Name: Het beoordelen Neurodegenerative Fenotypes in Drosophila Dopaminerge neuronen reduceert door Klimmen Testen en Whole Brain Immunokleuring (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Leer hoe je neurodegeneratie van dopaminerge neuronen beoordeelt in transgene Drosophila met klimtesten en tyrosinehydroxylase-immunokleuring. Deze methode helpt onderzoekers om motorisch gedrag en neuronpopulaties te kwantificeren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Leo Pallanck voor vlieg voorraden, Christine Sommers voor technische bijstand en Gerasimos P. Sykiotis voor nuttige discussies. Dit werk werd gefinancierd door de NIH opleiding subsidie ​​T32CA009363 om MCB

1. Schrikreactie-geïnduceerde Negatieve geotaxis Assay <ol><li> Selecteer vliegen van het gewenste genotype, ze scheiden naar geslacht, willekeurig groeperen ze in cohorten van 20-30 dieren en draai ze in nieuwe voedingsmiddelen flacons om de 2-3 dagen; testen elke set van vliegen (dwz leeftijd gematchte cohorten, een cohort / genotype) minstens een keer per week. </li><li> Dertig minuten voor de negatieve geotaxis test, verdoven de vliegen met CO 2 en plaats ze in de pre-gelabelde plastic buizen met twee lege flesjes voedsel (zie Materialen tabel) toegetreden bij hun openingen met doorzichtige tape (kamer afmetingen: 19 cm x 2.85 cm). In onze tests gebruiken we meestal 25 vliegen / buis. Opmerking. De hersteltijd verdoving kan variëren van enkele minuten tot enkele uren (bijvoorbeeld O / N) en moet worden geoptimaliseerd voor de specifieke geteste genotypes. </li><li> Markeer verschillende hoogtes (van 1 tot 20 cm) op een stuk vloeipapier en tape het papier op een verticale surface, loodrecht op de bank. </li><li> Plaats de buizen in de voorkant van het papier: de buizen moet alles uitgelijnd en zo dicht mogelijk bij het papier om nauwkeurige hoogtemeting toestaan. </li><li> Plaats de digitale camera (zie de &quot;Special Equipment&quot; tabel) voor de buizen, op een afstand van 20-30 cm van het papier, op een stand (bijv. een pipet tip doos), selecteert u de optie &quot;film&quot; en start opname, op dit moment moet je ook beginnen met een timer voor het bijhouden van de tijd tussen opeenvolgende trials te houden. </li><li> Laat de vliegen te verzamelen op de bodem van de buis door op de buis gedurende enkele seconden (bijvoorbeeld 10 seconden). Deze stap moet consequent worden uitgevoerd (dat wil zeggen dezelfde duur, dezelfde kracht, dezelfde operator) het hele experiment. </li><li> Record vliegt &#39;bewegingen met de digitale camera gedurende 10 sec. </li><li> Herhaal de stappen 1,5-1,7 veertien keer op een-min intervallen. </li><li> Analyseren van gegevens: <ol type="a"><li> Tel het aantal vliegen die boven de2 cm merk na 10 sec door visuele inspectie van de opgenomen films. Opmerking: In onze test omstandigheden deed de vliegen &#39;negatieve geotaxis gedrag niet lang na de eerste 10 seconden na het verrassende (dwz vliegen begon bewegen in alle richtingen 10 sec na verrassende hen). De minimale afstand beklommen door controle vliegen (dus 1 week oud vliegt uiting van de THGal4 driver, zie legenda van figuur 1) in dit tijdvenster was 2 cm. Zo gebruikten we de 2 cm merk als een referentie voor het analyseren van de klimactiviteiten van vliegen van verschillende leeftijden en genotypes 10 seconden na het starten van het gedrag. Deze parameters vereisen aanpassing rekening met verschillen in het gedrag van de geteste vliegen (door bijvoorbeeld verschillende genetische achtergronden of laboratoriumomstandigheden). Merk op dat in onze testomstandigheden, alle geteste genotypes slechter uitgevoerd of op dergelijke wijze aan de vliegen van de controle genotype. </li><li> Bereken het gemiddelde van de resultaten van de vijftientrials. </li><li> Express gemiddelde als percentage van het totale aantal vliegen in de buis (= klimmen% activiteit), het aantal herhalingen (N) wordt gegeven door het aantal geteste per genotype onafhankelijke cohorten </li><li> Beoordelen statistische significantie tussen verschillende genotypen in de tijd. Dit kan worden bereikt met een Student&#39;s t-test (bij vergelijking van twee genotypen) of een 2-weg ANOVA analyse gevolgd door Bonferroni post hoc test (bij het ​​uitvoeren van meerdere vergelijkingen) met commerciële software zoals GraphPad (GraphPad Software, Inc.La Jolla, CA, USA). </li></ol></li></ol> Nota Wij voeren al onze tests op hetzelfde tijdstip van de dag, bij kamertemperatuur en onder dezelfde lichtomstandigheden. Houd de vliegen in een 12 uur licht / donker cyclus omgeving raadzaam te controleren voor het effect van circadiaanse ritmes van de vliegen locomotorisch gedrag. 