Name: Real-time beeldvorming van heterotypische Bloedplaatjes-neutrofiele Interacties op het geactiveerd endotheel tijdens vasculaire ontsteking en trombose in Live Muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Leer real-time fluorescentie-intravital-microscopie voor vasculaire ontsteking en trombose bij levende muizen. Deze methode visualiseert bloedplaatjes-neutrofiele interacties op geactiveerd endotheel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (P30 HL101302 en RO1 HL109439 naar JC) en de American Heart Association (SDG 5270005 naar JC). A. Barazia werd ondersteund door een T32HL007829 NIH training subsidie.

1. Bereiding van intravitale microscoop (Figuur 1A) <ol><li> Bereid superfusie buffer (125 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 en 17 mM NaHCO3, pH 7,4). </li><li> Zet een circulatoire waterbad temperatuur van buffer en een thermo-gecontroleerde deken te handhaven op 37 ° C. Beluchten buffer met stikstofgas (5% CO2 evenwicht met stikstof). </li><li> Zet de microscoop systeem (Sutter Lambda DG-4 hoge snelheid golflengte-wisselaar, werkstation, Olympus BX61W microscoop, MPC-200 multi-manipulator, ROE-200 stage controller, high speed camera, en versterker). </li><li> Voor de vasculaire ontsteking model, gebruik maken van een 100% dichroïsche spiegel. Trombose induceren door laser schade vervangen 100% spiegel met een 50/50% spiegel en zet een Micropoint laserablatie systeem. </li></ol> 2. Bereiding van Cremaster Muscle voor intravitale microscopie (figuur 1B) <ol><li> Verdoven van eenmannelijke muizen (6-8 weken oud, C57BL / 6) door ip injectie van ketamine (125 mg / kg lichaamsgewicht (BW)) en xylazine (12,5 mg / kg BW). De Universiteit van Illinois Institutionele Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd alle dierlijke zorg en experimentele procedures. Een inflammatoire model injecteren murine TNF-α (0,5 ug in 250 pl zoutoplossing) in een muis intrascrotally 3 uur voorafgaand aan beeldvorming (2-2,5 uur voorafgaand aan de operatie). </li><li> Plaats de muis op een thermo-gecontroleerde deken bij 37 ° C op een intravitale microscoop lade. </li><li> Trek de huid op het oppervlak van de nek met behulp van een tang en insnijden horizontaal de middellijn van het nekvel tot 1 cm met een schaar. </li><li> Open voorzichtig de cervicale spieren met behulp van stompe schaar en verwijder de spieren rond de luchtpijp. </li><li> Canule een PE90 buis in de luchtpijp om de ademhaling te moeilijk te elimineren. </li><li> Verwijder de linkerkant van cervicale spier en isoleren de halsader van de omringende weefsels. </li><li> C Annulaat een PE10 tube in de linker halsader voor infusie van antilichamen en extra verdoving. </li><li> Verwijder voorzichtig en horizontaal insnijden van de scrotum huid. Om weefsel integriteit gedurende het experiment te houden, werd voorverwarmde buffer superfused over het chirurgische veld. </li><li> Druk op de onderbuik met een pincet en trek voorzichtig een testikel met de andere pincet. </li><li> Verwijder het omringende bindweefsel rond de testis. </li><li> Verticaal Incise de cremaster spier en plat de spier over een glazen dekglaasje op een intravitale microscoop lade door pinning de periferie. </li><li> Laat 10-20 minuten voor de spier om voorafgaand aan de verzameling van gegevens te stabiliseren. Cremaster spierarteriolen (voor trombusvorming) en venules (voor vasculaire ontsteking) met een diameter van 30-45 urn werden gekozen voor de studie. </li><li> Aan anesthesie te onderhouden, giet 30-50 ml van dezelfde verdoving ongeveer elke 30 min door de halsader cannulus. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Intravitale microscopie voor TNF-α-geïnduceerde vasculaire ontsteking <ol><li> Na het plaatsen van de muis op de intravitale microscoop, open SlideBook 5.0-software en klik op &quot;Focus Window&quot; op de menubalk om de juiste optiek en doelstelling (60X) in te stellen. </li><li> Infundeer Dylight 488-geconjugeerd rat anti-muis CD42c (0,1 ug / g BW in 100 ul zoutoplossing) en Alexa Fluor 647-geconjugeerd rat anti-muis Gr-1-antilichamen (0,05 ug / g BW in 100 ul zoutoplossing) via een jugulaire cannulus . </li><li> Ga naar de menubalk, en klik op &quot;Beeld vastleggen&quot; op de werkbalk. </li><li> Een nieuw menu zal verschijnen; In &quot;Image&quot;, selecteer &quot;Bin Factor&quot; als 1x1 en selecteer &quot;640&quot; van de breedte en &quot;460&quot; op de hoogte. </li><li> In &quot;Filter Set&quot;, markeert u het selectievakje voor de kanalen die u wilt blootstellen en stel de belichtingstijd voor elk. Bijvoorbeeld, open kanaal: 10 ms, FITC-kanaal: 50 msec, en Cy5 kanaal: 50 msec. </li><li> Selecteer &quot;Time-Lapse Capture&quot; om het aantal tijdstippen en aan te passen. For de ontsteking model, wordt het aantal tijdstippen op 1000-1500 met een interval van 200 msec (totale verstreken tijd: 5 min). </li><li> Klik