Name: Ex vivo methode voor High Resolution Imaging van Cilia Motility in Knaagdieren luchtwegepithelen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Leer een ex vivo methode voor hoogresolutiebeeldvorming van ciliamotiliteit in muizenluchtwegepithelen. Deze techniek maakt kwantitatieve analyse van trilhaarfrequentie en vloeistofstroming mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het project werd ondersteund door NIH-subsidie ​​U01HL098180 van de National Heart, Lung, and Blood Institute. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Heart, Lung, and Blood Institute of de National Institutes of Health

1. Reagentia Setup 1.1 Dissection en Imaging Medium Leibovitz L-15 medium (L15) aangevuld met FBS (10%) en penicilline-streptomycine (100 eenheden / ml penicilline G natrium en 100 ug / ml streptomycine sulfaat) wordt gebruikt zowel bij oogst en beeldvorming van trachea monsters. 2. Ondiepe Walled Cultuur Kamer Vergadering De kamer gebruikt trachea weefsel wordt getoond in figuur 1. De vloer van de kamer is de glazen bodem 35 mm cultuur schotel. De boven-en zijkant van de kamer wordt gegenereerd door het plaatsen van een klein stukje van 0,3 mm dik siliconen lakens over de glazen schaal. De rand van het vel wordt gesneden om de ronde bodem gerecht past en het centrum is verder getrimd tot een ondiepe centrale kamer te vormen (zie stappen 2.1-2.3). Bovenop dit samenstel, wordt een 18 mm rond dekglaasje geplaatst op een kast voor beeldvorming genereren. <ol><li> Volledig bedekken van een 18 mm ronde glazen deksel slip met een vierkant van 0,3 mm dik siliconen lakens. </li><li> Met standaard scherpe dissectie schaar knipt u de overtollige silicone beplating van rond de rand van het dekglas (resulterend in een cirkelvormige laag siliconen platen). </li><li> Met een scherp scalpel uitgesneden en verwijderen van een centraal plein van siliconen platen (ongeveer 10 vierkante mm) uit het midden van de overdekte dekglas (en vormt aldus de bovenkant en zijkanten van de beeldvorming kamer). </li></ol> 3. Luchtpijp Oogst en bereiding <ol><li> Euthanaseren muizen in overeenstemming met de lokale institutionele verzorging van dieren en gebruik commissie en / of de overheid richtlijnen en verwijder luchtpijp in een standaard plastic 35 mm cultuur schotel met voldoende L15 media te dompelen weefsel (auteurs hebben muizen gebruikt net vóór de geboorte bij een zwangerschapsduur van 16.5 dag, tot pasgeboren, neonatale en volwassen dieren 2). </li><li> Verwijder niet-trachea weefselschade te aan de buitenkant vande luchtpijp met stompe dissectie. </li><li> Verwijder het strottenhoofd met een dwarse snede net onder de cricoid kraakbeen met behulp van micro-dissectie schaar (Figuur 2A, lijn 1). </li><li> Verwijder de linker en rechter primaire bronchiale takken met een dwarse snede boven de carina met microdissectie schaar (Figuur 2A, lijn 2). </li><li> Houd het luchtpijp met fijn pincet en spoel het lumen 2-3 keer met ~ 1 ml van het zwemwater L15 medium met een P1000 Pipetman en P1000 tip om alle slijm en bloed te wissen. </li><li> Knip een 3-4 ringsegment van luchtpijp via een dwarse snede met micro dissectie schaar (Figuur 2B, lijn 1). </li><li> Snijd lengterichting door het midden van de trachealis spier van deze korte luchtpijp segment met behulp van micro dissectie schaar (Figuur 2B, lijn 2). </li><li> Snijd lengterichting door het midden van de tracheale kraakbeen ringen met behulp van micro-dissectie schaar (figuur 2C </strong&gt;, lijn), waardoor twee secties van trachea weefsel geschikt voor imaging (enkele sectie weergegeven in figuur 2D). </li></ol> 4. Cilia Imaging <ol><li> Transfer luchtpijp weefselsegmenten, lumen kant naar beneden, naar het midden van een 35 mm glazen bodem cultuur schotel met 100-200 ul van L-15 medium. </li><li> Kwantificeren cilia gegenereerde stroom een kleine hoeveelheid van fluorescente 0.20 urn microsferen de L-15 medium zwemmen de trachea weefselmonster (~ 1 x 10 11 deeltjes / ml of 20 ul / ml van het Fluoresbrite 2,5% waterige suspensie van microsferen). </li><li> Plaats de beeldvorming kamer voorheen opgesteld (zie Procedure 1-3 hierboven) op de bovenkant van de luchtpijp monster siliconen vel naar beneden, met de luchtpijp monster gelegen in het midden van de ondiepe ommuurde kamer gevormd door het raam gesneden in de siliconen platen (Figuur 1 ). </li><li> Druk voorzichtig op de dekglaasje aan vast te zetten en eventuele overmaat L-15 media te verwijderen uit de randen usinga P1000 tip en P1000 Pipetman. </li><li> Monteer de 35 mm glazen bodem cultuur schotel en luchtpijp monster op een omgekeerde microscoop met 100X objectieve en DIC optiek. </li><li> Met behulp van een high-speed camera en film acquisitie software verzamelt films van cilia beweeglijkheid bij 200 + frames per seconde langs de trilharen tracheale epitheel van de opgerold rand van de trachealis spier (vak E Figuur 2D geschetst: bijvoorbeeld stilstaand beeld uit opgenomen film) (Aanvullende Movie 1). </li><li> Met behulp van FITC epifluorescerende beeldvorming en een weinig licht CCD-camera (zie apparatuur lijst hierboven), het verzamelen van films van fluorescerende microbolletjes beweging over het oppervlak van de trilharen tracheale epitheel om later kwantificering van cilia opgewekte stroom (Aanvullend Movie 2) toestaan. </li></ol> 5. Kwantificering van Cilia Motiliteit <ol><li> Laad DIC belichte films in de ImageJ softwarepakket en volgens de procedure beschreven door I-techniekain Drummond 13 gebruiken de lijn tool om een raster lijn oversteken van het kloppend trilharen trekken. Een &quot;reslice&quot; van deze lijn genereert een kymograaf type afbeelding waar cilia beweging over de lijn genereert een golfpatroon. Het aantal pixels tussen elke golf piek is ze gemeten (een pixel = een filmbeeld) waaruit het aantal beats per minuut (dwz Hz) dan kan worden berekend. </li><li> Om cilia gegenereerde stroom belasting fluorescerende kraal films te meten in de ImageJ software pakket, en gebruik de MTrackJ plugin 14 om handmatig fluorescerende kralen bijhouden over het oppervlak van de luchtpijp epitheel en laat de software genereren kraal snelheid en richting voor elke kraal bijgehouden. </li></ol> Zorg moeten worden genomen bij het gebruik van fluorescerende kralen te stromen kwantificeren als de afstand van het kloppend trilharen kunnen sterk beïnvloeden gemeten stroom magnitude. De kraal beweging in Aanvullende Movie 2 is een goed voorbeeld van. In dit voorbeeld beadbeweging is snel aan het oppervlak van het verslaan van cilia en beduidend daalt af voor kralen verder weg in de baden media. Om controle hiervoor bead traceringen alleen worden op een vaste afstand boven de trilharen epitheel in alle monsters om correcte vergelijkingen worden gemaakt. Tenslotte, om representatieve gegevens over fluïdumstroming verkrijgen kralen worden bijgehouden voor zo lang mogelijk, we liever bead tracks die 10 + haarcellen bestemmen voor het berekenen van fluïdumstroming.

