bij 37 ° C, 5% CO2. </li></ol> 5. Experimental Analysis 5,1 live cell imaging Beeld de geïnfecteerde wells met een fluorescentiemicroscoop (AMG EVOS fl) bij 10X en 20X vergroting (Figuren 1A-D). De beelden kunnen worden vergeleken ofwel kwalitatief of kwantitatief niveaus van infectie in zowel de priming fase en doelcel fase infecties bepalen. 5,2 Flowcytometrie <ol><li> De emissiepieken van verschillende infecties kunnen worden vergeleken door middel van flowcytometrie (BD FACS Calibur). Trypsinize de THP-1 geïnfecteerde cellen en voorzichtig te wassen van de putjes door het mengen in PBS met een pipet. </li><li> Verzamel de cellen door stamtype in 15 ml Falcon buizen en pellet bij 1800 xg gedurende 2min in het tafelblad centrifuge. </li><li> Suspendeer de pellets in 1 ml PBS en over te brengen naar 1,5 ml microcentrifugebuisjes. </li><li> Centrifugeer de schorsingen bij 1.800 x g (Eppendorf 5424) en resuspendeer de pellets in 1 ml PBS. Als de resulterende suspensies zijn zeer troebel (OD 600 ≥ 1,0) moeten worden verdund in PBS extra (1:3) om verstopping van de lijnen in de flowcytometer voorkomen. </li><li> Steriel gefiltreerd PBS voor equilibratie van de stromingscytometer en wasstappen tussen sample injecties. Zet de vooruit / zijwaartse verstrooiing van niet-geïnfecteerde doelcellen voorafgaand aan de injectie van doelcel infectie monsters. </li><li> Verzamel 20.000 totale evenementen voor elke conditie met behulp van 488 nm laser excitatie en de FL1 kanaal. </li><li> Gate post-capture celpopulaties bij niet-geïnfecteerde cellen en plot fluorescentie-intensiteit in een histogram (FlowJo) (figuur 1E) uit te sluiten. </li></ol> 5,3 CFU plating <ol><li> Onderzoek de efficiency of infectie door CFU plateren van de cellen geoogst voor flowcytometrie. Bereid seriële verdunningen van de monsters in ultra gefiltreerde H 2 O bij 10 -1, 10 -2 en 10 -3. </li><li> Plaat 20 pi van elke verdunning op 1/3 van een CYEA plaat met 6,25 ug / ml CM. </li><li> Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 72 uur. </li><li> Tel de kolonies met behulp van een tandenstoker en celteller. </li></ol>