op &quot;Test&quot; om een ​​single-plane afbeelding te zien op de opgegeven belichtingstijd voor dat kanaal. Pas belichtingstijd en / of microscoop licht totdat het histogram een ​​adequate intensiteitsverdeling (Voor multi-channel capture, herhaal dit proces voor elk kanaal) toont. </li><li> Zodra alle parameters zijn ingesteld (kanalen, belichtingstijden, enzovoort) in het &quot;Beeld vastleggen&quot;, selecteer &quot;Start&quot; om het vastleggen te beginnen. </li><li> Monitor rollen en aanhanger bloedplaatjes en neutrofielen gedurende 5 min in de bovenste helft van een ontstoken cremaster venule in de vasculaire ontsteking model. Acht tot tien verschillende venulen worden opgenomen in een muis. </li><li> Beelden werden genomen met een totale vergroting van 60x (1,0 NA water immersie objectief) die een venstergrootte van 157 um x 118 um. </li><li> Na voltooiing van het experiment werden de muizen gedood via cervicale dislocation. </li></ol> 4. Data Analyse voor de venulaire Ontsteking Model <ol><li> Open SlideBook 5.0-software en klik op &quot;Map&quot; in de menubalk om een ​​bestand te openen. </li><li> Klik op het drop-down menu Kanaal en selecteer &quot;Open, FITC, Cy5, enz.&quot; </li><li> Klik op &quot;renormalize (rood en groene balken)&quot; en selecteer het kanaal. Sleep de rode en groene balken naar links of rechts tot ongeveer optimaliseren fluorescentiesignaal. </li><li> Klik op &quot;Apply&quot; en &quot;OK&quot; om het beeld bij te werken. </li><li> Klik op &quot;Thumbnail Button&quot; om de huidige weergave als standaard te selecteren. </li><li> Speel gevangen Timelapse beeld, en tel rollen en aanhanger neutrofielen gedurende de periode van 5 minuten. </li><li> Om bloedplaatjes trombusvorming te analyseren, ga naar &quot;Mask&quot; en selecteer &quot;Create&quot;. </li><li> Noem een ​​masker en markering &quot;In het huidige beeld&quot;. </li><li> Klik op &quot;Large potloodpictogram&quot; in &quot;Marquee Tool&quot; in de hoofdweergave. </li><li> Kleur een gebied buiten het schip in de hoofdweergave opslaan om een ​​achtergrond masker in te stellen. </li><li> Ga to &quot;Mask&quot;, klik op &quot;Kopieer dit vliegtuig&quot;, &quot;Kopiëren masker in de huidige tijdpunt&quot; en selecteer &quot;Alle tijdstippen&quot;, en klik op &quot;OK&quot;. </li><li> Om achtergrondsignaal te berekenen, gaat u naar &quot;Statistieken&quot; en klik op &quot;Mask Statistieken&quot;. </li><li> Klik op &quot;Huidige 2D Time Lapse of 4D Image (s)&quot; in Afbeelding Scope, en selecteer &quot;Volledige Mask&quot; in Mask Scope. In Features, selecteert u &quot;Verstreken tijd (uu: mm: ms)&quot; onder Data Capture, selecteert u &quot;Area (pixels)&quot; onder morfometrie, &quot;Maximum Intensity&quot; onder Intensiteit, en klik op &quot;Export&quot; (Deze statistiek methode stelt ons in staat om berekenen auto-fluorescentie-intensiteit (achtergrond signaal)). </li><li> Open het tekstbestand in MS Office Excel en bereken de gemiddelde waarde van de achtergrond signaal gedurende de registratieperiode. Dit is de achtergrond fluorescentie-intensiteit. </li><li> Om trombus intensiteit vast te stellen, klikt u op &quot;Large potloodpictogram&quot; weer in de &quot;Marquee Tool&quot; in de hoofdweergave. </li><li> Kleur in het vat in de hoofdweergave van de bloedplaatjes-signaal in te stellen. </li><li> Ga naar &quot;Mask&quot;, klik op &quot;Kopieer dit vliegtuig&quot;, &quot;Kopiëren masker in de huidige tijdpunt&quot; klikt, selecteert u &quot;Alle tijdstippen&quot;, en klik op &quot;OK&quot;. </li><li> Ga naar &quot;Statistieken&quot; en klik op &quot;Mask Statistieken&quot;. </li><li> Klik op &quot;Huidige 2D Time Lapse of 4D Image (s)&quot; in Afbeelding Scope, en selecteer &quot;Volledige Mask&quot; in Mask Scope. In Features, selecteert u &quot;Verstreken tijd (uu: mm: ms)&quot; onder Data Capture, selecteert u &quot;Area (pixels)&quot; onder morfometrie, selecteer &quot;Som Intensity&quot; onder Intensiteit, en klik op &quot;Export&quot; (Deze statistiek methode ons in staat stellen berekenen de fluorescentie-intensiteit in het vat). </li><li> Open het tekstbestand in MS Office Excel. Fluorescentiepiek van bloedplaatjes wordt berekend door de gemiddelde waarde van x achtergrondintensiteit Area (pixel) van de som intensiteit van het inwendige van het schip. Dit is de fluorescentie-intensiteit van de bloedplaatjes thrombus. </li><li> Herhaal deze in 30 verschillende venules 3-5 verschillende muizen. Vervolgens berekent gemiddelde waarde van de fluorescentiesterkte van bloedplaatjes. </li><li> Naarhet analyseren van de neutrofiele rollen en adhesie, werd de rollende instroom van neutrofielen bepaald over 5 min in elke venule en gepresenteerd als het aantal cellen per minuut. Het aantal adherente neutrofielen die waren stationair&gt; 30 sec en langzaam kroop (&lt;10 pm meer dan 30 seconden), maar niet omrollen, werden