Name: Isolatie van de cerebrospinale vloeistof uit Knaagdieren Embryos voor gebruik met Ontleed cerebrale corticale Explantaten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Leer embryonaal cerebrospinaal vocht isoleren uit knaagdierembryo's voor corticale explantcultuur. Deze methode onthult instructieve signalen voor hersenontwikkeling en mogelijke therapeutische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn dankbaar voor de steun van het NIH (Award nummers R00 NS072192 aan MKL, HD029178 om AS.L., en 2 RO1 NS032457 naar CAW). MKL is de ontvanger van de Children&#39;s Hospital Boston Career Development Fellowship / Harvard Medical School Shore Fellowship en een Fellow van de Alfred P. Sloan Foundation. CAW is een onderzoeker van de Howard Hughes Medical Institute.

1. Embryo Isolatie / Voorbereiding Deze techniek kan worden gebruikt voor muis of rat. In dit protocol demonstreren we de CSF collectie techniek en cerebrale corticale explantatie dissectie met muis embryonale hersenen. We zullen reageren op een belangrijke verschillen voor ratten versus muizen die bestaan ​​binnen de algemene technieken. Voor de embryonale leeftijd staging systeem, E1 geclassificeerd als de dag van de plug voor ratten en E0.5 is geclassificeerd als de dag van de plug voor muizen. <ol><li> Bereid een micro-dissectie schotel met Sylgard Silicone elastomeer. Sylgard 184 siliconelastomeerfase wordt geleverd als een tweedelige vloeibare component, deel A en deel B. Deel A en deel B worden gemengd in een verhouding 10:1 naar gewicht of volume. Nadat de vloeibare componenten worden gemengd, giet de Sylgard elastomeer in een petrischaal het gehele oppervlak van de schaal te dekken. Sommige kunnen er luchtbellen aanwezig zijn die te elimineren tijdens het uithardingsproces te zijn. Plaats de petrischaal deksel aan en laat de elastomer om te genezen. De elastomeer kan worden uitgehard bij kamertemperatuur gedurende 24 uur, of bij hogere temperaturen (bijvoorbeeld 37 ° C) voor een snellere uitharding. Zodra de vloeibare componenten stollen, de dissectie schotel is klaar voor gebruik. De schotel kan herhaaldelijk worden gebruikt voor meerdere experimenten, mits goed schoongemaakt na de procedure. </li><li> Bereiding van de micro-capillaire pipet (naald). Micro-capillaire pipetten worden bereid door het toepassen van warmte en trek met behulp van een Narishige PC-10 verticale micropipet trekker met de volgende instellingen: Een stap pull; Heater # 2 bij 58; 100 g pull gewicht. De fijne punt van de micropipet wordt zorgvuldig knapte uit met fijne # 55 tang. De resulterende gemiddelde binnendiameter van de naald is 85 um. </li><li> Bereid de aspirator assemblage voor CSF aspiratie. Steek micro-plunjer voorzien van micro-capillaire pipetten in de capillaire naald. Alternatief hechten plastic wegwerp filter aan het einde van de aspirator-samenstel dat is verbonden to de micro-capillaire pipet. Steek de naald door de pakking in positie aan het andere einde van het samenstel aspirator. </li><li> Overdracht geïsoleerd embryo uit het nest van een micro-dissectie gerecht bereid met Sylgard. </li><li> Verwijder de extra-embryonale membranen en weefsels zodat de embryo duidelijk blootgesteld. Elke weefsellaag-first de baarmoederwand en vervolgens de decidua-kan worden ontleed met behulp van fijne iridectomie schaar (dwz Fine Science Tools # 15000-02). Op elke implantatie eerst de baarmoederwand, dan decidua kunnen parallel worden ingesneden om de lange as van de baarmoeder en de incisie kan dan verder worden geopend met fijne pincet. De decidua kan worden verwijderd na een gelijkaardige incisie, waardoor de vliezen. Voorzichtigheid is geboden, zodat de vliezen niet zijn ingesneden of beschadigd is. </li><li> Wassen met steriele Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) en overtollig vocht uit de omringende embryo met een pipet en een filter of Kimwipepapier gesneden in driehoeken. </li></ol> 2. Ventriculaire CSF Collection <ol><li> Visualiseer embryo onder de dissectie microscoop: voor muis, het embryo moet worden tot op zijn kant, zodat men een sagittale uitzicht op de zich ontwikkelende embryo heeft. Met rat E16 embryo of ouder, plaats de embryo