<ol><li>Mahan, M. J., Slauch, J. M., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+bacterial+virulence+genes+that+are+specifically+induced+in+host+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Selection of bacterial virulence genes that are specifically induced in host tissues.</a> Science. 259, 686-688 (1993).</li>
<li>Mahan, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic-based+selection+for+bacterial+genes+that+are+specifically+induced+during+infection+of+a+host%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Antibiotic-based selection for bacterial genes that are specifically induced during infection of a host.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 669-673 (1995).</li>
<li>Rankin, S., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Legionella+pneumophila+promoters+regulated+by+the+macrophage+intracellular+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Agents+Dis%22%5BJournal%5D)">Identification of Legionella pneumophila promoters regulated by the macrophage intracellular environment.</a> Infect. Agents Dis. 2, 269-271 (1993).</li>
<li>Rankin, S., Li, Z., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-induced+genes+of+Legionella+pneumophila%3A+protection+from+reactive+intermediates+and+solute+imbalance+during+intracellular+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Macrophage-induced genes of Legionella pneumophila: protection from reactive intermediates and solute imbalance during intracellular growth.</a> Infect. Immun. 70, 3637-3648 (2002).</li>
<li>Fields, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+ecology+of+legionellae%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The molecular ecology of legionellae.</a> Trends Microbiol. 4, 286-290 (1996).</li>
<li>Cirillo, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+growth+in+Acanthamoeba+castellanii+affects+monocyte+entry+mechanisms+and+enhances+virulence+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Intracellular growth in Acanthamoeba castellanii affects monocyte entry mechanisms and enhances virulence of Legionella pneumophila.</a> Infect. Immun. 67, 4427-4434 (1999).</li>
<li>Cirillo, J. D., Falkow, S., Tompkins, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Legionella+pneumophila+in+Acanthamoeba+castellanii+enhances+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Growth of Legionella pneumophila in Acanthamoeba castellanii enhances invasion.</a> Infect. Immun. 62, 3254-3261 (1994).</li>
<li>Faucher, S. P., Mueller, C. A., Shuman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionella+pneumophila+Transcriptome+during+Intracellular+Multiplication+in+Human+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Legionella pneumophila Transcriptome during Intracellular Multiplication in Human Macrophages.</a> Front Microbiol. 2, 60(2011).</li>
<li>Kilvington, S., Price, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+Legionella+pneumophila+within+cysts+of+Acanthamoeba+polyphaga+following+chlorine+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Survival of Legionella pneumophila within cysts of Acanthamoeba polyphaga following chlorine exposure.</a> J. Appl. Bacteriol. 68, 519-525 (1990).</li>
<li>King, C. H., Shotts, E. B., Wooley, R. E., Porter, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+coliforms+and+bacterial+pathogens+within+protozoa+during+chlorination%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Survival of coliforms and bacterial pathogens within protozoa during chlorination.</a> Appl. Environ. Microbiol. 54, 3023-3033 (1988).</li>
<li>Horwitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+a+novel+phagosome+by+the+Legionnaires%27+disease+bacterium+%28Legionella+pneumophila%29+in+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Formation of a novel phagosome by the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) in human monocytes.</a> J. Exp. Med. 158, 1319-1331 (1983).</li>
<li>Horwitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis+of+the+Legionnaires%27+disease+bacterium+%28Legionella+pneumophila%29+occurs+by+a+novel+mechanism%3A+engulfment+within+a+pseudopod+coil%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis of the Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) occurs by a novel mechanism: engulfment within a pseudopod coil.</a> Cell. 36, 27-33 (1984).</li>
<li>Horwitz, M. A., Silverstein, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionnaires%27+disease+bacterium+%28Legionella+pneumophila%29+multiples+intracellularly+in+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Legionnaires' disease bacterium (Legionella pneumophila) multiples intracellularly in human monocytes.</a> J. Clin. Invest. 66, 441-450 (1980).</li>
<li>Burstein, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+identification+of+Legionella+pneumophila+effectors+using+a+machine+learning+approach%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Genome-scale identification of Legionella pneumophila effectors using a machine learning approach.</a> PLoS Pathog. 5, e1000508(2009).</li>
<li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+protein+substrates+of+the+Dot%2FIcm+type+IV+transporter+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila.</a> PLoS One. 6, e17638Forthcoming.</li>