geteld en weergegeven als het aantal cellen per 5 minuten. </li></ol> 5. Intravitale microscopie voor Laser-induced arteriolaire trombose 5-1 Kalibratie van ablatie laser <ol><li> Plaats een gespiegelde dia op microscoop podium, breng een kleine druppel gedestilleerd water tot de bovenkant van de glijbaan, en pas de intensiteit en scherpstellen met de oculair. </li><li> Open &quot;Focus Window&quot; en selecteer de &quot;FRAP&quot; tab in SlideBook 5.0 software. </li><li> Zet de laser vermogen bij 40-50, en stel beide &quot;Dubbelklik herhalingen&quot; en &quot;Dubbelklik size&quot; tot 8. Markeer op de &quot;Guide&quot; box te brengen tot een set van dradenkruis. </li><li> Selecteer de &quot;Pijl&quot; icoon van de taakbalk on de bovenkant van het scherm. </li><li> Onder de &quot;FRAP Uitlijning&quot; tab, klik op &quot;Fire next&quot;. Een klein plekje moeten verschijnen bij de linker benedenhoek van de monitor. Zodra de vlek verschijnt, dubbelklikt u op het midden van het. Wanneer u hierop klikt, moet een andere plek boven verschijnen en aan de rechterkant van de eerste plek; dubbelklik op het. Herhaal dit voor 16 punten (de 16 e plek verschijnt in de rechter benedenhoek.) Klik op &quot;Opslaan&quot; wanneer u klaar bent om de kalibratie parameters bij te werken. </li><li> Om de nauwkeurigheid van de kalibratie te testen, klikt u op de &quot;Center&quot; knop-een klein plekje moet worden weergegeven in het midden van het scherm. Zo niet, herhaal de kalibratie tot de gewenste nauwkeurigheid is bereikt. </li></ol> 5-2 Laser-induced arteriolaire trombusvorming <ol><li> Plaats een verdoofde muis (zie procedure van 2-2 tot 2-12) op de microscoop podium. </li><li> Onder de &quot;Capture&quot; venster, selecteer een protocol of een nieuwe maken. De standen zijn als volgt: CY5 (70 msec blootstelling), Open (10 MSEc belichting) en FITC (50 msec blootstelling). Opname wordt gemaakt dan 20 minuten (ongeveer 2.400 tijdstippen met een interval van 500 msec). </li><li> Infundeer Dylight 488-geconjugeerd anti-muis CD42c en Alexa Fluor 647-geconjugeerd anti-muis Gr-1 antilichamen zoals hierboven beschreven. </li><li> Optimaliseer microscoop parameters, inclusief fluorescentie-intensiteit en helderveld beeld zoals beschreven in 3-3 om 3-7. </li><li> Klik op de knop &quot;Test&quot; om een ​​goede helderveld intensiteit of antilichaam-signaal, arteriole plaatsing en scherpstelling. </li><li> Klik op &quot;Start&quot; om het beeld vast te leggen op gang te brengen. </li><li> Voor de ontploffing de ablatie laser, zorg ervoor dat de muisaanwijzer icoon is geselecteerd en dat de vaatwand is in duidelijke focus. </li><li> Om de laser schieten, dubbelklikt u op een plek twee tot drie micrometer intern vanaf de vaatwand. Beschadiging van de arteriolaire endotheelcellen veroorzaakt een visueel vormverandering dat moet duidelijk zijn in het helder veldbeeld, gevolgd door bloedplaatjes accumulatie. Monitor trombusvorming gedurende 5 minuten na de laser letsel. </li><li> Vijf minuten na de laser letsel (de trombus omvang moet nu stabiel) pauzeren en annuleren de vangst. Vervolgens start een capture met 2400 tijdstippen met een interval 500 msec adherente bloedplaatjes, voortschrijdend / hechtende neutrofielen opgenomen gedurende 20 minuten. Drie tot vijf arterioles worden in een muis. </li><li> Na voltooiing van het experiment werden de muizen gedood via cervicale dislocatie. </li></ol> 6. Data Analyse voor de arteriolaire Trombose Model <ol><li> Ga over de stappen 4.1 tot 4.5. </li><li> Als u de achtergrond fluorescentie-intensiteit te verkrijgen tijdens bloedplaatjes trombusvorming, gaan over de stappen 4,7 tot 4,14. </li><li> Ga naar &quot;Mask&quot;, klik op &quot;Segment&quot;, selecteer FITC in kanaal, en steek de gemiddelde waarde van de achtergrond signaal op Laag. Klik op &quot;Apply&quot; en &quot;OK&quot;. </li><li> Om de fluorescentie-intensiteit van bloedplaatjes thrombus (Dylight 488-geconjugeerd anti-CD42c antilichaam) analyseren </strong&gt; gaan over de stappen 4,18 tot 4,19. Aan het antilichaam signaal berekenen, &quot;Sum Intensity&quot; wordt afgetrokken door het achtergrondsignaal (&quot;Maximum Intensity&quot; x &quot;Area (pixels)&quot;). Dit is de fluorescentie-intensiteit van de bloedplaatjes thrombus. </li><li> Om de rollen en aanhanger neutrofielen kwantificeren, spelen de timelapse en tel het aantal cellen die zichtbaar rollen over de bloedplaatjes trombus meer dan 20 minuten. Rollen wordt gedefinieerd als een afname in neutrophil snelheid tijdens de interactie met de bloedplaatjes trombus minstens 2 sec. Hechtende neutrofielen worden gedefinieerd als neutrofielen die aan de bloedplaatjes trombus voor ten minste 2 minuten. Het aantal rollen en aanhanger neutrofielen werd gepresenteerd als het aantal cellen per 20 minuten. Rolling snelheid werd berekend met behulp van een deeltje tracking systeem. </li></ol>