2. Tyrosinehydroxylase ImmunofluorescentieAssay van Whole Brain Mounts Oplossingen en buffers Fixatief: 4% paraformaldehyde (PFA) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) Wasbuffer 0,1% Triton X-100 in PBS Blocking buffer: 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100 en 0,5% BSA Montage media: Mowiol-Dabco (zie protocol in Harlow E, Lane D., Antibodies-A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 10:418 (1988 beschreven)) Procedure <ol><li> Zet vliegen in een dissectie schotel gevuld met 70% EtOH gedurende ongeveer 1 min. tot de cuticula was te verwijderen. </li><li> Transfer vliegt naar een andere dissectie schotel gevuld met ijskoude PBS. </li><li> Ontleden van de hersenen: <ol type="a"><li> Plaats het vliegen met de ventrale zijde naar boven (optioneel: verwijder vleugels en poten). </li><li> Trek het hoofd van het lichaam: gebruik een set van tang omvasthouden aan het lichaam en een ander te houden aan de cuticula onder oogletsel de hersenen te voorkomen </li><li> Verwijder de slurf. </li><li> Hou het hoofd cuticula aan weerszijden van de spleet opengelaten na verwijdering van de zuigorganen en trek in tegengestelde richting totdat de hersenen verwijderd uit de kop capsule. </li><li> Verwijder alle cuticula van de hersenen. </li><li> Verwijder alle lucht gevulde tracheaweefsel, dit zal voorkomen dat de hersenen van zweven tijdens de volgende incubatie stappen. </li></ol></li><li> Snijd een paar millimeter van de punt van een P-200 pipetpunt en equilibreren met een 0,1% Triton X-100/PBS oplossing </li><li> Het bereide P-200 pipet, breng de hersenen om een ​​0,5 ml Eppendorf buis gevuld met 0,5 ml van 4% PFA / PBS en op ijs bewaren totdat de dissectie is voltooid. </li><li> Bevestig de hersenen bij RT gedurende 20 min: breng een zachte rotatie door de invoering van de Eppendorf buisjes op een rek en het plaatsen van het rek op een nutator. </li><li> Verwijder het fixeermiddelmet behulp van een P-1000 micro pipet, voeg 0,5 ml 0,1% Triton X-100/PBS, meng door omkeren en laat incubeer gedurende 1 min.; herhaal deze wasstap eenmaal. </li><li> Verwijder de buffer van de tweede wasbeurt, voeg 0,5 ml 0,1% Triton X-100/PBS en laat incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min; herhaal deze stap tweemaal. </li><li> Verwijder de wasbuffer en laat de hersenen incuberen in blokkerende buffer (0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,1% Triton X-100 en 0,5% BSA) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Incubeer de hersenen met een 1:100 verdunning van anti-TH-antilichaam (zie &quot;Tabel reagentia&quot;) in blockingbuffer, gedurende twee dagen bij 4 ° C onder zachtjes rotatie (zie stap 2.6.). </li><li> Herhaal wasstappen 2.7. en 2,8 .. </li><li> Equilibreren van de hersenen met een 1:200 verdunning van secundair antibodyin blokkerende oplossing gedurende twee dagen bij 4 ° C onder zachtjes rotatie. </li><li> Herhaal wasstappen 2.7. en 2,8 .. </li><li> Bereid de montage dia zie figuur 2A: <ol type="a"><li> Eendd 2 X 25 pl druppels montage media om een ​​dekking van glas (24 x 60 mm, nee. 1.5). </li><li> Plaats twee dekglaasjes (18 x 18 mm, geen. 2) op de montage media verlaten van een gat in het midden van de dia en laat drogen. </li></ol> Mee. Controleer de monsterhouder op het podium van de confocale microscoop. U kunt de dekking van glas te maken van dezelfde grootte van een 25 x 75 mm dia door het aanbrengen van een 22 x 22 mm 1.5 dekglas aan een van de uiteinden (gebruik nagellak en tape). </li><li> Verwijder de wasbuffer, voeg 50 ul van fixeermiddelen en laat de hersenen equilibreren om vóór en neer te pipetteren. </li><li> Met behulp van een cut P-200 pipet tip (zie stap 2.4) overdracht van de hersenen om de dia in de ruimte tussen de twee dekglaasjes en bedek ze met een dekglaasje nee. 1.5 (zie Figuur 2A, te oriënteren de hersenen op de dia zie 7). Opmerking: de monsters worden gemonteerd tussen twee dekglaasjes tot visualisatie van zowel de voorste en de poste toestaanrior kant van de hersenen. </li><li> Vult de hele ruimte tussen de deksel glazen met montage media; pipet van de ene hoek naar de lucht te verwijderen, laten drogen en afdichting met nagellak. </li><li> Om het aantal dopaminerge neuronen te beoordelen in een bepaald cluster verwerven van een reeks optische doorsneden langs de z-as met een 1,0 um stapgrootte met behulp van een confocale microscoop (de anatomische identificatie van dopaminerge clusters in Drosophila volwassen hersenen zie 7). </li></ol>