op de dorsale wervelkolom, langs de langste vlakke dimensie van een craniaal caudaal, alsof het embryo op zijn rug. Op deze wijze CSF kan worden vanuit de rechter en linker laterale ventrikel. </li><li> Gestaag plaats de micro-capillaire pipet in het laterale ventrikel, mesencefale ventrikel of cisterna magna, proberen niet de neuro cellen contact nadat de pipet is geplaatst. Voor muis embryo E14.5 of ouder kan de CSF worden afgezogen van de rechterkamer en de naald verwijderd en ingebracht in de linker ventrikel. Door het vrijhouden van de ventrikels en de neurale buis in embryo jonger dan E14.5, dehele CSF volume kunnen vaak worden opgezogen uit de laterale ventrikels met een enkele naald inbrengen. Dit is echter niet altijd het geval ontwikkeling tijden en patency van de verbindende ventrikels kunnen enigszins variëren en derhalve de micro-capillaire pipet kan ook worden ingevoegd in de cisterna magna de maximale CSF volume verzamelen. </li><li> Nadat de micro-capillaire pipet wordt in de laterale ventrikel, mesencefale ventrikel of cisterna magna, zorgvuldig en langzaam beginnen afzuigen van het CSF in de pipet, met behulp van de micro-zuiger onderdruk creëren en het CB zuigen of door een lichte onderdruk die door de mond zodat CSF begint te stromen voorzichtig in de micro-capillaire pipet in een langzame en gecontroleerde wijze. Wij bevelen aan dat de kijker wordt verbinding gemaakt met hun eigen lokale functionarissen met betrekking tot de institutionele beleid op deze benaderingen. </li><li> Blijf negatieve druk uit te oefenen en de CSF verzamelen in de micro-capillaire pipet.In zowel muis als rat embryo&#39;s van E16.5/E17 of jonger, is het mogelijk om het ventrikel ineenstorting licht waarnemen door het verschijnen van een graszode die aan de zijkant van het hoofd dat de micro-capillaire pipet inch In oudere embryo door de grotere omvang van de hersenen, kan het niet mogelijk is de kop instorten. </li><li> Stop uitoefenen van druk en voorzichtig de micro-capillaire pipet uit het laterale ventrikel. </li><li> Voorzichtig te verdrijven van de CSF monster in een Eppendorf buis die is gekoeld op ijs. </li><li> Gaan met het verzamelen van de CSF van een hele nest van dieren en bundelen de monsters in dezelfde buis. </li><li> Centrifugeer bij 10.000 xg bij 4 ° C gedurende 10 min om eventuele contaminerende cellen te verwijderen. </li><li> Analyseer de monsters op tekenen van besmetting van neuroepitheliale cellen of rode bloedcellen. Tekenen van verontreiniging worden meestal aangeduid met de vloeistof verschijnen troebel of rood / roze, of de aanwezigheid van een pellet met een zich bloed vlek. Na centrifugeren werd de CSF kan microscopisch worden onderzocht op tekenen van cellen of celresten. Als er tekenen van verontreiniging van de vloeistof moet worden weggegooid. Als bijkomende kan de pellet gehalte eveneens worden gekleurd voor cellen. Een schone CSF monster kan worden gebruikt voor celkweek, corticale cultuur spectrometrie, western blot, ELISA en andere assays. De heldere CSF worden overgebracht naar een nieuwe steriele Eppendorf buis. Het monster kan nu gebruikt worden voor analyse, samengevoegd met andere monsters of snap bevroren met vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C. Het invriezen en ontdooien van kleine monsters van fluïdum kan leiden tot een klein volume en veranderingen afname in eiwitconcentratie. Dit kan vermeden worden door vriesdrogen monsters. </li></ol> 3. Corticale Explantatie Dissection <ol><li> Breng de E14.5 embryo geïsoleerd van het nest op een micro-dissectie gerecht bereid met Sylgard. </li><li> Verwijderen van embryo extra-embryonale membranen en weefsels zoals beschreven in stap 1.5. </li> &lt;li&gt; Wassen met steriele Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) en verwijder overtollig vocht uit de omringende embryo met behulp van een pipet. </li><li> Prepareer door het cervicale gebied scheidt de kop van de rest van de embryo (figuur 1A). </li><li> Met behulp van een fijne scalpel (oogheelkundige mes), het kappen van de middellijn van de hoofdhuid. Pak beide zijden van deze incisie met fijne tang en verwijder de huid. Vervolgens gebruikt iridectomy schaar om