<ol><li>Wagner, D. D., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vessel+wall+and+its+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The vessel wall and its interactions.</a> Blood. 111, 5271-5281 (2008).</li>
<li>Nieswandt, B., Kleinschnitz, C., Stoll, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischaemic+stroke%3A+a+thrombo-inflammatory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ischaemic stroke: a thrombo-inflammatory disease.</a> J. Physiol. 589, 4115-4123 (2011).</li>
<li>Yang, J., Furie, B. C., Furie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+P-selectin+glycoprotein+ligand-1%3A+its+role+as+a+selectin+counterreceptor+in+leukocyte-endothelial+and+leukocyte-platelet+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">The biology of P-selectin glycoprotein ligand-1: its role as a selectin counterreceptor in leukocyte-endothelial and leukocyte-platelet interaction.</a> Thromb. Haemost. 81, 1-7 (1999).</li>
<li>Zarbock, A., Polanowska-Grabowska, R. K., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-neutrophil-interactions%3A+linking+hemostasis+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Platelet-neutrophil-interactions: linking hemostasis and inflammation.</a> Blood Rev. 21, 99-111 (2007).</li>
<li>Chen, J., Lopez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+platelets+with+subendothelium+and+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Interactions of platelets with subendothelium and endothelium.</a> Microcirculation. 12, 235-246 (2005).</li>
<li>Konstantopoulos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venous+levels+of+shear+support+neutrophil-platelet+adhesion+and+neutrophil+aggregation+in+blood+via+P-selectin+and+beta2-integrin%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Venous levels of shear support neutrophil-platelet adhesion and neutrophil aggregation in blood via P-selectin and beta2-integrin.</a> Circulation. 98, 873-882 (1998).</li>
<li>Maugeri, N., de Gaetano, G., Barbanti, M., Donati, M. B., Cerletti, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+platelet-polymorphonuclear+leukocyte+interactions%3A+new+clues+to+the+antithrombotic+properties+of+parnaparin%2C+a+low+molecular+weight+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Prevention of platelet-polymorphonuclear leukocyte interactions: new clues to the antithrombotic properties of parnaparin, a low molecular weight heparin.</a> Haematologica. 90, 833-839 (2005).</li>
<li>Hidalgo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotypic+interactions+enabled+by+polarized+neutrophil+microdomains+mediate+thromboinflammatory+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Heterotypic interactions enabled by polarized neutrophil microdomains mediate thromboinflammatory injury.</a> Nat. Med. 15, 384-391 (2009).</li>
<li>Cho, J., Furie, B. C., Coughlin, S. R., Furie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+extracellular+protein+disulfide+isomerase+during+thrombus+formation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A critical role for extracellular protein disulfide isomerase during thrombus formation in mice.</a> J. Clin. Invest. 118, 1123-1131 (2008).</li>
<li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+disulfide+isomerase+capture+during+thrombus+formation+in+vivo+depends+on+the+presence+of+beta3+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Protein disulfide isomerase capture during thrombus formation in vivo depends on the presence of beta3 integrins.</a> Blood. 120, 647-655 (2012).</li>
<li>Gross, P. L., Furie, B. C., Merrill-Skoloff, G., Chou, J., Furie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte-versus+microparticle-mediated+tissue+factor+transfer+during+arteriolar+thrombus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Leukocyte-versus microparticle-mediated tissue factor transfer during arteriolar thrombus development.</a> Journal of Leukocyte Biology. 78, 1318-1326 (2005).</li>
<li>Falati, S., Gross, P., Merrill-Skoloff, G., Furie, B. C., Furie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+in+vivo+imaging+of+platelets%2C+tissue+factor+and+fibrin+during+arterial+thrombus+formation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse.</a> Nat. Med. 8, 1175-1181 (2002).</li>
<li>Barthel, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha+1%2C3+fucosyltransferases+are+master+regulators+of+prostate+cancer+cell+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Alpha 1,3 fucosyltransferases are master regulators of prostate cancer cell trafficking.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19491-19496 (2009).</li>
<li>Trzpis, M., McLaughlin, P. M., de Leij, L. M., Harmsen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+adhesion+molecule%3A+more+than+a+carcinoma+marker+and+adhesion+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell adhesion molecule: more than a carcinoma marker and adhesion molecule.</a> The American Journal of Pathology. 171, 386-395 (2007).</li>
<li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317, 1767-1770 (2007).</li>
<li>Egan, C. E., Sukhumavasi, W., Bierly, A. L., Denkers, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+multiple+functions+of+Gr-1%28%2B%29+cell+subpopulations+during+microbial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunologic+Research%22%5BJournal%5D)">Understanding the multiple functions of Gr-1(+) cell subpopulations during microbial infection.</a> Immunologic Research. 40, 35-48 (2008).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financieel belang.