<ol><li>Stannard, W., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+function+and+the+role+of+cilia+in+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Aerosol.+Med%22%5BJournal%5D)">Ciliary function and the role of cilia in clearance.</a> J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).</li>
<li>Francis, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initiation+and+maturation+of+cilia+generated+flow+in+the+newborn+and+postnatal+mouse+airway%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">The initiation and maturation of cilia generated flow in the newborn and postnatal mouse airway.</a> American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, 1067-1075 (2009).</li>
<li>Aune, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+heterotaxy+with+single+ventricle+spectrum+of+cardiac+anomalies%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies.</a> Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).</li>
<li>Tan, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotaxy+and+complex+structural+heart+defects+in+a+mutant+mouse+model+of+primary+ciliary+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Heterotaxy and complex structural heart defects in a mutant mouse model of primary ciliary dyskinesia.</a> J. Clin. Invest. 117, 3742-3752 (2007).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+sequencing+identifies+the+gene+Megf8+with+ENU-induced+mutation+causing+heterotaxy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Massively parallel sequencing identifies the gene Megf8 with ENU-induced mutation causing heterotaxy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3219-3224 (2009).</li>
<li>Caruso, G., Gelardi, M., Passali, G. C., de Santi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+scraping+in+diagnosing+ciliary+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Rhinol%22%5BJournal%5D)">Nasal scraping in diagnosing ciliary dyskinesia.</a> Am. J. Rhinol. 21, 702-705 (2007).</li>
<li>Leigh, M. W., Zariwala, M. A., Knowles, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+ciliary+dyskinesia%3A+improving+the+diagnostic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Primary ciliary dyskinesia: improving the diagnostic approach.</a> Curr. Opin. Pediatr. 21, 320-325 (2009).</li>
<li>Delmotte, P., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+beat+frequency+is+maintained+at+a+maximal+rate+in+the+small+airways+of+mouse+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 110-117 (2006).</li>
<li>Choe, M. M., Tomei, A. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+3D+tissue+model+of+the+airway+wall+and+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Physiological 3D tissue model of the airway wall and mucosa.</a> Nat. Protoc. 1, 357-362 (2006).</li>
<li>Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Well-differentiated+human+airway+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Well-differentiated human airway epithelial cell cultures.</a> Methods Mol. Med. 107, 183-206 (2005).</li>
<li>You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+of+mouse+tracheal+epithelial+cells%3A+selection+of+a+proliferative+population%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).</li>
<li>Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupted+ciliated+epithelium+shows+slower+ciliary+beat+frequency+and+increased+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Respir.+J%22%5BJournal%5D)">Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia.</a> Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).</li>
<li>Drummond, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+cilia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying cilia in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 93 (08), 197-217 (2009).</li>
<li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+cell+and+particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Methods for cell and particle tracking.</a> Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).</li>
<li>Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-digital+image+capture+and+whole-field+analysis+of+ciliary+beat+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency.</a> J. Microsc. 211, 103-111 (2003).</li>
<li>Schwabe, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+ciliary+dyskinesia+associated+with+normal+axoneme+ultrastructure+is+caused+by+DNAH11+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mutat%22%5BJournal%5D)">Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations.</a> Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).</li>
<li>Shah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Bardet-Biedl+syndrome+proteins+alters+the+morphology+and+function+of+motile+cilia+in+airway+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).</li>
<li>Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+effect+on+the+ciliary+beat+frequency+of+human+nasal+and+tracheal+ciliated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+the+Cell+%2F+under+the+auspices+of+the+European+Cell+Biology+Organization%22%5BJournal%5D)">Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells.</a> Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).</li>
</ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