een ​​incisie dat de lengte van de middellijn van ontwikkeling cranium loopt maken. Vervolgens nog eens twee insnijdingen, ongeveer 1/3 van de afstand van het voorste en achterste uiteinden van de ontwikkeling schedel. Gebruik fijne tang om de &quot;flappen&quot; van cranium vatten die voortvloeien uit dit deel van de dissectie en de ontwikkeling schedel weefsel verwijdert blootstellen van de cortex (Figuur 1B). </li><li> Met de scalpel bisect de hersenen langs de middellijn in de mid-sagittale vlak, het scheiden van de rechter en linker hemisferen corticale (figuren1B, C). De pia en arachnoidea worden overgelaten aan de cortex, en de dura wordt verwijderd samen met de ontwikkeling van schedel. </li><li> Afzonderlijk Bereid elke corticale halfrond. Plaats de hemisfeer mediale kant naar boven zodat u de zenuwcentra verhevenheid en de ontwikkelingslanden cortex (figuur 1C, D) te zien. </li><li> Met behulp van de scalpel, maak een coronale incisie door de corticale neuroepitheel caudaal van de zich ontwikkelende bulbus olfactorius. Deze incisie moet beginnen op de voorste rand van de laterale en mediale ganglion grootheden, en zich uitstrekken door de voorste cingulate gebied van de ontwikkeling van corticale rudiment (figuur 1E). </li><li> Maak nog een coronale incisie net caudaal van de achterste begrenzing van de laterale ganglion eminence (Figuur 1F). Deze incisie ook uitstrekken vanaf de laterale begrenzing van de ganglionische eminence de mediale wand van de ontwikkeling corticale rudiment. </li><li> Trek de corticale &quot;flap&quot; created de twee incisies in stappen 3.7 en 3.8, met een scalpel of zachte druk van een stroom van HBSS geleverd met een pipet om 200 ul mechanische beschadiging van de cortex voorkomen. Maak dan een dwarse incisie langs de grens tussen de laterale ganglionische eminence uit de ontwikkelingslanden cortex (Figuren 1G, H). Vervolgens ontleden weg ontwikkelingslanden hippocampus en corticale zoom van de mediale telencephalon, aan de top van de neocortex waar de laterale corticale oppervlak aan de wand interhemisferische. </li><li> Een dwarse incisie langs de grens tussen de laterale ganglionische eminence de ontwikkeling cortex (figuur 1H). </li><li> Verwijder extra ontleed weefsel dat de plaat uit de Sylgard ontleed corticale explantaat. Men kan gebruik maken van zachte pipetteren met verse HBSS buffer om pipetteer weg extra ontleed weefsel. De ontleed cortex is nu met meningeale zijde naar beneden (Figuur 1I). </li></ol><ol><li> Bereid een platina draad lus verbonden met een glazen pipet. Verhit de glazen pipet met een gevouwen platinadraad ingebracht in het uiteinde van de glazen pipet. Door het draaien aan het einde van de loop platinadraad, kan de grootte van de lus worden verhoogd of verlaagd, en de lus kan worden afgestemd op de grootte van de gewenste explantaat passen. (Dit kan vooraf bereid worden en hergebruikt.) </li><li> Verhit het einde van de platinadraad de loop steriliseren. </li><li> Isoleer de ontleed corticale explantatie en verwijder de extra HBSS media door zachte pipetteren, waardoor een kleine hoeveelheid te gebruiken met de draad lus. </li><li> Plaats een 1 cm polycarbonaatmembraan in een 4 cm diameter imaging schotel. </li><li> Met behulp van de kant van de platina draadlus voorzichtig draait u de cortex, zodat de meningeale zijde naar boven wijst. </li><li> Neem de corticale explantaat uit de dissectie schotel, door het plaatsen van het explantaat in het midden van de lus en het gebruik van de intrinsieke hydrostatische krachtenTil de explantatie op een plat vlak. </li><li> Plaats voorzichtig de explant het polycarbonaatmembraan en til de platinadraad lus zodanig dat het explantaat blijft op het membraan op een plat vlak met de ventriculaire oppervlak contact maakt met membraan. </li><li> Til het membraan en pipetteer 50 ul van KVP of andere media onder het membraan. </li><li> Bedek de imaging schotel, plaats het in een bevochtigde secundaire container, en incuberen bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 24 uur om verdere celproliferatie en explant groei. Figuur 2 toont een schema van de uiteindelijke corticale explant schotel voorbereiding. </li></ol>