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor real-time fluorescentie intravitale microscopie heterotypische bloedplaatjes interacties op de neutrofiel geactiveerd endotheel visualiseren tijdens vasculaire ontsteking en trombose. Voorheen soortgelijke fluorescentiemicroscopische benaderingen werden gemeld aan het moleculaire mechanisme van trombusvorming en vasculaire ontsteking te bestuderen. 8,12 Sinds de heterotypische cel-cel interactie van belang kunnen zijn voor de vaso-occlusie van de schade site...

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10035-04-8</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>144-55-8</td><td></td></tr><tr><td>0,9% NaCl Saline</td><td>Hospira</td><td>0409-4888-10</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Hospira</td><td>0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Lloyd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intramedic Tubing (PE 90)</td><td>BD Diagnostics</td><td>427421</td><td></td></tr><tr><td>Intramedic Tubing (PE 10)</td><td>BD Diagnostics</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>Murine TNF-&alpha;</td><td>R&amp;D Systems</td><td>410-MT</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 488- gelabeld rat anti-muis CD42b-antilichaam </td><td>Emfret Analytics</td><td>X488</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-geconjugeerd anti-muis Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antilichaam</td><td>BioLegend</td><td>108418</td><td></td></tr><tr><td>NESLAB EX waterbad/circulator</td><td>Thermo-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX61W microscoop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TH4-100 Power</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lambda DG-4</td><td>Sutter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MPC-200 multi-manipulator</td><td>Sutter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R&#8211;-200 stage controller</td><td>Sutter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C9300 hogesnelheidscamera</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intensifier</td><td>Video Scope International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ablation Laser</td><td>Photonic Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SlideBook 5.0</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

real-time beeldvorming van heterotypische bloedplaatjes-neutrofiele interacties op het geactiveerd endotheel tijdens vasculaire ontsteking en trombose in live muizen

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interactie van geactiveerde bloedplaatjes en leukocyten (neutrofielen voornamelijk) op het geactiveerde endotheel bemiddelt trombose en vasculaire inflammatie. 1,2 Tijdens trombusvorming op de plaats van verwonding arteriolaire, bloedplaatjes adherent aan het geactiveerde endotheel en subendotheliale matrix eiwitten ondersteunen neutrofiel hechting walsen en 3. Omgekeerd, onder venulaire inflammatoire aandoeningen, kan neutrofielen aanhanger van de geactiveerde endotheel ondersteunen hechting en de accumulatie van circulerende bloedplaatjes. Heterotypische bloedplaatjes aggregatie neutrofiel heeft sequentiële processen die specifieke receptor-counter receptor interacties tussen cellen. 4 Het is bekend dat geactiveerde endotheelcellen adhesiemoleculen zoals von Willebrand factor los wordt geïnitieerd bloedplaatjesadhesie en accumulatie onder hoge afschuifkrachten. 5 Ook geactiveerde endotheelcellen ondersteunen neutrofiele rollen en adhesie met het uitspreken van selectines eend intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectievelijk onder lage afschuifkrachten. 4 Platelet P-selectine neutrofielen door interactie met P-selectine glycoproteïne-1 ligand (PSGL-1), en veroorzaakt daardoor activatie van neutrofielen β2 integrines en stevig hechting tussen twee celtypes. Ondanks de vooruitgang in in vitro experimenten waarin heterotypische bloedplaatjes neutrofiel interacties bepaald in volbloed of geïsoleerde cellen, 6,7 studies die niet manipuleren oxidant stress tijdens vasculaire ziekte. In dit verslag met fluorescentie-gemerkt, specifieke antilichamen tegen een muis bloedplaatjes en neutrofielen marker beschrijven we een gedetailleerde intravitale microscopische protocol heterotypische interactie van bloedplaatjes en neutrofielen op de geactiveerde endotheel volgen tijdens TNF-α-geïnduceerde ontsteking of na laser geïnduceerde letsel bij cremaster spier haarvaten van levende muizen.

Behulp van een gedetailleerde intravitale microscopie analyse heterotypische bloedplaatjes neutrophil interacties op het geactiveerde endotheel werden gevisualiseerd door infusie van fluorescent gelabelde antilichamen tegen bloedplaatjes (CD42c) of neutrofielen marker (Gr-1) in levende muizen. In een model van TNF-α-geïnduceerde ontsteking venulaire werden de meeste rollen neutrofielen stabiel gehecht aan het endotheel vermoedelijk door interactie van geactiveerde β2 integrinen met ICAM-1 ge...