<li>Nagai, H., Kubori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+IVB+Secretion+Systems+of+Legionella+and+Other+Gram-Negative+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Type IVB Secretion Systems of Legionella and Other Gram-Negative Bacteria.</a> Front Microbiol. 2, 136(2011).</li>
<li>Hubber, A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+host+cell+function+by+Legionella+pneumophila+type+IV+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).</li>
<li>Shin, S., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+cell+processes+that+influence+the+intracellular+survival+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Host cell processes that influence the intracellular survival of Legionella pneumophila.</a> Cell Microbiol. 10, 1209-1220 (2008).</li>
<li>Berger, K. H., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+defects+in+intracellular+growth+complemented+by+a+single+genetic+locus+in+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila.</a> Mol. Microbiol. 7, 7-19 (1993).</li>
<li>Marra, A., Blander, S. J., Horwitz, M. A., Shuman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Legionella+pneumophila+locus+required+for+intracellular+multiplication+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of a Legionella pneumophila locus required for intracellular multiplication in human macrophages.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 9607-9611 (1992).</li>
<li>Segal, G., Purcell, M., Shuman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+cell+killing+and+bacterial+conjugation+require+overlapping+sets+of+genes+within+a+22-kb+region+of+the+Legionella+pneumophila+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Host cell killing and bacterial conjugation require overlapping sets of genes within a 22-kb region of the Legionella pneumophila genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1669-1674 (1998).</li>
<li>Segal, G., Shuman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+new+region+required+for+macrophage+killing+by+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Characterization of a new region required for macrophage killing by Legionella pneumophila.</a> Infect Immun. 65, 5057-5066 (1997).</li>
<li>Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugative+transfer+by+the+virulence+system+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila.</a> Science. 279, 873-876 (1998).</li>
<li>Haghjoo, E., Galan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+transcriptional+regulator+that+controls+intracellular+gene+expression+in+Salmonella+Typhi%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a transcriptional regulator that controls intracellular gene expression in Salmonella Typhi.</a> Mol. Microbiol. 64, 1549-1561 (2007).</li>
<li>Molofsky, A. B., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiate+to+thrive%3A+lessons+from+the+Legionella+pneumophila+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differentiate to thrive: lessons from the Legionella pneumophila life cycle.</a> Mol. Microbiol. 53, 29-40 (2004).</li>
<li>Hammer, B. K., Tateda, E. S., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-component+regulator+induces+the+transmission+phenotype+of+stationary-phase+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A two-component regulator induces the transmission phenotype of stationary-phase Legionella pneumophila.</a> Mol. Microbiol. 44, 107-118 (2002).</li>
<li>Ninio, S., Zuckman-Cholon, D. M., Cambronne, E. D., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Legionella+IcmS-IcmW+protein+complex+is+important+for+Dot%2FIcm-mediated+protein+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Legionella IcmS-IcmW protein complex is important for Dot/Icm-mediated protein translocation.</a> Mol. Microbiol. 55, 912-926 (2005).</li>
<li>Neild, A. L., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionella+reveal+dendritic+cell+functions+that+facilitate+selection+of+antigens+for+MHC+class+II+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Legionella reveal dendritic cell functions that facilitate selection of antigens for MHC class II presentation.</a> Immunity. 18, 813-823 (2003).</li>
<li>Molmeret, M., Horn, M., Wagner, M., Santic, M., Abu Kwaik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amoebae+as+training+grounds+for+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Amoebae as training grounds for intracellular bacterial pathogens.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 10-1128 (2005).</li>
<li>Huws, S. A., Smith, A. W., Enright, M. C., Wood, P. J., Brown, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amoebae+promote+persistence+of+epidemic+strains+of+MRSA%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Amoebae promote persistence of epidemic strains of MRSA.</a> Environ. Microbiol. 8, 1130-1133 (2006).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Bacteriële genexpressie wordt streng gecontroleerd door een combinatie van levenscyclus en de reactie op signalen in de omgeving micromilieu. Vacuolaire ziekteverwekkers zoals L. pneumophila reageren op een groot aantal gastheercel afgeleide signalen bij compartimenten in een fagosoom. Als collectief gevolg van uitputting nutriënten in de gastheercel, de bacterie compenseert expressie factoren vereist voor succesvolle verspreiding naar een volgende gastheercel 25. L. pneumophila aangepast om...