<ol><li>Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly,, Botella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine-dependent+neurodegeneration+in+Drosophila+models+of+familial+and+sporadic+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).</li>
<li>Feany, M. B., Bender, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Nature. 404, 394-398 (2000).</li>
<li>Friggi-Grelin, F., Coulom, H., Meller, M., Gomez, D., Hirsh, J., Birman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+in+Drosophila+dopaminergic+cells+using+regulatory+sequences+from+tyrosine+hydroxylase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression in Drosophila dopaminergic cells using regulatory sequences from tyrosine hydroxylase.</a> J. Neurobiol. 54, 618-627 (2003).</li>
<li>Gargano, J. W., Martin, I., Bandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+iterative+negative+geotaxis+%28RING%29%3A+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li>
<li>Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+in+the+study+of+human+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neurol.+Disord.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration.</a> CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 504-523 (2010).</li>
<li>Lundell, M., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spacial+development+of+serotonin+and+dopamine+neurons+in+the+Drosophila+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporal and spacial development of serotonin and dopamine neurons in the Drosophila CNS.</a> Dev. Biol. 165, 385-396 (1994).</li>
<li>Mao, Z., Davis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eight+different+types+of+dopaminergic+neurons+innervate+the+Drosophila+mushroom+body+neuropil%3A+anatomical+and+physiological+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity.</a> Front Neural Circuits. 3, 5(2009).</li>
<li>Mizuno, H., Fujikake, N., Wada, K., Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-Synuclein+Transgenic+Drosophila+As+a+Model+of+Parkinson%27s+Disease+and+Related+Synucleinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">Alpha-Synuclein Transgenic Drosophila As a Model of Parkinson's Disease and Related Synucleinopathies.</a> Parkinsons Dis. 2011, 212706(2011).</li>
<li>Neckameyer, W. S., Woodrome, S., Holt, B., Mayer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+and+senescence+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Aging%22%5BJournal%5D)">Dopamine and senescence in Drosophila melanogaster.</a> Neurobiol. Aging. 21, 145-152 (2000).</li>
<li>Trinh, K., Moore, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+phase+II+detoxification+pathway+suppresses+neuron+loss+in+Drosophila+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Induction of the phase II detoxification pathway suppresses neuron loss in Drosophila models of Parkinson's disease.</a> J. Neurosci. 28, 465-472 (2008).</li>
<li>White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dopaminergic+system+in+the+aging+brain+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila.</a> Front Neurosci. 4, 205(2010).</li>
<li>Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+pioneer+a+new+approach+to+drug+discovery+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson's disease.</a> Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+dissecting+Drosophila+melanogaster+brains+for+live+imaging+or+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).</li>
<li>Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+activation+of+Nrf2+signaling+is+sufficient+to+ameliorate+neurodegenerative+phenotypes+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).</li>
</ol>