Hier beschrijven we een experimentele techniek van fluorescentie intravitale microscopie heterotypische bloedplaatjes interacties op de neutrofiel geactiveerd endotheel visualiseren tijdens vasculaire inflammatie en trombose in levende muizen. Deze microscopische techniek waardevol zal zijn voor het moleculaire mechanisme van vasculaire ziekte te bestuderen en farmacologische middelen testen onder pathofysiologische omstandigheden.

Real-time beeldvorming van heterotypische Bloedplaatjes-neutrofiele Interacties op het geactiveerd endotheel tijdens vasculaire ontsteking en trombose in Live Muizen

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de typische interactie tussen bloedplaatjes en neutrofielen op het geactiveerde endotheel tijdens vaatziekten te visualiseren. Dit wordt bereikt door real-time fluorescentie intravitale microscopie in levende muizen om de microvasculatuur binnen de m. cremaster te visualiseren. Als tweede stap worden fluorescentie-gelabelde antilichamen geïnfundeerd en wordt vasculaire ontsteking of letsel geïnduceerd om directe visualisatie van de resulterende typische interacties tussen bloedplaatjes en neutrofielen te faciliteren.Vervolgens worden de opgeslagen gegevens geanalyseerd om het aantal cellen en hun dynamiek te kwantificeren. Uiteindelijk kunnen directe typische interacties tussen bloedplaatjes en neutrofielen op het geactiveerde endotheel worden beoordeeld op basis van het fluorescentiesignaal van de geïnfuseerde antilichamen via real-time intravitale microscopie. Onze intravitale microscopische techniek kan inzicht bieden in de real-time interacties tussen bloedplaatjes en neutrofielen op geactiveerd endotheel tijdens vasculaire inflammatie en trombusvorming.Deze technologie kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals het evalueren van de interacties tussen kankercellen en bloedcellen. Schakel vóór aanvang van het experiment het microscopiesysteem voor het vasculair inflammatiemodel in. Injecteer TNF alpha intra-growly drie uur vóór de IP-injectie van anesthetica.Zodra de sedatie is bevestigd door middel van een teenknijptest, wordt een PE 90-buisje in de trachea van de muis gecannuleerd om eventuele ademhalingsproblemen te voorkomen. Cannuleer vervolgens een PE 10-buisje in de linker vena jugularis voor de infusie van fluorescentie-gelabelde antilichamen en aanvullende anesthetica. Trek daarna voorzichtig de scrotale huid naar buiten, maak een horizontale incisie en spoel het operatieveld met voorverwarmde buffer.Druk nu met één pincet op de onderbuik en trek met de andere pincet voorzichtig een testikel naar buiten; snijd de musculus cremaster verticaal door en spreid de spier plat over een glaskaapglas op een microscopieplaatje in een intra-vial tray door het perifere weefsel aan het plaatje vast te pinnen. Begin deze stap door eerst DITE 4 88-geconjugeerde rat anti-muis CD 42 C- en Alexa floor 6 47-geconjugeerde anti-muis GR 1-antilichamen via de eerder geplaatste jugulaire canule toe te dienen. Vink vervolgens in de filterinstellingen van de microscoop de selectievakjes aan voor de kanalen die worden blootgesteld en stel de belichtingstijd voor elke geselecteerde time-lapse-opname in.Stel het aantal tijdspunten in op 1000 tot 1500 met een interval van 200 milliseconden voor een totale verstreken tijd van vijf minuten. Nadat alle parameters in de beeldopname zijn ingesteld, selecteer start om de opname te beginnen bij een 60 x vergroting met een venster van 157 micrometer bij 118 micrometer. Monitor de rollende en adherente bloedplaatjes in neutrofielen gedurende vijf minuten in het bovenste deel van een ontstoken cremaster-vene.Om de vorming van het bloedplaatjestrombus te analyseren, gaat u naar mask en selecteert u create. Klik vervolgens onder het marquee-instrument in het hoofdvenster op het grote potloodpictogram. Gebruik het potlood om een gebied buiten het vat in het hoofdvenster in te kleuren.Om een achtergrondmasker in te stellen, gaat u naar masker, klikt u op dit vlak kopiëren en klikt u op masker kopiëren. Selecteer bij het huidige tijdstip alle tijdstippen en klik op oké. Om het achtergrondsignaal te berekenen, gaat u naar statistieken en klikt u op maskerstatistieken.Klik vervolgens in de beeldscope op 'current 2D time-lapse', of op vier D-beelden in de maskerscope, en selecteer 'entire mask' bij de kenmerken. Selecteer onder 'date of capture' de optie 'elapse time'. Selecteer onder 'morph geometry' de optie 'area in pixels' en selecteer onder 'intensity' de optie 'maximum intensity'.Klik nu op export. Open het tekstbestand in een spreadsheetprogramma en bereken de gemiddelde waarde van het achtergrondsignaal gedurende de gehele opnameperiode om de achtergrondfluorescentie-intensiteit te bepalen.Nadat de achtergrondfluorescentie-intensiteit tijdens de bloedplaatjestrombose is berekend, zoals zojuist is aangetoond in het model voor vasculaire ontsteking, gaat u naar 'mask', klikt u op 'segment', selecteert u 'fit e' en 'channel', en voert u de gemiddelde waarde van het achtergrondsignaal in; klik vervolgens op 'apply' en 'okay'. Ga daarna naar 'statistics' en klik op 'mask statistics'. Klik nu in 'image scope' op 'current 2D time-lapse' of 'four D images'; selecteer in 'mask scope' 'entire mask', en selecteer onder 'features' bij 'date of capture' de optie 'elapsed time'. Selecteer onder 'morph geometry' de optie 'area in pixels' en selecteer onder 