Meting van cilia slagfrequentie (CBF) is relatief eenvoudig met behulp van hoge microscoop doelstellingen vermogen en snelle image acquisitie hardware 13,15, en legt uit waarom CBF metingen vormen de basis van de meeste onderzoeken naar mucociliaire klaring tijdens gezondheid en ziekte. Hoewel CBF ook essentieel voor het begrijpen van mucociliaire klaring, meting van CBF alleen voorbij de onderliggende belang van beide ciliaire gegenereerde stroom en cilia slaan golfvorm, die beide zijn moeilijker te meten, w...

Analyse van beweeglijke cilia functie in het luchtwegepitheel is experimenteel belangrijk voor het ophelderen van de genetische en omgevingsfactoren die mucociliaire klaring en pulmonaire gezondheid 1 beïnvloeden. De eenvoudig protocol ontwikkeld voor de beeldvorming van de muis luchtwegepithelen biedt een efficiënte methode om de luchtwegen trilharen beweeglijkheid ondervragen in mutant en knockout muismodellen en vereisen alleen basisvaardigheden in muis tracheaweefsel dissectie en ex vivo beeldvorming van de luchtwegen trilharen beweeglijkheid met een hoge resolutie videomicroscopie. Dit protocol werd opgesteld en verfijnd tijdens een grootschalige muis mutagenese screen om een snelle evaluatie van de beweeglijke trilharen functie (cilia slagfrequentie, cilia verslaan vorm, cilia gegenereerde stroom) toelaten in mutanten met een aangeboren hartaandoening in verband met heterotaxy 2-5. Voor deze technieken om luchtwegen cilia beweeglijkheid studie kunnen worden gegroepeerd in hetzij de acute ex vivo aard of longer term in vitro experimentele benaderingen. Acute experimenten zijn ex vivo visualisatie van de menselijke neus / luchtwegen borstel biopten 6,7 en analyse van eenvoudige dwarse luchtwegen secties 8. De in vitro benaderingen gebruiken diverse celkweek technieken om vellen van gedifferentieerde trilharen epitheel, zoals in de lucht-water grensvlak culturen of luchtwegen suspensiekweken 9-11 genereren. Echter, deze luchtwegepitheel reciliation technieken vereisen zeer aanzienlijke investering in tijd en training voordat bruikbare gecilieerde epitheliale cellen worden geproduceerd in experimenten (4-6 weken 9,10). Terwijl acute ex vivo analyse van luchtwegepitheel borstel biopsies worden gewoonlijk gebruikt voor menselijke klinische studies, is deze methode niet bruikbaar muisstudies verergerd door mechanische weefselschade 12. De techniek die in dit protocol voor de analyse van mouse tracheale luchtwegepitheel is niet alleen eenvoudig te voeren, maar vereist geen speciale vaardigheden of dissectie gespecialiseerde inrichtingen naast die standaard beeldvormend videomicroscopie. Er zijn veel voordelen aan deze eenvoudig protocol. Ten eerste, omdat de muis trachea weefsel oogsten is snel en eenvoudig uit te voeren, is het mogelijk een snelle vaststelling van de luchtwegen cilia functie in een groot aantal muizen. Dit zijn acute analyse van de korte termijn effecten van verschillende in vitro behandelingen. Ten tweede wordt een ex vivo techniek de trilharen luchtwegepitheel bevestigd blijft aan het onderliggende steunweefsel en daarmee geassocieerde signaaltransductie wegen behouden. Daarom in vergelijking met in vitro reciliated luchtwegepitheel, dit preparaat is een betere weergave van de natuurlijke in vivo weefselmilieu. Ten derde, dit protocol kan de verwerving van een aantal verschillende kwantitatieve parameters die de objectieve beoordeling van beweeglijke cilia f kan biedenzalving. Tenslotte, in tegenstelling tot andere methoden voor de luchtwegen trilharen visualisatie Dit protocol maakt visualisatie van de cilia loodrecht op de trilharen ritme richting, waardoor profiel te bekijken van de cilia die optimaal is voor een hoge resolutie afbeelding van cilia beat en metachronalgolven golfopwekking . Dit protocol kan worden gemodificeerd op een aantal manieren om een ​​groot aantal experimentele behoeften zoals de rol van farmacologische middelen, genetische factoren, omgevingsfactoren blootstelling en / of mechanische factoren zoals mucus belast luchtwegen trilharen functie en productie / onderhoud pakken luchtwegen trilharen beat en metachronalgolven golfvoortplanting.