<ol><li>Dziegielewska, K. M., Evans, C. A., Lai, P. C., Lorscheider, F. L., Malinowska, D. H., Mollgard, K., Saunders, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins+in+cerebrospinal+fluid+and+plasma+of+fetal+rats+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteins in cerebrospinal fluid and plasma of fetal rats during development.</a> Developmental Biology. 83 (1), 193-200 (1981).</li>
<li>Gato, A., Martin, P., Alonso, M. I., Martin, C., Pulgar, M. A., Moro, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cerebro-spinal+fluid+protein+composition+in+early+developmental+stages+in+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology.+Part+A%2C+Comparative+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of cerebro-spinal fluid protein composition in early developmental stages in chick embryos.</a> Journal of Experimental Zoology. Part A, Comparative Experimental Biology. 301 (4), 280-289 (2004).</li>
<li>Gato, A., Moro, J. A., Alonso, M. I., Bueno, D., Mano, D. L., Martin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+cerebrospinal+fluid+regulates+neuroepithelial+survival%2C+proliferation%2C+and+neurogenesis+in+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record.+Part+A%2C+Discoveries+in+Molecular%2C+Cellular%2C+and+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos.</a> The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 284 (1), 475-484 (2005).</li>
<li>Parada, C., Gato, A., Aparicio, M., Bueno, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+chick+embryonic+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of chick embryonic cerebrospinal fluid.</a> Proteomics. 6 (1), 312-320 (2006).</li>
<li>Parada, C., Gato, A., Bueno, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+embryonic+cerebrospinal+fluid+proteome+has+greater+apolipoprotein+and+enzyme+pattern+complexity+than+the+avian+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Mammalian embryonic cerebrospinal fluid proteome has greater apolipoprotein and enzyme pattern complexity than the avian proteome.</a> Journal of Proteome Research. 4 (6), 2420-2428 (2005).</li>
<li>Zappaterra, M. D., Lisgo, S. N., Lindsay, S., Gygi, S. P., Walsh, C. A., Ballif, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+proteomic+analysis+of+human+and+rat+embryonic+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">A comparative proteomic analysis of human and rat embryonic cerebrospinal fluid.</a> Journal of Proteome Research. 6 (9), 3537-3548 (2007).</li>
<li>Desmond, M. E., Jacobson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+brain+enlargement+requires+cerebrospinal+fluid+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic brain enlargement requires cerebrospinal fluid pressure.</a> Developmental Biology. 57 (1), 188-198 (1977).</li>
<li>Lehtinen, M. K., Walsh, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+at+the+brain-cerebrospinal+fluid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis at the brain-cerebrospinal fluid interface.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 653-679 (2011).</li>
<li>Lehtinen, M. K., Zappaterra, M. W., Chen, X., Yang, Y. J., Hill, A. D., Lun, M., Maynard, T., Gonzalez, D., Kim, S., Ye, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cerebrospinal+fluid+provides+a+proliferative+niche+for+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells.</a> Neuron. 69 (5), 893-905 (2011).</li>
<li>Martin, C., Alonso, M. I., Santiago, C., Moro, J. A., De la Mano, A., Carretero, R., Gato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+embryonic+brain+development+in+rats+requires+the+trophic+influence+of+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+International+Society+for+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid.</a> International Journal of Developmental Neuroscience: The Official Journal of the International Society for Developmental Neuroscience. 27 (7), 733-7340 (2009).</li>
<li>Martin, C., Bueno, D., Alonso, M. I., Moro, J. A., Callejo, S., Parada, C., Martin, P., Carnicero, E., Gato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF2+plays+a+key+role+in+embryonic+cerebrospinal+fluid+trophic+properties+over+chick+embryo+neuroepithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">FGF2 plays a key role in embryonic cerebrospinal fluid trophic properties over chick embryo neuroepithelial stem cells.</a> Developmental Biology. 297 (2), 402-416 (2006).</li>
<li>Zappaterra, M. W., Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cerebrospinal+fluid%3A+regulator+of+neurogenesis%2C+behavior%2C+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">The cerebrospinal fluid: regulator of neurogenesis, behavior, and beyond.</a> Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 69 (17), 2863-2878 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

