Direct Imaging van ER Calcium met Targeted-esterase-Induced Dye Loading (TED)

Het algemene doel van het volgende experiment is om calciumdynamiek direct in het lumen van het endoplasmatisch reticulum van levende cellen te visualiseren. Dit wordt bereikt door de cellen te transduceren met de targeted esterase geïnduceerde kleurstof of TED-vectorconstructie om carboxy-esterase CS twee in het endoplasmatisch reticulum over te expresseren. Vervolgens worden de cellen geïncubeerd met de aceto methyl ester calciumindicator flu oh vijf NA, die diffundeert door de plasma- en ER-membranen.

Vervolgens scheidt de carboxylesterase. De estergroep geeft de calciumgevoelige indicator in het er vrij. Lumen en fluorescente calciumcomplexen worden gevormd.

Er worden resultaten verkregen die veranderingen in vrije calciumconcentratie in het ER tonen op basis van beeldvorming van levende cellen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden over de regulatie van cellulaire calciumhomeostase. Calciumsignalen worden het meest frequent gemonitord in het cytosol, daarom kan het niet gemakkelijk worden onderscheiden waar het calcium stroomt in het cytosol vanuit de extracellulaire ruimte of vanuit de intracellulaire ER-calciumopslag.

Om deze beperking te overwinnen, hebben we targeted esterase geïnduceerde download ontwikkeld. Met deze methode wordt calcium dat uit het ER wordt vrijgegeven direct gemonitord. De aanpak is niet-storend.

Het plasmamembraan blijft intact en intracellulaire signaalcascades worden bewaard. Over het algemeen zal een n tous methode het moeilijk hebben omdat ze ervaring nodig hebben. In TED-vectorexpressie hebben we vectorconstructies ontwikkeld die een cent-eiwit fuseren met de Carboxylase CES twee.

Dit stelt ons in staat om tijdens de experimenten gemakkelijk cellen te identificeren die geschikt zijn voor AR-calciumbeeldvorming, wat cellen zijn die worden gekenmerkt door sterke rode fluorescentie en alleen matige tot sterke calciumindicatorfluorescentie. Deze fluorescente labels moeten gelijkmatig verdeeld zijn door het endoplasmatisch reticulum en afwezig zijn in het nucleaire gebied. Voor het begin.

Bereid kunstmatige cerebrale spinale vloeistof of A CSF en flu oh vijf NAM volgens het tekstprotocol. Verwarm de A CSF voor tot kamertemperatuur en voeg diep glucose toe aereer de A CSF gedurende vijf minuten met carbogen. Voeg vervolgens een molaira oplossing van calciumchloride en magnesiumchloride toe aan een eindconcentratie van twee millimolar elk.

Na het starten van de microscoop voor levend beeld en computerprogramma, begint u met de perfusie op een dummy-beeldvormingskamer en balanceer het buissysteem verwarm de inline-oplossingsverwarmer en de beeldvormingskamer op de microscooptafel en balanceer het systeem naar 32 tot 37 graden Celsius. Voordat u begint met de downloadprocedure om kleurstof in cellen te laden, voegt u 100 microliter voorverwarmde A CSF toe aan één 0,5 microliter aliquot van vijf millimolar flu oh vijf NAM, en maakt u de oplossing op in een waterbad gedurende 90 seconden. Breng 400 microliter voorverwarmde beeldvormingsoplossing over naar één putje van een vier- of 24-putjesplaat. Voeg de D-oplossing toe aan dezelfde put om 500 microliter van een vijf micromolar oplossing te produceren.

Plaats vervolgens voorzichtig een dekglas met cellen in de putje en incubeer gedurende een geschikte periode In een celkweekincubator bij 37 graden Celsius DI-belastingtijd en D-concentratie zijn afhankelijk van het celtype, celdichtheid en de specifieke behoeften van experimenten. Lange incubatietijden kunnen de cellen beschadigen, vooral primaire nuance en gliacellen, en dit is cruciaal voor de responsiviteit op fysiologische stimuli. Incubatie van meer dan 30 minuten is alleen nuttig voor ER-calciumlokalisatie-experimenten om de verdeling van ER-calcium in kleine microdomeinen te onderzoeken, bijvoorbeeld MUÉs van stekels Onmiddellijk na de incubatie brengt u het dekglas over naar een ander celkweekputje met beeldvormingsoplossing.

Gebruik om voor te bereiden op het monteren van de cellen in de beeldvormingskamer een penseel om hoogvacuümvet op de beeldvormingskamer aan te brengen. We gebruiken zelfgemaakte beeldvormingskamers voor 10 tot 12 millimeter dekglasjes met een klein volume, waardoor hoge perfusiesnelheden mogelijk zijn tot 15 keer bufferuitwisseling per minuut. Neem het dekglas met de flu oh vijf en geladen cellen op en voeg een kleine druppel beeldvormingsoplossing toe om het nat te houden.

Keer vervolgens het dekglas ondersteboven en monteer de cellen in de beeldvormingskamer. Gebruik een wattenstaafje om het dekglas in de siliconenlijm te drukken en om resterende buffer van de onderkant van het glazen dekglas weg te vegen. Vervolgens verwisselt u de dummy-beeldvormingskamer met de experimentele beeldvormingskamer.

Was de cellen vijf tot 10 minuten door continue perfusie voor celselectie. Gebruik een minimale hoeveelheid laserverlichting om snel fotobleken van flu oh vijf en calcium twee in de er te voorkomen, een hoge scanfrequentie van twee tot vier hertz, een kleine beeldafmeting en een hoge versterking ingesteld aan de microscoop. Volgens het plantexperiment.

Aan het begin van het experiment, documenteert u de cellulaire verdeling van de flu oh vijf en calciumlabel en het rode fluorescente label van de rode carbox cel esteraseconstructie. In uw cel van belang hier, representatieve neuronen door hoog resolutie X, YZ-beeldstacks voer XYT-beeldvorming uit om ER-calciumdynamiek te monitoren onder specifieke experimentele omstandigheden. Typische instellingen voor ons systeem staan vermeld in tabel twee van het tekstprotocol. Monitor veranderingen in ER-calcium onder continue perfusie met beeldvormingsoplossing bufferuitwisselingssnelheden zijn 1,5 milliliter per minuut voor celwassen en opslaguitputting door het blokkeren van het sarco-endoplasmatisch reticulum calcium twee a TPA's en drie milliliter per minuut voor stimulatie door a TP en DHPG en agonist voor de metabotropische glutamatereceptor.

Hier worden gliacellen gestimuleerd met 200 micromolar A TP gedurende 10 seconden. Om de afbeeldingen te verwerken, opent u de beeldstack in het Image J-programma voor meerkleurig beeld. Splits de RBG-kanalen wanneer de software hierom vraagt.

Identificeer de interessegebieden. Teken afhankelijk van het doel interessegebieden rond het complete ER of kleine gebieden van de er. Gebruik de time series analyzer-plugin om de gemiddelde