Tal van bacteriële pathogenen hebben zich aangepast algemene strategieën om gastheercellen voor overleving en replicatie in een intracellulair compartiment te exploiteren. In veel gevallen pathogene mechanismen vergelijkbaar protozoaire en metazoïsche cellen. Deze twee micromilieus zeer verschillend en kunnen resulteren in differentiële expressie van virulentiefactoren 1-4. De veteranenziekte bacterie Legionella pneumophila is alomtegenwoordig geassocieerd met zoetwater omgevingen over de hele wereld 5. Belangrijker L. pneumophila gekweekt in protozoa cellen voor infectie van humane monocyten krijgen een pathogene voordeel suggereert dat globale genexpressie profielen van de bacterie verlaat een protozoa cel zijn anders dan die van de in vitro gekweekte organisme 6-8. In de natuur, zoetwater amoeben geven voedselrijk grenzen voor snelle amplificatie van een binnenvallende bacterie. Human overname van L. pneumophila wordt meestal toegeschreven aan inademing van besmet water druppels die de bacterie bevatten. Het is waarschijnlijk dat deze druppeltjes haven protozoa cel-geassocieerde bacteriën, protozoa, waar cellen meer resistent zijn voor conventionele waterbehandeling praktijken 9,10. Infectie van long alveolaire macrofagen verloopt op een wijze die nagenoeg identiek aan de intracellulaire levenscyclus van de bacterie in protozoa gastheercellen 11-13. Om te overleven en repliceren in eukaryotische cellen, L. pneumophila gebruikt een speciaal type IVb secretiesysteem genoemd Dot / Icm tot bijna 300 &#39;effector&#39; eiwitten te leveren in het cytosol van de gastheercel 14-16. Deze effector eiwitten collectief functioneren om cellulaire processen ondermijnen om een replicatie permissieve compartiment voor de bacterie 17,18 genereren. Deleties in elk van de 26 genen die de Dot / Icm transporter resultaat stammen gebrekkig intracellulaire mult omvatteniplication 19-23. Historisch deletie van afzonderlijke effector coderende genen zelden geleid stammen verzwakt voor intracellulaire groei. Dit fenomeen wordt toegeschreven aan verschillende hypothesen waaronder redundante functie en paraloge kopieën van effectoren. Sommige virulentiefactoren alleen uitgedrukt in de context van gastheercel-geassocieerde intracellulaire groei 24. We gerationaliseerd dat indien een bepaalde effector werd enkel in de context van protozoaire infectie dan de bijdrage van de effector kan worden vergeleken met een wild-type stam wanneer beide werden gekweekt in vitro. L. pneumophila overgangen van een replicatieve een doorlatende fase komt deze stationaire fase in cultuur 25. De fase-draaing fenotype vertegenwoordigt de tekort aan nutriënten die tijdens intracellulaire groei en wordt geïllustreerd door middel van montage van flagella voor motiliteit 26. Omdat L. pneumophila is meer invasiesieve en virulente wanneer geoogst van protozoaire cellen, zochten we naar een test waarmee meer getrouw de pathogene toestand van de bacterie vertegenwoordigde toen het geconfronteerd gastheer macrofagen ontwikkelen. Hiervoor hebben we een veelzijdige protozoa priming assay dat geschikte gastheer voor zowel de eerste (priming cel) en tweede (doelcel) fase infecties geschikt. De infectie proces tractable door gebruik van bacteriën die stabiel green fluorescent protein (GFP). De infectie model voor de protozoaire Acanthamoebacastellanii volgt een methode op grote schaal gebruikt op het gebied 27. De aanzuiging stap L. pneumophila stammen worden gekweekt in vitro naar stationaire fase in vloeibare media als &#39;doorlatende&#39; bacteriën (Figuur 1A) produceren. Bacteriën worden vervolgens gebruikt om monolagen van A. infecteren castellanii gedurende 18 uur op een laat stadium van de intracellulaire levenscyclus te bereiken. Grote vacuolen bevattenbacteriën te kunnen gevisualiseerd op dit tijdstip met fluorescentiemicroscopie (Figuur 1A). Protozoa cellen worden daarna gelyseerd en bacteriën gewonnen uit het lysaat worden gemeten emissie bij 512 nm met een fluorescentie-plaatlezer. Fluorescentie wordt gecorreleerd met optische dichtheid veelvoud-van-infectie (MOI) te berekenen voor de infectie van doelcellen (figuur 1 * Correlatie Curve). Na invasie (T 0) en 18 uur post-invasie (T 18), zijn doelcellen gekwantificeerd voor fluorescentie, wat neerkomt op intracellulaire bacteriën. Fluorescentie kan worden gevolgd door microscopie en flowcytometrie, en levensvatbare tellingen kan worden gemeten door kolonie plating. De priming test wordt altijd begeleid door infecties met wild-type L. pneumophila en een stam defect in de Dot / Icm type IV secretiesysteem (Δ DOTA) (Figuur 1A). Dit biedt vooral interne controles voor directe vergelijkingen tussen wild-type eennd elke mutant isogene stammen die in het infectieproces. De opname van de avirulente stam Δ DOTA tijdens het vullen decors een drempelwaarde voor waarneming van verzwakte groei fenotypen geassocieerd met isogene mutanten die worden gekweekt in vitro.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagens</td></tr><tr><td>chloramfenicol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td>antibioticum</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755-10</td><td></td></tr><tr><td>ACES</td><td>Sigma</td><td>A9758-1KG</td><td>mediacomponent</td></tr><tr><td>ATCC medium: 712 PYG</td><td>ATCC</td><td></td><td>groeimedia voor protozoa</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30256FS</td><td>fosfaat gebufferde zoutoplossing</td></tr><tr><td>geactiveerde kool</td><td>Fisher Scientific</td><td>C272-212</td><td>mediacomponent</td></tr><tr><td>gistextract</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-500</td><td>mediacomponent</td></tr><tr><td>pepton</td><td>BD Diagnostics</td><td>211677</td><td>mediacomponent</td></tr><tr><td>agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-2</td><td>mediacomponent</td></tr><tr><td>L-cysteïne, 99%+</td><td>Acros organics</td><td>173601000</td><td>mediasupplement</td></tr><tr><td>Ferric nitrate nonahydraat</td><td>Fisher Scientific</td><td>I110-100</td><td>mediasupplement</td></tr><tr><td colspan="4">Apparatuur</td></tr><tr><td>EVOS fl</td><td>AMG</td><td>EVOS fl</td><td>fluorescentiemicroscoop</td></tr><tr><td>Smart Spec Plus</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>spectrofotometer</td></tr><tr><td>5810 R centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>22627023</td><td>tafelcentrifuge</td></tr><tr><td>Repeater plus</td><td>Eppendorf</td><td>22230201</td><td>herhalende pipet</td></tr><tr><td>SpectraMax Gemini EM</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>microplaatlezer</td></tr><tr><td>Softmax Pro 5.3</td><td>Molecular Devices</td><td>0200-310</td><td>software voor microplaatlezer</td></tr><tr><td>5424 microfuge</td><td>Eppendorf</td><td>22620401</td><td>tafel microcentrifuge</td></tr><tr><td>Fast-release pipette pomp II</td><td>Scienceware</td><td>379111010</td><td>pipet hulpmiddel</td></tr><tr><td>FACS Calibur</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td>flowcytometer</td></tr><tr><td>FlowJo 7.6.1</td><td>FlowJo</td><td>licentie</td><td>flowcytometriesoftware</td></tr><tr><td>15 ml buis</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>polypropyleen conische buis</td></tr><tr><td>1,6 ml microfuge buis</td><td>Neptune</td><td>3745.X</td><td>microcentrifugebuizen</td></tr></tbody></table>