De beschreven werkwijze voor ventriculaire CSF collectie leverde relatief zuivere monsters van embryonale CSF met stabiele en consistente eiwitsamenstelling activiteit in een aantal cellulaire assays 9. Met een goede techniek voor het verzamelen en worpgrootte van tien E14.5 muizen, kan men verwachten tot 10-15 ul CSF te verzamelen en uit een nest van E16 ratten, kan men verwachten te verzamelen ca 50-90 ul van CSF. Deze collectie techniek minimaliseert vervuiling door bloed en weefsel, door zorgvuldige obser...

Het CSF is een complexe vloeistof die de ontwikkeling van neuro-epitheel één-zes baadt en biedt essentiële druk 7 en groeibevorderende aanwijzingen voor de zich ontwikkelende hersenen 8-12. Om de CSF te bestuderen in de loop van ontwikkeling van de hersenen, we technieken ontwikkeld om ventriculaire CSF te isoleren van het ontwikkelen van rat of muis embryo&#39;s tijdens de verschillende stadia van ontwikkeling 6,9. Vorige methoden van isolatie opgenomen met behulp van een glazen micro-naald en het isoleren van de CSF met behulp van een micro-injector 1,2. Onze methode maakt gebruik van een glazen micro-capillaire pipet wiens tip is getrokken om een ​​ultrafijne punt voor een betere penetratie te creëren. De glazen micro-capillaire pipet is verbonden met een aspirator zodat ventriculaire CSF verzameling kan worden bediend met lichte veranderingen in druk. Om de stamcellen invloeden van CSF signalen te onderzoeken, ontleden we cerebrale corticale explantaten, leg ze op polycarbonaat membranen, en drijven ze op juiste culture medium aangevuld met CSF monsters 9. Met deze techniek verminderde hoeveelheden media cultuur voldoende zijn om het weefsel, waardoor een efficiënt gebruik van CSF 9.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens / Materiaal </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Wiretrop II capillaire naalden </td><td> Drummond Scientific </td><td> # 5-000-2020 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard </td><td> Ellsworth Lijmen </td><td> # 184 SIL ELAST kit </td><td></td></tr><tr><td> Aspirator binnenband </td><td> Sigma </td><td> # A5177-5EA </td><td></td></tr><tr><td> Wegwerpfilter </td><td> Venturi of lokale apotheek </td><td> niet beschikbaar </td><td> Standaard sigaret filter </td></tr><tr><td> Roundstock oftalmische mes (15 graden stab mes) </td><td> Wereld Precision Instruments, Inc </td><td> # 500250 </td><td></td></tr><tr><td> 35mm glazen bodem cultuur schotel </td><td> MatTek Corp </td><td> # P35G-1.5-14-C </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Platina-iridium draad </td><td> TriTech Onderzoek </td><td> # PT-9010-010-3FT </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore Track-Etch Membraan </td><td> Whatman papier </td><td> # 09-300-57 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks Balanced Salt Solution </td><td> Fisher Scientific </td><td> # SH30031.FS </td><td></td></tr><tr><td> Iridectomie Schaar </td><td> Fine Science Tools </td><td> # 15.000-02 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van de cerebrospinale vloeistof uit knaagdieren embryo&#39;s voor gebruik met ontleed cerebrale corticale explantaten

Isolation of Cerebrospinal Fluid from Rodent Embryos for use with Dissected Cerebral Cortical Explants

Het CSF is een complexe vloeistof met een dynamisch variërende proteoom tijdens de ontwikkeling en in de volwassenheid. Tijdens de embryonale ontwikkeling de ontluikende CSF opzichte van het vruchtwater na sluiting van de voorste neurale buis. CSF volume neemt dan de daaropvolgende dagen als de neuro-epitheliale stamcellen langs de ventrikels en de choroidea plexus genereren CSF. De embryonale CSF contacten de apicale, ventriculaire oppervlak van de neurale stamcellen van de ontwikkelende hersenen en het ruggenmerg. CSF biedt cruciaal vloeistofdruk voor de uitbreiding van de zich ontwikkelende hersenen en distribueert belangrijke groeibevorderende factoren om neurale progenitorcellen in een tijdelijk-specifieke wijze. Het onderzoeken van de functie van de CSF, is het belangrijk om zuivere monsters van embryonale CSF isolaat zonder contaminatie van bloed of de ontwikkeling telencephalic weefsel. Hier beschrijven we een techniek relatief zuivere monsters van ventriculaire embryonale CSF dat gebruikt kan worden voor isolerendiverse experimentele proeven, waaronder massaspectrometrie, eiwit elektroforese, en cellen en primaire explantaatkweek. We laten zien hoe te ontleden en cultuur corticale explantaten op poreuze polycarbonaat membranen om de ontwikkeling van corticale weefsel groeien met verminderde volumes van media of CSF. Met deze methode kunnen experimenten uitgevoerd met CSF van verschillende leeftijden of voorwaarden om de biologische activiteit van de CSF proteoom onderzoeken op doelcellen.

De CSF collectie moet opleveren een heldere, transparante vloeistof. Er geen bewijs van besmetting van bloed, zoals blijkt uit een rood of geel getinte vloeistof in de aspiratie en de Eppendorf buis. Er moet ook geen bewijs van weefsel in de aspiratie en Eppendorf buis. Wanneer het CSF gecentrifugeerd, kan men ook microscopisch beoordelen CSF te waarborgen dat er geen vervuiling. In aanwezigheid van verontreiniging, dient het CB worden weggegooid. Van de ene E14.5 muis nest, kan men anticiperen op het verzamelen 10 tot ...

De ventriculaire cerebrospinale vloeistof (CSF) baadt de neuro-epitheliale en cerebrale corticale progenitorcellen tijdens de vroege ontwikkeling van de hersenen in het embryo. Hier beschrijven we de methode ontwikkeld om ventriculaire CSF isoleren van knaagdieren embryo&#39;s van verschillende leeftijden om zijn biologische functie onderzoeken. Daarnaast tonen wij onze cerebrale corticale explantatie dissectie en cultuur techniek die voor explantatie groei mogelijk maakt met een minimale hoeveelheid voedingsoplossing of liquor.