<table><tbody><tr><td>Leibovitz&rsquo;s L-15 Medium </td><td>Invitrogen</td><td>21083-027</td><td>Geen fenolrode kleurstof </td></tr><tr><td>Fetal bovien serum </td><td>Hyclone</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine </td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2x fijne pincetten </td><td>Roboz</td><td>RS-4976</td><td></td></tr><tr><td>Dissectie schaar </td><td>Roboz</td><td>RS-5676</td><td></td></tr><tr><td>Micro dissectie schaar </td><td>Roboz</td><td>RS-5620</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel </td><td>Roboz</td><td>RS-9801-15</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipetman </td><td>Gilson, Inc</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>P1000 tips </td><td>Molecular BioProducts</td><td>2079E</td><td></td></tr><tr><td>18 mm ronde glazen deksels </td><td>Fisher Scientific</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>Plastiek 35 mm kweekschalen </td><td>Corning</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>Glazen bodem 35 mm kweekschalen </td><td>Warner Instruments</td><td>W3 64-0758</td><td></td></tr><tr><td>Siliconen plaat 0,012" (0,3 mm) dik </td><td>AAA Acme Rubber Co</td><td>CASS-.012X36-63908</td><td></td></tr><tr><td>0,20 &mu;m diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microsferen </td><td>Polysciences</td><td>09834-10</td><td></td></tr><tr><td>Inverteer microscoop, met 100x olie objectief en DIC filters </td><td>Lecia</td><td>DMIRE2</td><td>Merk is niet kritiek. </td></tr><tr><td>100-watt kwiklamp, epifluorescente FITC excitatie/emissie filters</td><td>Lecia</td><td></td><td>Merk is niet kritiek.</td></tr><tr><td>Microscoop standaard Incubator</td><td>Lecia</td><td>11521749</td><td>Niet vereist als er cilia bij kamertemperatuur worden afgebeeld</td></tr><tr><td>Hoge snelheid camera helder veld </td><td>Vision Research</td><td>Phantom v4.2</td><td>Merk is niet kritiek. Moet sneller zijn dan 125 fps</td></tr><tr><td>Hoge snelheid fluorescentie camera </td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-12</td><td>Merk is niet kritiek. Moet sneller zijn dan 10 fps</td></tr><tr><td>Filmanalyse software</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ met MtrackJ plugin</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo methode voor high resolution imaging van cilia motility in knaagdieren luchtwegepithelen

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

Een ex vivo techniek voor beeldvorming muis luchtwegepitheel voor de kwantitatieve analyse van beweeglijke cilia functie belangrijk inzicht in mucociliaire klaring functie werd vastgesteld. Vers geoogste muis luchtpijp wordt overlangs doorgesneden de trachealis spieren en gemonteerd in een ondiepe ommuurde kamer op een glazen bodem schotel. De trachea monster geplaatst langs zijn lengteas te profiteren van de trachealis spier langsrichting krullen. Dit maakt beeldvorming van ciliaire beweging in het profiel te bekijken langs de gehele tracheale lengte. Video met 200 frames / sec worden verkregen met behulp van differentieel interferentie contrast microscopie en een hoge-snelheid digitale camera aan de kwantitatieve analyse van cilia slagfrequentie en ciliaire golfvorm laten. Met de toevoeging van fluorescerende kralen tijdens beeldvorming, cilia gegenereerd fluïdumstroming ook kan worden bepaald. Het protocol tijd omspant ongeveer 30 minuten, met 5 min voor Kamer voorbereiding, 5-10 minuten voor het monstermontage en 10-15 min bij videomicroscopie.

Controle luchtwegen trilharen moet duidelijk zichtbaar zijn en gezien te verslaan in een gecoördineerde wijze (Aanvullende Film 1; filmweergave wordt vertraagd tot 15% real-time), met merkbare stroming in de richting van cilia beat (aanvullende Movie 2; filmweergave is 100% real time). Kwantificering van cilia films moeten de resultaten vergelijkbaar met dat in figuur 3 opleveren. Collectie van high-speed DIC films maakt de kwantificering van cilia slagfrequentie <stron...

Een eenvoudige en betrouwbare techniek voor het visualiseren en kwantificeren luchtwegen trilharen beweeglijkheid en trilharen gegenereerde stroom met behulp van de muis luchtpijp wordt beschreven. Deze techniek kan worden aangepast om te bepalen hoe een groot aantal factoren beïnvloeden cilia motiliteit, zoals farmacologische agentia, genetische factoren, omgevingsfactoren blootstelling en / of mechanische factoren zoals slijm belasting.

Ex vivo methode voor High Resolution Imaging van Cilia Motility in Knaagdieren luchtwegepithelen