'intensity' de optie 'some intensity'.Klik vervolgens op exporteren. Open het tekstbestand in het spreadsheetprogramma en bereken de fluorescentie-intensiteit van de bloedplaatjestrombus. Voor de analyse van arteriolaire trombose begint u met het infuseren van DITE 4 88-geconjugeerde anti-muis CD 42 C- en ANDOR 6 47-geconjugeerde anti-muis GR one-antilichamen, zoals zojuist gedemonstreerd.Nadat u op start heeft geklikt om het proces van beeldvastlegging te initiëren, dubbelklikt u op een plek twee tot drie micrometers intern vanaf de vaatwand om de laser te activeren. De beschadiging van de arteriolaire endotheelcellen veroorzaakt een zichtbare vormverandering die duidelijk zou moeten zijn in het bright field-beeld, gevolgd door plaatjesaggregatie. Pauzeer en annuleer de vastlegging vijf minuten na de laserschade.Start vervolgens een opname met 2.400 tijdspunten met een interval van 500 milliseconden om de adherente bloedplaatjes en de rollende en adherente neutrofielen gedurende 20 minuten vast te leggen. Nadat de achtergrondfluorescentie-intensiteit tijdens de plaatjestrombus op een soortgelijke manier is berekend als in het ontstektingsmodel van de ular, gaat u naar mask, klikt u op segment, selecteert u fite en channel en voert u de gemiddelde waarde van het achtergrondsignaal in; klik vervolgens op apply en okay. Klik nu in image scope op current 2D time-lapse of 40 D images; selecteer in mask scope entire mask in features, selecteer onder date of capture elapsed time, selecteer onder Morpho area in pixels en selecteer onder intensity some intensity.Klik vervolgens op exporteren. Open het tekstbestand in het spreadsheetprogramma en bereken de fluorescentie-intensiteit van de bloedplaatjestrombus. Om de rollende en adherente neutrofielen te kwantificeren, speelt u de time-lapse af en telt u het aantal cellen dat zichtbaar rolt.De rollende bloedplaatjestrombus over 20 minuten wordt gedefinieerd als een afname in de snelheid van neutrofielen tijdens de interactie met de bloedplaatjestrombus gedurende ten minste twee seconden. Adherente neutrofielen worden gedefinieerd als alle neutrofielen die gedurende ten minste twee minuten gebonden blijven aan de bloedplaatjestrombus. Hier zijn representatieve beelden van het uiterlijk van de fluorescentiesignalen geassocieerd met neutrofielen in rood en bloedplaatjes in groen.Tijdens de vasculaire ontsteking wordt de richting van de bloedstroom in het vat door de pijl aangegeven. Het aantal rollende en adherente neutrofielen op ontstoken endotheelcellen werd respectievelijk bepaald op 0,25 cellen per minuut en 18,5 cellen per vijf minuten. De gegevens zijn representatief voor het gemiddelde plus of min de standaardfout van het gemiddelde van 30 verschillende vaten in vier wild-type muizen.Hier is het mediaan geïntegreerde fluorescentiesignaal van de bloedplaatjes uitgezet als functie van de tijd. Er werd vastgesteld dat de meeste bloedplaatjes in het rood hechten aan de hechtende en kruipende neutrofielen in het groen, in plaats van aan de ontstoken vaatwand. We gaan nu over naar de interacties tussen neutrofielen en bloedplaatjes na laser-geïnduceerd arteriolair letsel.Deze afbeeldingen illustreren een enkele neutrofiel in het rood, aangegeven met de gele pijl, die rolt over de bloedplaatjestrombus in het groen, terwijl een tweede neutrofiel in het rood, aangegeven door de witte pijl, snel rolt over de arteriolaire endotheelcellen; beide over een opname-interval van vijf seconden. Hier wordt opnieuw een enkele neutrofiel in het rood getoond die rolt over en hecht aan een bloedplaatjestrombus in het groen over een interval van 15 seconden. De pijlpunten identificeren de rollende en de hechtende neutrofielen en de dikke grijze pijl geeft de richting van de bloedstroom aan. Hier is het mediaan geïntegreerde fluorescentiesignaal van de bloedplaatjes uitgezet als functie van de tijd.Het aantal rollende en adherente neutrofielen werd bepaald op respectievelijk 21,5 en 1,6 cellen over 20 minuten. Aanvankelijk vond er een snelle rolling van de neutrofielen plaats op de endotheelcellen. Zodra de neutrofielen in contact kwamen met de bloedplaatjestrombus, veranderde de rollingsnelheid van de neutrofielen op de bloedplaatjestrombus naar een bereik van 8,2 micrometers per second en wordt dit gemedieerd door de interactie van pectin en psgl L one.De gegevens zijn representatief voor het gemiddelde plus of minus de standaardfout van het gemiddelde van 14 verschillende trombi in zeven wild-type muizen vijf minuten na laserletsel. De grootte van de bloedplaatjestrombus blijft relatief constant tijdens de beeldvorming, en de neutrofielen rollen over de trombus en hechten zich hieraan. Het fluorescentiesignaal van de circulerende bloedplaatjes is verwaarloosbaar.In vergelijking met die van de bloedplaatjestrombus, zou u na het bekijken van deze video een goed begrip moeten hebben van hoe u het intravitale microscopiesysteem met levende muizen opzet, waardoor u in realtime de heterotype interacties tussen bloedplaatjes en neutrofielen op geactiveerd endotheel binnen de microvasculatuur kunt visualiseren.

real-time-imaging-heterotypic-platelet-neutrophil-interactions-on

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In this video, we demonstrate the real-time visualization of blood cell-endothelial interactions in the mesenterial veins of a mouse model injected intraperitoneally with lipopolysaccharide.