We verklaren dat we geen concurrerende financiële belangen.

De assays beschreven een nuttige benadering van de rol van specifieke genen te bestuderen signaaltransductiewegen of kleine verbindingen in het onderhoud van DA neuronen bij veroudering en verschillende ziekte-gekoppelde genetische achtergronden (beoordeeld in 5). De schrikken geïnduceerde negatieve geotaxis gedrag van Drosophila is uitgebreid gebruikt als een functionele uitlezing voor de functionaliteit van DA neuronen in verschillende genetische achtergronden, vooral i...

De specificiteit van de assays beschreven gebaseerd op het gebruik van een Gal4 vlieg lijn die de regulerende sequenties van de tyrosine hydroxylase gen specifieke expressie in dopaminerge neuronen 3 bereiken exploiteert. Tyrosine hydroxylase katalyseert de eerste en snelheidsbepalende stap in dopamine synthese. TH immunoreactiviteit in de volwassen vliegen hersenen overlapt met dat van dopamine, waardoor TH een goede kandidaat om DA neuronen in vivo (zie voorbeeld 6) te identificeren. Bovendien, het expressiepatroon van THGal4 is specifieker dan andere Gal4 lijnen zoals DdcGal4 die regulerende sequenties bevat van het dopa decarboxylase gen en rijdt transgene expressie niet alleen in DA neuronen, maar ook in serotonerge neuronen en gliacellen subsets van 3 . Feany en Bender (2000) voor het eerst waargenomen dat de pan-neuronale expressie van het Parkinson-gerelateerde menselijke α-synucleïne gen versnelt het progressief verlies van startle-geïnduceerde negatieve geotaxis gedrag in Drosophila. We hebben soortgelijke resultaten met behulp van de DA-neuron specifieke THGal4 lijn naar de expressionof een α-synucleïne transgen 10 rijden geobserveerd en gebruikt dit functionele uitlezing aan de neuroprotectieve rol van de Nrf2 pathway in deze studie Drosophila model van PD 14. De specifieke assay beschreven wordt aangepast van 2 en 3. De Drosophila hersenen bevatten meer dan 100 DA neuronen, gerangschikt in ten minste 5 verschillende clusters (PPL1, PPL2, PAL, ppm1 / 2, ppm3) die volledige hersenen mounts kan worden gevisualiseerd door confocale microscopie (zie voorbeeld 11 en 7). Het is nog steeds controversieel of het aantal DA neuronen in de Drosophila hersenen afneemt met de leeftijd 9, 11, maar wordt leeftijdsafhankelijke neurodegeneratie waargenomen bij vliegen wanneer PD-gebonden genen gemuteerd / overexpressie op menselijke ziekten modelleren5. De expressie van humaan α-synucleïne in DA neuronen heeft zo&#39;n effect en derhalve is gebruikt als een model voor PD. Hier beschrijven we een test voor DA neuronen tellen in hele brein mounts met TH als een cel marker. Deze test is aangepast van 13 en 10.