Isolatie van de cerebrospinale vloeistof uit Knaagdieren Embryo&#39;s voor gebruik met Ontleed cerebrale corticale Explantaten

The CSF is a complex fluid with a dynamically varying proteome throughout development and in adulthood. During embryonic development, the nascent CSF ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de rol van uitgescheiden signalen in het embryonale CSF te observeren bij de ontwikkeling van de cerebrale cortex. Dit wordt bereikt door eerst embryonaal CSF te isoleren om als kweekmedium te gebruiken. In de volgende stappen wordt de ontwikkelende cerebrale corticale wand gedissecteerd, op een polycarbonaatmembraan geplaatst en op CSF laten drijven.De resultaten tonen aan dat het embryonale CSF instructieve signalen verschaft aan de ontwikkelende cerebrale cortex, gebaseerd op de analyse van explantaten via immunokleuring. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van het CSF. Zo kan worden bepaald wat de componenten van het CSF zijn en wat de functie ervan is op verschillende momenten tijdens de ontwikkeling, om zo hopelijk te helpen bepalen hoe het in de toekomst als therapeutisch voertuig voor neurodegeneratieve ziekten kan worden ingezet.Het is essentieel dat CSF wordt verzameld zonder contaminatie en dat schade aan het corticale explantaat tot een minimum wordt beperkt. Deze procedures kunnen aanzienlijke oefening vereisen, omdat ze het manipuleren van kleine weefsels met zeer fijne dissectie-instrumenten behelzen. Begin met het voorbereiden van de micropipetnaden.Trek bijvoorbeeld met een Orica PC 10 verticale micropipet-puller microcapillaire pipetten van 10 tot 20 µL met de volgende instellingen: een éénstaps pull-verwarming nummer twee, ingesteld op 58 en een pull-gewicht van 100 g. Breek de fijne punt van de micropipet af met fijne pincetten nummer 55. De gemiddelde binnendiameter van de resulterende naald zal 85 µm zijn.Bereid vervolgens de aspiratie-eenheid voor. Voor de aspiratie van CSF plaatst u de microzuiger die bij de microcapillaire pipetten is geleverd in de capillaire naald. Bevestig anders een wegwerpfilter van plastic aan het uiteinde van de aspiratiebuis-eenheid die is verbonden met de microcapillaire pipet.Duw vervolgens, aan de tegenovergestelde zijde van de aspiratorassemblage, de naald door de pakking en in de juiste positie. Draag nu een geïsoleerde muizen- of rattenembryo over naar een microdissectieschaaltje dat is voorbereid met syl guard. Was het embryo met steriel HBSS en verwijder de vloeistof rondom het embryo door aspiratie en door het droogdeppen met absorbent papier.Visualiseer het embryo onder een dissectiemicroscoop. Als dit een muizenembryo is, moet het op zijn zij liggen, zodat er een sagitaal beeld ontstaat. Voer nu de microcapillaire pipet voorzichtig in het laterale of cephalische ventrikel, het mesocefalische ventrikel of het CI sternum in.Magneten worden gebruikt om te voorkomen dat de neuro-epitheliale cellen worden geraakt. Zodra de pipet is ingebracht, wordt de naald slechts tot het doorprikken van het weefsel ingevoerd. Begin nu voorzichtig en rustig met het aspireren van het CSF in de pipet door middel van een lichte onderdruk, gecreëerd door de microplunjer of mondzuiging.Het CSF zou langzaam en gecontroleerd in de microcapillaire pipet moeten beginnen te stromen. Blijf negatieve druk uitoefenen tot de collectie voltooid is. Het is essentieel dat de collectie resulteert in een heldere, transparante vloeistof.Indien er bewijzen zijn van contaminatie door bloed, zoals een rode of gele kleur van de oplossing, dient de collectie bij zowel muis- als ratembryo's te worden weggegooid. In het stadium E 16.5 tot E 17, of eerder, kan men waarnemen dat de ventrikel licht inklapt op de plek waar de microcapillaire pipet is geplaatst. De CSF-stroom zal bij deze gebeurtenis stoppen; verwijder de microcapillaire pipet voorzichtig zodra de stroom is beëindigd.Expelleer vervolgens voorzichtig de verzamelde CSF-monsters in een microcentrifugebuisje dat op ijs is gekoeld, afkomstig van een worp muizen van E 14.5. Er wordt verwacht dat er in totaal 10 tot 15 µL CSF wordt verzameld wanneer alle collecties zijn voltooid. Centrifugeer de buis 10 minuten lang bij 10 000 Gs en vier °C.Bovenop de bezonken cellen wordt het heldere CSF overgebracht naar een nieuwe buis om eventuele contaminerende cellen te verwijderen. Indien het monster als zuiver wordt beschouwd, kan nu een microscopisch onderzoek op contaminanten worden uitgevoerd. Het monster kan worden gebruikt voor analyse, samengevoegd met andere monsters of gesnap-gefrozen met vloeibare stikstof en bewaard bij -80 °C om corticale explantaten te verzamelen voor experimenten met CSF-gesupplementeerde media.Leg een embryo van E 14.5 in een schaal met een sigarenvormige coating