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Het algemene doel van deze procedure is het visualiseren en kwantificeren van de respiratoire CLIA-motiliteit en de door CLIA gegenereerde stroom met behulp van vers geïsoleerde muistrachea. Dit wordt bereikt door eerst een ondiepe beeldkamer voor te bereiden. De volgende stappen van de procedure bestaan uit het oogsten en monteren van het tracheale weefsel voor beeldvorming.Vervolgens wordt aangetoond hoe de motiliteit van C en de door CLIA gegenereerde stroming kunnen worden gevisualiseerd en geregistreerd met behulp van een geïnverteerde microscoop met hogesnelheidsvideografie via een 100 XDIC-objectief. De laatste stap is het analyseren van de video door de slagfrequentie van CLIA en de door CLIA gegenereerde stroming te kwantificeren met Image J-software. Uiteindelijk kunnen de resultaten veranderingen in de motiliteit van respiratoire CLIA en de door CLIA gegenereerde stroming aantonen via hogesnelheidsvideomicroscopie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat het reproduceerbare beeldvorming van het tracheale epitheel van knaagdieren mogelijk maakt voor consistente kwantitatieve beoordelingen van de ciliaire beweging. Dit kan binnen 20 tot 30 minuten worden gerealiseerd met minimale training. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de cellulaire en moleculaire mechanismen die de mucusklaring in de luchtwegen reguleren, vooral wanneer deze wordt gebruikt in combinatie met verschillende genetisch gemodificeerde en mutante muismodellen.Begin met het bouwen van de kamer die wordt gebruikt om de trachea-monsters vast te houden voor een basis of een kamerbodem. Gebruik een glazen kweekschaal van 35 millimeter voor de bovenkant. Gebruik siliconevellen met een dikte van 0,3 millimeter.Leg de folie over een rond glazen dekglas van 18 millimeter en trim de rand. Snijd vervolgens met een scalpel vanuit het midden van de siliconen een vierkant van 10 millimeter uit. Het glazen dekglas en de siliconen vormen de bovenkant en de zijden van de kweekkamer.Deze worden bovenop het monster geplaatst dat in de kweekschaal is aangebracht. Isoleer de trachea chirurgisch nadat een muis is geëuthanaseerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen. Verzamel de trachea in een plastic kweekschaal van 35 millimeter met voldoende L 15-medium om deze volledig onder te dompelen.Verwijder met behulp van botte dissectie al het niet-tracheale weefsel rondom de trachea. Verwijder vervolgens met microdissectieschaar de larynx met een transversale snede net onder het ringkraakbeen. Verwijder nu de linker- en rechter hoofdbronchiën met een transversale snede net boven de carina met een fijne pincet.Houd de trachea voorzichtig vast. Spoel vervolgens het lumen twee of drie keer door met L 15 medium met behulp van een pipette van één milliliter om eventueel slijm en bloed te verwijderen. Maak daarna met microdissectieschaartjes een transversale snede om een segment van drie of vier trachea-ringen te verwijderen.Maak vervolgens in het kleine trachealsegment een longitudinale snede door het midden van de tracheale spier. Snijd tot slot longitudinaal door het midden van de tracheale kraakbeenringen met een microdissectieschaar, zodat er twee secties tracheaal weefsel overblijven die geschikt zijn voor beeldvorming. Breng na de dissectie de tracheale weefselsegmenten met de lumenzijde naar beneden over naar het midden van de glazen bodemschaal met ongeveer 100 microliters L 15.Om de door CLIA gegenereerde stroom te kwantificeren bij 20 microliters van een 2,5% suspensie van fluorescerende microsferen per milliliter L 15 medium. Plaats nu de siliconen- en glazen afdekking over de trachea en duw deze voorzichtig aan om deze op zijn plaats te fixeren. Verwijder vervolgens langs de randen