handelbaar mammalian cell infecties met protozoan-geprimed bacteriën

Tractable Mammalian Cell Infections with Protozoan-primed Bacteria

Vele intracellulaire bacteriële pathogenen gebruiken zoetwater protozoa als natuurlijke reservoir tot proliferatie in het milieu. Legionella pneumophila, de veroorzaker van de veteranenziekte longontsteking, krijgt een pathogeen ten opzichte van in vitro gekweekte bacteriën bij eerste geoogst protozoa cellen voor infectie van zoogdierlijke macrofagen. Dit suggereert dat belangrijke virulentiefactoren niet goed worden uitgedrukt in vitro. We hebben een handelbaar systeem voor priming L. pneumophila door haar natuurlijke protozoaire gastheer Acanthamoebacastellanii voorafgaand aan zoogdiercellen infectie. De bijdrage van elke virulentiefactor kan worden onderzocht door het vergelijken van intracellulaire groei van een mutant stam met wildtype bacteriën na priming protozoa. GFP-expressie wild-type en mutant L. pneumophila stammen worden gebruikt om protozoa monolagen infecteren in een priming stap en men late stadia van intracellulaire groei bereiken. Fluorescerende bacteriën worden geoogst van deze geïnfecteerde cellen en genormaliseerd door spectrofotometrie vergelijkbare aantallen bacteriën voor een volgende infectie in zoogdierlijke macrofagen genereren. Voor de kwantificering worden levende bacteriën gecontroleerd na infectie met fluorescentie microscopie, flowcytometrie en door kolonie plating. Deze techniek belicht en vertrouwt op de bijdrage van gastheercel-afhankelijke genexpressie door het nabootsen van de omgeving die zou worden aangetroffen in een natuurlijke acquisitie route. Deze benadering kan worden gewijzigd om een ​​bacterie die een intermediaire gastheer gebruikt als een middel voor het verkrijgen van een pathogene voordeel bieden.