en leg de cortex bloot. Verwijder de dura samen met de ontwikkelende schedel met behulp van een scalpel, maar laat de pia en arachnoidea aan de cortex vastzitten. Halveer de hersenen langs de middellijn in het midsagittale vlak, waarbij de rechter- en linkerhemisferen van de cortex worden gescheiden.Bereid elke corticale hemisfeer afzonderlijk voor. Plaats de hemisfeer met de mediale zijde naar boven, zodat de ganglionic imminence en de ontwikkelende cortex zichtbaar zijn. Maak met het scalpel een coronale incisie door het corticale neuro-epitheel tot aan de ontwikkelende bulbus olfactorius.Deze incisie moet beginnen bij de anterieure grens van de laterale en mediale ganglionale eminenties en zich uitstrekken door de anterieure cingulate-regio van het ontwikkelende corticale rudiment. Maak een tweede coronale incisie net caudaal van de posterieure grens van de laterale ganglion eminentie. Deze incisie moet zich uitstrekken van de laterale grens van de ganglion eminentie tot de mediale wand van het ontwikkelende corticale rudiment.Gebruik het scalpel om de corticale flap die door de twee incisies is gemaakt, terug te trekken. Dit beperkt het risico op beschadiging van de cortex. Dissecteer nu de ontwikkelende hippocampus en de corticale zoom van het mediale cephalon weg.Doe dit vanaf de apex van de neocortex, waar het laterale corticale oppervlak aansluit op de interhemisferische wand. Maak vervolgens een transversale incisie langs de grens die de laterale ganglionic eminence scheidt van de ontwikkelende cortex. Verwijder alle overtollig gedisseceerd weefsel van het plaatje.De gedissecteerde cortex is nu klaargelegd met de meningeale zijde naar beneden. Om de cortex over te plaatsen, bereidt u een platina draadlussen verbonden met een glazen pipet door met een brander het uiteinde van de pipet op de platina draad te smelten. Zodra dit is gemonteerd, steriliseert u de platina draadlus en laat u deze afkoelen.Verwijder het overtollige medium rond de X explan door middel van voorzichtig aspireren. Laat een kleine hoeveelheid oplossing over om te gebruiken met de draadlus. Plaats vervolgens een polycarbonaatmembraan van één centimeter in een imaging-schaal met een diameter van vier centimeter.Klap nu met de zijkant van de platina draadlus de cortex voorzichtig om, zodat de meningeale zijde naar boven is gericht. Plaats vervolgens het X explantaat in het midden van de lus en til het corticale X explantaat met behulp van intrinsieke hydrostatische krachten uit de schaal. Plaats het explantaat daarna voorzichtig op het polycarbonaatmembraan en til de platina draadlus weg.Vul vervolgens een pipet met 50 µL CSF of een ander medium. Til het membraan voorzichtig op en breng het medium eronder aan. Sluit daarna de imaging dish.Plaats het in een bevochtigde secundaire container en incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C met 5% CO2. Om de voortdurende proliferatie en de groei van het explantaat te ondersteunen, zijn de volumes van de CSF-collectie voor gemiddelde nestgrootten berekend voor zowel muizen als ratten van verschillende embryonale leeftijden. Wanneer zuivere CSF-monsters zijn verzameld, kan de CSF worden geanalyseerd met behulp van verschillende technieken, zoals een zilverkleuring van enkele microgrammen.Deze CSF is afkomstig van een E 14.5 muis. 24 uur oude explantaten die zijn geprolifereerd met 100% CSF vertonen een weefselhistologie die vergelijkbaar is met die van knaagdierembryo's van dezelfde zwangerschapsleeftijd, zoals aangetoond door immunokleuring. pH drie.Een marker voor celdeling komt tot expressie langs het ventriculaire oppervlak. Een BrdU-marker voor DNA-synthese vertoont eveneens incorporatie langs de ventriculaire zone. En Tuj1, een neuronale marker, komt tot expressie in de ontwikkelende corticale plaat.Voordat u deze procedures uitvoert, is het belangrijk om de institutionele richtlijnen te raadplegen met betrekking tot de technieken die wij hebben gedemonstreerd. Deze techniek maakte het voor onderzoekers mogelijk om de uitgescheiden signalen binnen het CSF te bestuderen en zo de rol van de cerebrale cortex tijdens de in vitro ontwikkeling te onderzoeken.

isolation-cerebrospinal-fluid-from-rodent-embryos-for-use-with

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze video toont het protocol voor het isoleren en kweken explantaten van de muis voorhersenen van embyonic dag 12 muizen. Procedures voor het verwijderen van de baarmoeder, embryo's van baarmoeder en dissectie van embryo's worden gegeven. Naast de methode voor de overdracht van deze explantaten op gespecialiseerd membranen waar ze worden gekweekt is aangetoond. De ontwikkeling van de voorhersenen kan worden bestudeerd in vitro gebruik van deze preparaten en veranderingen in genexpressie.