<table><tbody><tr><td>Konijn anti-tyrosine hydroxylase antilichaam</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>Donkey TRITC-gelabeld anti konijn IgG antilichaam</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-026-152</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma</td><td>D2522</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Apparatuur</td></tr><tr><td>Polystyreen vials</td><td>VWR</td><td>89092-734</td><td>28.5 x 95 mm</td></tr><tr><td>Digitale camera</td><td>Canon</td><td>PowerShot A3100IS (model)</td><td>12.1 Megapixels 4X Optische Zoom</td></tr><tr><td>Glazen dekglas nr. 1.5</td><td>VWR</td><td>48366 205 48393 252</td><td>Maten: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm</td></tr><tr><td>Glazen dekglas nr. 2</td><td>VWR</td><td>48368-040</td><td>Maat: 18 x 18 mm</td></tr><tr><td>Dissectie schotels</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70543-01</td><td>Grootte: 30 mm O.D.</td></tr><tr><td>Dumostar nr. 5 pincetten</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72705-01</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Stemi 2000 (model)</td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop</td><td>Leica</td><td>SP2 of SP5 (model)</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materiaaltafel.</td></tr></tbody></table>

het beoordelen neurodegenerative fenotypes in<em&gt; drosophila</em&gt; dopaminerge neuronen reduceert door klimmen testen en whole brain immunokleuring

Assessing Neurodegenerative Phenotypes in Drosophila Dopaminergic Neurons by Climbing Assays and Whole Brain Immunostaining

Drosophila melanogaster is een waardevolle modelorganisme om veroudering en pathologische degeneratieve processen te bestuderen in het zenuwstelsel. De voordelen van de vlieg als een experimenteel systeem omvatten de genetische traceerbaarheid, korte levensduur en de mogelijkheid te observeren en kwantitatief analyseren van complexe gedrag. De expressie van ziekte-gebonden genen in specifieke neuronale populaties van de Drosophila hersenen, kan worden gebruikt om menselijke neurodegeneratieve ziekten zoals Parkinson en Alzheimer 5 model. Dopaminerge (DA) neuronen zijn de meest kwetsbare neuronale populaties in het verouderen menselijke hersenen. Bij de ziekte van Parkinson (PD), de meest voorkomende neurodegeneratieve aandoening, de versnelde verlies van DA neuronen leidt tot een progressieve en onomkeerbare achteruitgang van motorische functie. Naast leeftijd en blootstelling aan giftige stoffen, is het verlies van DA neuronen versterkt door specifieke mutaties in de coderendeof promotorregio&#39;s van verschillende genen. De identificatie van dergelijke PD-geassocieerde allelen verschaft de experimentele basis voor het gebruik van Drosophila als een model voor neurodegeneratie van DA neuronen in vivo. Bijvoorbeeld, de expressie van de Parkinson-gerelateerde humane α-synucleine gen in Drosophila DA neuronen recapituleert sommige elementen van de menselijke ziekte, bijv. progressief verlies van DA neuronen en dalende motorische functie 2. Dienovereenkomstig is dit model met succes gebruikt om potentiële therapeutische targets te identificeren in PD 8. Hier beschrijven we twee assays die gewoonlijk zijn gebruikt om leeftijdsgebonden neurodegeneratie van DA neuronen te bestuderen in Drosophila: a climbing assay gebaseerd op het schrikken geïnduceerde negatieve geotaxis reactie en tyrosine hydroxylase immunokleuring van hele volwassen hersenen zwellend aantal DA neuronen toezicht op verschillende leeftijden. In beide gevallen, in vivo expressie van UAS tspecifiek ransgenes in DA neuronen worden bereikt door een tyrosine hydroxylase (TH) promoter-Gal4 driver lijn 3, 10.

We hebben de assays beschreven de rol van de stress beschermende Nrf2 signaalweg in een Drosophila model van PD 14. Dit model is gebaseerd op de expressie van het humane α-synucleine gen in DA neuronen met een TH Gal4 driver 2, 10. Figuur 1 toont een representatief resultaat van een schrikreactie geïnduceerde negatieve geotaxis (klimmen) test bij mannelijke vliegen die verschillende transgenen onder controle van de TH Gal4 driver. Alle geteste ...