alle overtollige media met een pipette van één milliliter.Breng de kamer nu over naar een omgekeerde microscoop die is uitgerust met een 100 x objectief en DIC-optiek. Leg met behulp van een hogesnelheidscamera en software voor video-acquisitie beelden vast van de CLIA-motiliteit met meer dan 200 frames per seconde langs het gecilieerde trache-epitheel van de opgerolde rand van de trachespier. Leg met behulp van FS e epi-fluorescentie-imaging en een CCD-camera voor zwak licht beelden vast van de fluorescerende microsfeer die zich over het oppervlak van het gecilieerde trache-epitheel beweegt.Gebruik deze video's om over te gaan tot de kwantificering van de door CLIA gegenereerde flow. Monsters kunnen tot een uur worden afgebeeld zonder dat er een merkbare verandering in de CLIA-beatfunctie optreedt. Begin met het berekenen van de CLIA-beats per minuut. Laad de DIC-afgebeelde video's in het Image J-softwarepakket.Volg de techniek zoals beschreven door Aian Drummond. Gebruik het lijninstrument om een rasterlijn te trekken. Steek door de kloppende cilia.Maak een resolutieslice van deze lijn om een grafiekachtig beeld te genereren waarbij de beweging van CA over de lijn een golfpatroon veroorzaakt. Tel nu het aantal pixels tussen elke golfpiek langs deze lijn. Gebruik deze telling.Bereken het aantal slagen per minuut, wetende dat elk filmframe wordt weergegeven door één pixel langs de lijn. Meet vervolgens de door C Cate gegenereerde flow. Laad de films van de fluorescerende kralen in het softwarepakket Image J.Gebruik de MT track J-plugin om de fluorescerende kraaltjes over het oppervlak van het trachee-epitheel handmatig te volgen. De software berekent de snelheid en directionaliteit voor elk gevolgd kraaltje. Let er nauwkeurig op dat de afstand tot de gecilieerde cellen de gemeten stroomsnelheid sterk kan beïnvloeden.In dit voorbeeld is de beweging van de kraaltjes snel aan het oppervlak van de cilia die de kraaltjes voortbewegen en neemt deze af voor kraaltjes die verder weg in het omhullende medium liggen; om hiervoor te corrigeren, moeten de trajecten van de kraaltjes in alle monsters op een vaste afstand boven het gecilieerde epitheel worden verzameld, zodat correcte vergelijkingen kunnen worden gemaakt. Volg ten slotte de kraaltjes zo lang mogelijk om de vloeistofstroom te bepalen. Het is bij voorkeur aanbevolen om kraaltjes te gebruiken die langs meer dan 10 gecilieerde cellen bewegen om deze berekeningen uit te voeren.Bij gebruik van het beschreven protocol zouden de cilia van de controleluchtweg duidelijk zichtbaar moeten zijn en een gecoördineerde beweging moeten vertonen. Evenzo zou er een merkbare stroom in de richting van de slag moeten zijn. Gewoonlijk maakt het verzamelen van DIC-films met hoge snelheid de kwantificering van de slagfrequentie van de cilia mogelijk en levert dit kwalitatief goede beelden op.Voor kwalitatieve beoordeling van de vorm van CLIA-beads. De tracking van fluorescerende beads biedt een meting van de door CLIA gegenereerde stroomsnelheid. De directionaliteit wordt berekend door de totale verplaatsing van een fluorescerende bead te delen door de lengte van het spoor van een fluorescerende bead.Zo scoort een rechte trajectlijn één punt, terwijl een kronkelend pad een veel lagere waarde scoort. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de trachea-spier volledig te ontdoen van al het omringende bind- en vetweefsel voordat er wordt gesneden.Omdat het opkrullen van de trachea-spier na het doorsnijden essentieel is voor het positioneren van de respiratoire CLIA voor een optimale visualisatie. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals farmacologische studies, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe of waarom farmacologische middelen de respiratoire C-activiteit moduleren?