Muis Dorsale voorhersenen Explantatie Isolatie

We beschrijven een snelle methode voor het isoleren en cultuur hippocampus en corticale neuronen van knaagdieren embryo's. Dit protocol stelt ons in staat uit te voeren experimenten waarbij bijna zuivere neuronale culturen zijn vereist.

Isolatie en Cultuur van Rat Embryonale neurale cellen: een Quick-protocol

Een methode waarmee genexpressie in de neurale buis downgereguleerd in een celtype-specifieke, traceerbare wijze beschreven. We laten zien...

In ovo Elektroporatie van miRNA gebaseerde Plasmiden in de ontwikkelingslanden neurale buis en Beoordeling van de fenotypes van Dil Injectie in de Open-boek Voorbereidingen

The video demonstrates a simple method to culture murine astrocytes in isolation from other brain cells. During culturing, by using astrocyte-specific media and inhibiting the adherence of non-astrocytic cells, the method selectively cultures astrocytes. These cultured astrocytes exhibit stellate morphology with fine processes.

A Simple Technique to Isolate and Culture Murine Astrocytes

This video demonstrates a protocol for isolating and culturing primary cerebral cortex cells from the dorsolateral telencephalon of mouse embryos.

Isolation and Culturing of Cells from Mouse Embryo Dorsolateral Telencephalons

Dit protocol beschrijft een verbeterde explantaat procedure die inhoudt...

Ex utero elektroporatie en Whole halfrond Explantaten: Een eenvoudige experimentele methode voor bestudering van vroege corticale ontwikkeling

Deze video toont een eenvoudige en betrouwbare strategie voor de bereiding van zuivere kweken van endotheelcellen van embryonale voorhersenen binnen 10-12 dagen en zal nuttig zijn voor onderzoek zich op vele aspecten van cerebrale angiogenese.

Isolatie en Cultuur van de endotheelcellen van de embryonale voorhersenen

-Nestin uiten voorouders zijn een nieuw geïdentificeerde populatie van neurale voorlopercellen in de zich ontwikkelende cerebellum. De microdissectie techniek hier gepresenteerd in combinatie met fluorescentie-geactiveerde celsortering, kan deze celpopulatie worden gezuiverd zonder contaminatie met andere cerebellaire regio's en kunnen worden gekweekt voor verdere studies.

Isolatie van Verschillende celpopulaties uit het ontwikkelen van kleine hersenen door Microdissection

Een protocol om een co-cultuursysteem te genereren dat bestaat uit neuronen afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's), primaire corticale neuronen en astrocyten wordt beschreven. Dit co-cultuursysteem maakt detectie mogelijk van de vorming van synaptische contacten en circuits tussen nieuwe, iPSC-afgeleide neuronen en reeds bestaande corticale neuronen die channelrhodopsine-2 tot expressie brengen.

Een optogenetische Aanpak voor het beoordelen van de vorming van neuronale verbindingen in een co-cultuur systeem

Hier presenteren we een protocol voor hydraulische extrusie van het ruggenmerg evenals identificatie en isolatie van specifieke dorsale wortelganglia (DRG's) in hetzelfde knaagdier. In vergelijking met standaard methoden voor ruggenmergisolatie is deze methode aanzienlijk sneller en vermindert het risico op weefselschade.

Hydraulische extrusie van het ruggenmerg en isolatie van achterwortelganglia in Knaagdieren

Een methode voor de isolatie van neurale stamcellen en oligodendrocytenvoorlopercellen uit de hersenen van levende ratten wordt hier in experimenteel detail gepresenteerd. Het maakt meerdere verzamelingen van deze cellen van dezelfde dieren mogelijk zonder hun welzijn in gevaar te brengen.

De "Brain Milking"-methode voor de isolatie van neurale stamcellen en voorlopercellen van oligodendrocyten uit levende ratten

Leer embryonaal cerebrospinaal vocht isoleren uit knaagdierembryo's voor corticale explantcultuur. Deze methode onthult instructieve signalen voor hersenontwikkeling en mogelijke therapeutische toepassingen.

Isolatie van de cerebrospinale vloeistof uit Knaagdieren Embryo's voor gebruik met Ontleed cerebrale corticale Explantaten

Meer video's verkennen