Hier beschrijven we twee testen die zijn opgericht om leeftijdsafhankelijke neurodegeneratie van de dopaminerge (DA) neuronen studeren in<em&gt; Drosophila</em&gt;: Het klimmen / schrikken geïnduceerde negatieve geotaxis assay waarmee de functionele effecten van DA neuronen degeneratie en tyrosine hydroxylase immunokleuring die wordt gebruikt om DA neuronen in volledige hersenen mounts identificeren en tellen bestuderen.

Het beoordelen Neurodegenerative Fenotypes in<em&gt; Drosophila</em&gt; Dopaminerge neuronen reduceert door Klimmen Testen en Whole Brain Immunokleuring

Drosophila melanogaster is a valuable model organism to study aging and pathological degenerative processes in the nervous system. The advantages of the ...

Het algemene doel van deze procedure is om neurodegeneratie van dopaminerge neuronen in transgene drosophila te beoordelen. Dit wordt bereikt door eerst de gewenste transgenen tot expressie te brengen onder controle van de tyrosine hydroxylase promotor via het GAL four UAS systeem. De tweede stap van de procedure is om vliegen van het gewenste genotype te verzamelen, ze te scheiden op geslacht en ze te laten verouderen.De derde stap is om de klimactiviteit van vliegen te testen door negatieve geo-as naarmate ze ouder worden. De laatste stap is om het aantal dopaminerge neuronen te tellen vanuit gedissekteerde hersenen die op verschillende leeftijden zijn verzameld. Uiteindelijk zullen de resultaten veranderingen in het locomotief gedrag van het dier en in de grootte van hun populatie dopaminerge neuronen laten zien.De implicaties van deze aanpak strekken zich uit naar de therapie van neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Parkinson. Deze aanpak kan helpen bij het identificeren van neuroprotectieve genen en farmacologische interventies. Om de test op te zetten, selecteer leeftijdsgematchte vliegen van de gewenste genotypen. Scheid ze op geslacht en groepeer ze willekeurig in cohorten van 20 tot 30 dieren.Elk cohort vertegenwoordigt een statistische steekproef. Houd de cohorten op een 12 uur licht-donkercyclus om de effecten van circadiane ritmen op het locomotief gedrag te controleren, en bij een temperatuur die kan worden gerepliceerd in de testruimte. Vervang de flessjes van de cohorten om de twee tot drie dagen en test ze wekelijks op een consistent tijdstip.30 minuten voor de test, verdoof elk cohort met koolstofdioxide en breng ze over naar een gelabelde plastic buis gemaakt van lege voedselflesjes die met tape zijn verbonden. De vliegen zouden na vijf tot tien minuten wakker moeten zijn, maar volledig herstel van anesthesie varieert met leeftijd en genotype en moet worden geoptimaliseerd. Nu. Maak een hoogteschaal om achter de testflesjes te bekijken.Markeer afstanden tussen één en 20 centimeter op een stuk wit papier. Bevestig vervolgens de schaal op de juiste positie. Nu lijn de te testen buisjes uit tegen de schaal op ongeveer 20 tot 30 centimeter afstand.Plaats een digitale camera met een vierkante weergave van de flesjes. Zorg ervoor dat de labels op de buisjes en de schaal duidelijk in zicht zijn. Zodra gepositioneerd, start de opname en start een digitale timer.Tikt nu een paar seconden op een buisje. Alle vliegen zouden de bodem van de buis moeten verzamelen. Zorg ervoor dat je deze stap consistent uitvoert met dezelfde duur en dezelfde kracht gedurende het hele experiment.Na een minuut herhaal de knockdown