ex-vivo-method-for-high-resolution-imaging-cilia-motility-rodent

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Al Omran, A. J., et al. Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (2015). This video demonstrates a live-imaging technique using differential interference contrast (DIC) microscopy to observe the beating of ependymal cilia in sagittal mouse brain sections. Ependymal cilia propel cerebrospinal fluid (CSF), and their activity is recorded in brain sections maintained in a nutrient-rich medium and imaged in a climate-controlled chamber.

Live Imaging of Ependymal Cell Ciliary Activity in a Mouse Brain Section

Opklaren is een krachtige tool waarmee beeldvorming verschillende biologische processen in levende dieren. In dit artikel presenteren we een gedetailleerde werkwijze voor het afbeelden van de dynamiek van subcellulaire structuren, zoals de secretoire granules in de speekselklieren van levende muizen.

Intravitale Microscopy for Imaging Subcellulaire Structuren in Levende muizen die fluorescerende eiwitten

Met behulp van hoge-resolutie differentiële interferentie contrast (DIC) microscopie, is een ex vivo observatie van de afstraffing van beweeglijke ependymale cilia gelegen binnen de hersenen van muizen ventrikels aangetoond live-imaging. De techniek maakt een opname van het unieke ciliaire slaan frequentie en hoek slaan en hun intracellulaire calcium oscillatie stimulatie eigenschappen.