Een typisch resultaat voor het gehele infectie wordt beschreven in figuur 1. Live cell fluorescentie microfoto beeltenis van monolagen van A.castellanii geïnfecteerd met wild-type L. pneumophila tijdens het vullen fase is weergegeven in figuur 1A. Een succesvolle maatregel van de priming stap leidt tot een populatie van ongeveer 90% van de gastheercellen die grote vacuolen gevuld met GFP gemerkte bacteriën bij deze MOI. Op 18 uur na infectie meeste A. castellanii</...

Deze techniek verschaft een werkwijze te oogsten, normaliseren en kwantificeren intracellulaire groei van bacteriële pathogenen die vooraf gekweekt in natuurlijke protozoa gastheercellen voor infecties van zoogdiercellen. Deze methode kan worden aangepast aan een grote verscheidenheid van gastheercellen voor de priming podium en doelcel types tegemoet.

Handelbaar Mammalian Cell Infecties met Protozoan-geprimed Bacteriën

Many intracellular bacterial pathogens use freshwater protozoans as a natural reservoir for proliferation in the environment. Legionella pneumophila, the ...

Het algemene doel van deze procedure is het oogsten en kwantificeren van fluorescent bijhoudbare bacteriën uit een intermediaire gastheer voor de daaropvolgende infectie van zoogdiergastheercellen. Hier worden Legionella mala die GFP tot expressie brengen, gebruikt om de natuurlijke gastheer protozoën, monoculturen van de amebe castellani, te infecteren. De L. mala worden vervolgens geoogst door middel van selectieve lysis en de concentratie bacteriën wordt daarna berekend met een formule gebaseerd op de fluorescentie-emissie verdunning van de protozoën.Geprimde bacteriën worden vervolgens gebruikt om monolares mammalian cellmonolagen te infecteren. Ten slotte wordt het aantal infectieuze bacteriën in de mammalian cellen bepaald met een combinatie van fluorescentiemicroscopie, flowcytometrie en het uitplaten van lysaten om colony forming units te recupereren. De resulterende gegevens tonen een pathogeen voordeel aan voor de bacteriën die in de priming-fase in protozoaire cellen zijn gekweekt, in vergelijking met dezelfde stam die in een kunstmatig medium is gekweekt.We hebben deze techniek ontwikkeld naar aanleiding van de waarneming dat de expressie van specifieke virulentiefactor

tractable-mammalian-cell-infections-with-protozoan-primed-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Toxoplasma gondii wordt omgezet in een cyste formulier in reactie op belasting van het milieu, die kunnen worden nagebootst in weefselkweek modellen. Deze video demonstreert technieken om cyste wand vorming van onderzoeken door het activeren van beenmerg afgeleide macrofagen of het wijzigen van groeimedium pH in fibroblast cellen.

Toxoplasma gondii Cyste muur Vorming in actieve beenmerg afgeleide Macrofagen en Bradyzoite voorwaarden

Genetische kruisen van knaagdieren malariaparasieten worden uitgevoerd door het voeren van twee genetisch verschillende parasieten aan muggen. Recombinant nakomelingen zijn gekloond van muizen bloed na waardoor muggen om geïnfecteerde muizen bijten. Deze video laat zien hoe de productie van genetisch kruisen...