opnieuw voor de tweede van 15 opeenvolgende proeven. Wanneer de 15 proeven allemaal zijn voltooid, breng de vliegen terug naar verse flesjes door de video's visueel te inspecteren. Tel voor elk van de 15 proeven die per cohort zijn uitgevoerd, het aantal vliegen boven de twee centimeter markering.Nadat er 10 seconden zijn verstreken, wordt de twee centimeter markering empirisch bepaald, het is de afstand die alle controles na 10 seconden bij veel van de geteste leeftijden oversteken. Neem het gemiddelde score van de 15 proeven en druk dit uit als een percentage van de cohortleden dat de markering overstak. Het aantal statistische herhalingen is gelijk aan het aantal geteste cohorten voor elke groep, niet door de 15 proeven.Beoordeel de statistische significantie tussen verschillende genotypen met behulp van een student's T-test, ANOVA of andere geschikte analysemethoden. Plaats vliegen in een dissectieschaal met 70% ethanol gedurende ongeveer een minuut. Om het cuticulawas te verwijderen.Breng de vliegen vervolgens over naar een andere dissectieschaal gevuld met ijskoud PBS en ga verder met het dissecteren van de hersenen. Plaats de vlieg met de ventrale kant omhoog en verwijder eventueel de vleugels en poten. Gebruik een set pincetten om het lichaam vast te houden en een andere om de cuticula onder het oog vast te houden.Trek vervolgens het hoofd van het lichaam. Verwijder vervolgens de probos door het van het hoofd te trekken. Grijp vervolgens de hoofdcuticula aan tegenoverliggende randen van het nieuwe gat en trek in tegengestelde richtingen totdat de hersenen uit de hoofdcapsule zijn verwijderd.Verwijder nu delicaat de resterende cuticula van het oppervlak van de hersenen. Verwijder vervolgens al het luchtgevulde tracheale weefsel. Dit voorkomt dat de hersenen tijdens de volgende incubatiestappen drijven.Bereid een hersenafhandelingspipet voor vanuit een P 200 pipettentip. Snijd een paar millimeter af en breng in evenwicht met 0,1% Triton X 100 in PBS. Breng de hersenen over naar een half milliliterbuisje volledig gevuld met 4% PFA in PBS.Fixeer de hersenen bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten met zachte rotatie. Na 20 minuten, gebruik een P 1000 pipettentip om het fixeermiddel te vervangen door een halve milliliter wasbuffer van 0,1% Triton X 100 in PBS. Meng door middel van inversie en laat de hersenen gedurende één minuut incuberen voordat u de wasbuffer vervangt.Na een minuut, vervang de wasbuffer een tweede keer en incubeer de hersenen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens vervang de wasbuffer voor de derde keer en incubeer de hersenen nog eens 20 minuten. Verwijder nu de wasbuffer en laat de hersenen een uur in een halve millimeter blokkeerbuffer incuberen bij kamertemperatuur.Na een uur, voeg een een-op-honderd verdunning van antit antilichaam toe in blokkeeroplossing. Laat het twee dagen incuberen bij vier graden Celsius met zachte rotatie. Om het blok te verwijderen, herhaal de wasbeurten die worden gebruikt om de fixatie te verwijderen.Equilibreer vervolgens de hersenen met een halve milliliter van een een-op-tweehonderd verdunning van secundair antilichaam in blokkeeroplossing gedurende twee dagen bij vier graden Celsius met zachte rotatie. Enkele dagen later, verwijder het secundaire antilichaam met behulp van dezelfde wasprocedure. Om de montageschijven voor te bereiden, voeg 2 25 microliter druppels