Live-Imaging van de Ependymale Cilia in de laterale ventrikels van de hersenen van muizen

In dit onderzoek werd een gedetailleerde lichtmicroscopische techniek geoptimaliseerd voor real-time observatie en analyse van de beweging van CPEC cilia ex vivo samen met een elektronenmicroscopische methode voor ultrastructurele analyse.

Observatie van de Ciliaire Beweging van Choroid Plexus epitheelcellen<em&gt; Ex Vivo</em

In deze publicatie beschrijven we protocollen voor het beoordelen van luchtwegslijmvliesklaring (MCC) bij muizen in vivo met behulp van dual-modality radionuclide imaging. Dit protocol is ontworpen voor een single photon emission computed tomography (SPECT) en computed tomography (CT) acquisitieprotocol met behulp van muis whole body (MWB) collimators in een dubbel SPECT/CT systeem.

In vivo Evaluatie van mucociliaire klaring bij muizen

Om een succesvolle en hoogwaardige ciliaire functionele analyse voor PCD-diagnose te garanderen, is een nauwkeurige en zorgvuldige methode voor respiratoire epitheelbemonstering en -verwerking essentieel. Om pcd-diagnostische service te blijven bieden tijdens de COVID-19-pandemie, is het ciliaire videomicroscopieprotocol bijgewerkt met passende infectiebeheersingsmaatregelen.

Nasale poetsbemonstering en -verwerking met behulp van digitale hoge snelheid ciliaire videomicroscopie - aanpassing aan de COVID-19-pandemie

Dit protocol beschrijft nasale epitheelcelverzameling, uitbreiding en differentiatie naar organotypische luchtwegepitheelcelmodellen en kwantificering van de trilharenslagfrequentie via live-cell imaging en op maat gemaakte scripts.

Verzameling, uitbreiding en differentiatie van primaire menselijke nasale epitheelcelmodellen voor kwantificering van Cilia Beat Frequency

Snelle videomicroscopie-analyse is een relatief eenvoudig uit te voeren, snel, kosteneffectief en, in ervaren handen, een aanzienlijk betrouwbaar hulpmiddel voor eerstelijnsdiagnostiek van primaire ciliaire dyskinesie, dat beschikbaar zou moeten zijn in elk centrum dat betrokken is bij diagnostiek en de behandeling van ernstige longziekten.

High-speed videomicroscopie-analyse voor eerstelijnsdiagnose van primaire ciliaire dyskinesie

Dit protocol beschrijft een seriële transorale laryngoscopiebenadering voor muizen en ratten die close-up, onbelemmerde videobeelden van het strottenhoofd tijdens het ademen en slikken mogelijk maakt met behulp van een geoptimaliseerd anesthesieregime en nauwkeurig afgestemde endoscopische manipulatietechnieken.

Minimaal invasieve laryngoscopie bij muizen voor close-up beeldvorming van de larynxbeweging tijdens ademen en slikken

Lucht-vloeistof interfacecultuur wordt vaak gebruikt om pseudogestratificeerd luchtwegepitheel te ontwikkelen door primaire normale menselijke bronchiale epitheelcellen te differentiëren die de apicale zijde van de longluchtweg nabootsen. Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het bepalen van de kwaliteit door de biofysische eigenschappen te monitoren, zoals ciliaire functie en membraanintegriteit.

Bepaling van de ciliaire functie en membraanondoorlaatbaarheid van het pseudogestratificeerde longluchtwegepitheel

Deze methode beschrijft de exploitatie van het endogene signaal in een ARL13B-CENTRIN-2 transgeen muismodel om primaire cilia in situ in beeld te brengen, in drie dimensies over grote delen van gemineraliseerd weefsel, van weefselverzameling tot analyse van de organisatie van cilia's. Dit protocol kan ook worden toegepast op andere soorten weefsels.

Volumetrische beeldvorming en analyse van primaire trilharen in musculoskeletaal weefsel met behulp van het ARL13B-CENTRIN-2-muismodel

Leer een ex vivo methode voor hoogresolutiebeeldvorming van ciliamotiliteit in muizenluchtwegepithelen. Deze techniek maakt kwantitatieve analyse van trilhaarfrequentie en vloeistofstroming mogelijk.

Ex vivo methode voor High Resolution Imaging van Cilia Motility in Knaagdieren luchtwegepithelen

Meer video's verkennen