Protocol voor de productie van een genetische Kruis van het knaagdieren malariaparasieten

Hier beschrijven we een werkwijze voor het gebruik van type I en type...

Genetische Manipulatie in<em&gt; Δku80</em&gt; Stammen voor Functionele genomische analyse van<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Met dit protocol, konden we beeld 160 pm dikke hersencoupes van muizen geïnfecteerd met de parasiet Toxoplasma gondii, die visualisatie en analyse van de ruimtelijke relatie tussen de encysting parasiet besmette neuron maakt.

3-D Imaging en Analyse van Neuronen Infected In Vivo Met Toxoplasma gondii

Prion-achtige verspreiding van eiwitaggregaten is recent naar voren gekomen als een factor die bij veel neurodegeneratieve ziekten betrokken is. Het doel van dit protocol is om te beschrijven hoe de rondworm C. elegans als modelsysteem kan worden gebruikt om eiwitverspreiding te volgen en prion-achtige fenomenen te onderzoeken.

Onderzoek naar de verspreiding en de toxiciteit van Prion-achtige eiwitten met behulp van de Metazoan modelorganisme<em&gt; C. elegans</em

Hier een protocol wordt bacteriële capture meten door CD4 + T-cellen die tijdens antigeenpresentatie via transinfection van pre-geïnfecteerde dendritische cellen (DC). We zien hoe de noodzakelijke stappen uit te voeren: het isoleren van primaire cellen, infectie van DC, DC / T-cel conjugaat vorming, en meting van bacteriële T celtransfectie.

T-cellen Capture Bacteriën door Transinfection van dendritische cellen

Hier hebben we een methode om stabiele transfection van kip Eimeria parasieten te bereiken door nucleofecting sporozoites of tweede generatie merozoiten. Genetisch gemodificeerde eimerian parasieten die heterologe antigene genen uitdrukken, kunnen worden gebruikt als vaccinleveringsvoertuigen.

Nucleofection en in Vivo propagatie van kippeneimeria parasieten

Het algemene doel van dit protocol is om te instrueren hoe te extraheren, te onderhouden, en scheiden murine astrocyt en microglia cellen uit het centrale zenuwstelsel, gevolgd door infectie met protozoa parasieten.

Gelijktijdige isolatie van primaire astrocyten en Microglia voor Protozoa-parasietinfectie

Malaria wordt overgedragen door inoculatie van het sporozoietstadium van Plasmodium door geïnfecteerde muggen. Transgeen Plasmodium heeft ons in staat gesteld de biologie van malaria beter te begrijpen en heeft rechtstreeks bijgedragen aan de ontwikkeling van malariavaccins. Hier beschrijven we een gestroomlijnde methodologie om transgene Plasmodium berghei sporozoïeten te genereren.

Genereren van genetisch gemodificeerde Plasmodium berghei Sporozoïeten

Dit protocol beschrijft een methodologie om Naegleria gruberi trofozoïeten te transfecteren met een construct dat wordt gehandhaafd tijdens het passeren van trofozoïeten in vitro, evenals door encystment en excystment.

Transfectie van een moleculaire kloon van Naegleria gruberi rDNA in N. gruberi Trophozoïeten

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het ontwerpen, bouwen en leveren van tetracycline-gecontroleerde geïnduceerbare synthetische schakelingen. Het effect van de synthetische circuits op de eliminatie van parasieten en de expressie van cytokines kan worden bestudeerd door de gepresenteerde pijplijn te kanaliseren. Dit protocol is relevant voor onderzoekers die op synthetische circuits gebaseerde therapieën bestuderen bij infectieziekten.

Immunometabole circuits bij infectie voor het bevorderen van gastheergerichte therapieën

Leer hoe je bacteriën uit protozoaire gastheren oogst en kwantificeert voor infectie van zoogdiercellen. Deze methode gebruikt Legionella mala en GFP-fluorescentie om pathogeniteit nauwkeurig te meten.

Handelbaar Mammalian Cell Infecties met Protozoan-geprimed Bacteriën

Meer video's verkennen