Intravital Microscopy to Analyze Blood Cell-Endothelial Interactions in an Inflammation Mouse Model

Om de interactie van bacteriën met de bloedvaten onder afschuifspanning te bestuderen, worden een stromingskamer en een in vivo mesenteriale intravitale microscopiemodel beschreven die het mogelijk maken om de bacteriële en gastheerfactoren die bijdragen aan vasculaire adhesie te ontleden.

In vitro en in vivo model voor Bacteriële hechting aan de vaatwand Onder Flow omstandigheden te bestuderen

Deze vereenvoudigde toepassing van intravitale microscopie van mesenterische aderen bij muizen kan worden gebruikt in verschillende ontstekingsmodellen om leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-leukemie-interacties te observeren.

Intravitale Microscopie van leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-leukocyten Interactions in mesenteriale Veins in Muizen

We beschrijven een protocol om het gedrag van neutrofielen en monocyten in mesenteriale aderen onder stabiele en inflammatoire omstandigheden te monitoren met behulp van intravitale confocale microscopie op geanesthetiseerde muizen.

Beeldvorming van neutrofielen en monocyten in Mesenteriale Veins door Intravitale Microscopie op verdoofd muizen in Real Time

Dit artikel beschrijft een experimenteel model van hemostase die gelijktijdig meet bloedplaatjesfunctie en coagulatie. Bloedplaatjes en fibrine fluorescentie wordt gemeten in real-time en bloedplaatjesadhesie rate, coagulatie snelheid, en het begin van coagulatie bepaald. Het model wordt gebruikt voor bloedplaatjes stollingsbevorderende eigenschappen bepalen onder stroom concentraten voor transfusie.

Een microfluïdische Flow Kamer Model voor trombocytentransfusie en hemostase Maatregelen afzetting van trombocyten en fibrine Formation in real-time

Dit werk beschrijft een fluorescentiemicroscopie-gebaseerde methode voor het bestuderen van bloedplaathechting, verspreiding en afscheiding onder stroming. Dit veelzijdige platform maakt het mogelijk om bloedplaatjesfunctie te onderzoeken voor mechanistisch onderzoek naar trombose en hemostase.

Live-cel beeldvorming van bloedplaatjes Degranulatie en afscheiding onder stroming

We presenteren een in vitro vasculaire ziekte model om hele bloed interacties met patiënt-afgeleide endotheel te onderzoeken. Dit systeem maakt het mogelijk om tromboogene eigenschappen van primaire endotheelcellen onder verschillende omstandigheden te bestuderen. De methode is vooral geschikt om in situ tromboïgeniteit en antistollingstherapie te evalueren tijdens verschillende fasen van stolling.

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

We beschrijven hier de methode voor het afbeelden van megakaryocyten en proplatelets in het merg van het schedelbot van levende muizen met behulp van twee-fotonenmicroscopie.

In vivo Twee-foton Beeldvorming van Megakaryocyten en Proplatelets in de Muis Schedel Beenmerg

De rekrutering van leukocyten en bloedplaatjes vormt een essentieel onderdeel dat nodig is voor de effectieve groei van collaterale slagaders tijdens arteriogenese. Multifotonenmicroscopie is een efficiënt hulpmiddel voor het volgen van celdynamica met een hoge spatio-temporele resolutie in vivo en minder fototoxiciteit om leukocytenrekrutering en extravasatie tijdens arteriogenese te bestuderen.

Multifoton intravitale beeldvorming voor het monitoren van leukocytenrekrutering tijdens arteriogenese in een Murine Hindlimb-model

De bloedplaatjesfunctie onder stroom kan worden beoordeeld en gesimuleerde hemostatische reanimatie kan worden gemodelleerd met behulp van een microfluïdisch apparaat, dat toepassingen heeft in de trauma- en transfusiegeneeskunde.

Microfluïdica bij het beoordelen van de bloedplaatjesfunctie

Leer real-time fluorescentie-intravital-microscopie voor vasculaire ontsteking en trombose bij levende muizen. Deze methode visualiseert bloedplaatjes-neutrofiele interacties op geactiveerd endotheel.

Real-time beeldvorming van heterotypische Bloedplaatjes-neutrofiele Interacties op het geactiveerd endotheel tijdens vasculaire ontsteking en trombose in Live Muizen (Video) | JoVE Journal

Real-time beeldvorming van heterotypische Bloedplaatjes-neutrofiele Interacties op het geactiveerd endotheel tijdens vasculaire ontsteking en trombose in Live Muizen

Meer video's verkennen