assessing-neurodegenerative-phenotypes-drosophila-dopaminergic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Gedrag assays voor het meten van motorische functies, leren en geheugen capaciteiten...

Het testen van Beweegwijzer, leren en geheugen Tekortkomingen in Drosophila Modellen van Neurodegeneratie

Deze video beschrijft een eenvoudige methode om vliegbeweging te kwantificeren en toont de uitgevoerde klimtest.  De vliegklimtest is een algemene test van de motorische functie die afhankelijk is van een negatieve geotaxis-respons.

Fly Climbing Assay: een methode om algemene voortbeweging in Drosophila melanogaster te testen

We presenteren een geoptimaliseerde, goedkope en betrouwbare negatieve geotaxistest in Drosophila melanogaster als model voor neurodegeneratieve aandoeningen. Omdat deze test gevoeliger is voor lichte locomotieve defecten, zal deze helpen bij het screenen op mogelijke genetische interacties en doelwitten voor geneesmiddelen.

Kwantitatieve Analyse van Klimmen Defecten in een Drosophila model van neurodegeneratieve aandoeningen

Drosophila wordt veel gebruikt als een modelsysteem om neurodegeneratie. Dit protocol beschrijft een methode waarbij degeneratie, zoals bepaald door vacuole-vorming in de hersenen, kan worden gekwantificeerd. Het minimaliseert ook effecten als gevolg van de experimentele procedure van de verwerking en snijden controle en experimentele vliegen als een monster.

Mass histologie te kwantificeren Neurodegeneratie in<em&gt; Drosophila</em

Dit protocol beschrijft de dissectie en immunokleuring van volwassen Drosophila melanogaster brain weefsels. Dit protocol benadrukt in het bijzonder het gebruik van Drosophila paddestoel lichaam en fotoreceptor neuronen als voorbeeld neuronale subsets kunt weergeven die nauwkeurig kunnen worden gebruikt voor het ontdekken van de algemene beginselen die ten grondslag liggen aan vele aspecten van neuronale ontwikkeling.

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Dit stapsgewijze protocol analyseert Drosophila negatieve geotaxis gedrag met behulp van een geautomatiseerd systeem van meerdere cilinders die honderden vliegen en synchroniseert hun optreden door een elektromotor. Bij synchronisatie, is vliegen negatieve geotaxis gedrag vehiculumcontrolegroep, digitaal opgenomen en geanalyseerd met behulp van de zelf ontworpen RflyDetection software.

Een geautomatiseerde snelle iteratieve negatieve Geotaxis Assay voor het analyseren van volwassen klimmen gedrag in een Drosophila Model van neurodegeneratie

Hebben we een eenvoudige en flexibele workflow om kwantitatieve gegevens extract van fluorescentie imaging-gebaseerde cel biologische studies van aggregatie van eiwitten en autophagic flux in het centrale zenuwstelsel van Drosophila modellen van neurodegeneratie.

Kwantitatieve celbiologie van neurodegeneratie in Drosophila door onbevooroordeelde analyse van Fluorescently Tagged eiwitten met behulp van ImageJ

We presenteren een protocol met een voorwaartse genetische benadering van het scherm voor mutanten die neurodegeneratie in Drosophila melanogastertentoonstellen. Het bevat een klim test, histologie analyse, genmapping en DNA-sequencing om uiteindelijk nieuwe genen te identificeren die verband houden met het neuroprotectie proces.

In vivo genetisch scherm naar voren om nieuwe neuroprotectieve genen in Drosophila melanogaster te identificeren

Deze studie presenteert een vereenvoudigd protocol voor weefselverwerking met onthoofding, fixatie, cryosectie, fluorescentiekleuring, immunokleuring en beeldvorming, dat kan worden uitgebreid tot confocale en multifotonbeeldvorming. De methode behoudt een werkzaamheid die vergelijkbaar is met complexe dissecties, waarbij de noodzaak van geavanceerde motorische vaardigheden wordt omzeild. Kwantitatieve beeldanalyse biedt een uitgebreid onderzoekspotentieel.

Directe cryosectie van Drosophila-koppen voor verbeterde kleuring en immunokleuring van de hersenen

Het protocol presenteert een high-throughput, kosteneffectieve methode voor het beoordelen van neurotoxiciteit in de fruitvlieg door middel van de kwantificering van locomotorische disfunctie als alternatief voor traditionele zoogdiermodellen. Het heeft tot doel de neurotoxische effecten van farmaceutische verbindingen, milieuagentia of genetische modificaties te evalueren met behulp van een gevoelig, reproduceerbaar en ethisch gunstig model.

Gedragsanalyse van locomotorische disfunctie bij Drosophila melanogaster als uitlezing voor neurotoxiciteit

Leer hoe je neurodegeneratie van dopaminerge neuronen beoordeelt in transgene Drosophila met klimtesten en tyrosinehydroxylase-immunokleuring. Deze methode helpt onderzoekers om motorisch gedrag en neuronpopulaties te kwantificeren.

Het beoordelen Neurodegenerative Fenotypes in Drosophila Dopaminerge neuronen reduceert door Klimmen Testen en Whole Brain Immunokleuring (Video) | JoVE Journal

Het beoordelen Neurodegenerative Fenotypes in

Meer video's verkennen