Name: Recombineering homologe recombinatie in Constructen Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Leer recombineering voor homologe recombinatie in Drosophila om endogene loci te manipuleren met precisie. Deze methode maakt snelle generatie van targetingvectoren voor null-mutaties en eiwit-tagging mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zouden graag bedanken Hugo Bellen en de Bloomington Stock Centrum voor reagentia. We verdere danken Koen Venken, Hugo Bellen en alle leden van de Buszczak en Hiesinger labs voor behulpzaam discussies. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institute of Health om ACR (T32GM083831), PRH (RO1EY018884) en MB (RO1GM086647), een subsidie ​​van de Cancer Prevention Research Institute van Texas naar MB en PRH (RP100516) en de Welch Foundation (I-1657) te PRH. MB is een EE en Greer Garson Fogelson Scholar in biomedisch onderzoek en PRH is een Eugene McDermott Scholar in biomedisch onderzoek aan de UT Southwestern Medical Center.

<ol><li>Rong, Y. S., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+targeted+gene+knockout+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A targeted gene knockout in Drosophila.</a> Genetics. 157, 1307-1312 (2001).</li>
<li>Rong, Y. S., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+by+homologous+recombination+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene targeting by homologous recombination in Drosophila.</a> Science. 288, 2013-2018 (2000).</li>
<li>Gong, W. J., Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ends-out%2C+or+replacement%2C+gene+targeting+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ends-out, or replacement, gene targeting in Drosophila.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2556-2561 (1073).</li>
<li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Res. 33, e36(2005).</li>
<li>Copeland, N. G., Jenkins, N. A., Court, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombineering%3A+a+powerful+new+tool+for+mouse+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Recombineering: a powerful new tool for mouse functional genomics.</a> Nat. Rev. Genet. 2, 769-779 (2001).</li>
<li>Venken, K. J., He, Y., Hoskins, R. A., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P%5Bacman%5D%3A+a+BAC+transgenic+platform+for+targeted+insertion+of+large+DNA+fragments+in+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">P[acman]: a BAC transgenic platform for targeted insertion of large DNA fragments in D. melanogaster.</a> Science. 314, 1747-1751 (2006).</li>
<li>Venken, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+P%5Bacman%5D+BAC+libraries+for+transgenesis+studies+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Versatile P[acman] BAC libraries for transgenesis studies in Drosophila melanogaster.</a> Nat. Methods. 6, 431-434 (2009).</li>
<li>Groth, A. C., Fish, M., Nusse, R., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+transgenic+Drosophila+by+using+the+site-specific+integrase+from+phage+phiC31%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Construction of transgenic Drosophila by using the site-specific integrase from phage phiC31.</a> Genetics. 166, 1775-1782 (2004).</li>
<li>Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+transgenesis+system+for+Drosophila+using+germ-line-specific+phiC31+integrases%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 3312-3317 (2007).</li>
<li>Chan, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+Rab+GTPases+with+synaptic+functions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of Rab GTPases with synaptic functions in Drosophila.</a> Current Biology: CB. 21, 1704-1715 (2011).</li>
<li>Chan, C. C., Scoggin, S., Hiesinger, P. R., Buszczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+recombineering+and+ends-out+homologous+recombination+to+systematically+characterize+Drosophila+gene+families%3A+Rab+GTPases+as+a+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Combining recombineering and ends-out homologous recombination to systematically characterize Drosophila gene families: Rab GTPases as a case study.</a> Commun. Integr. Biol. 5, 179-183 (2012).</li>
<li>Wu, N., Matand, K., Kebede, B., Acquaah, G., Williams, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+DNA+electrotransformation+efficiency+in+Escherichia+coli+DH10B+electrocompetent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Electronic+Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Enhancing DNA electrotransformation efficiency in Escherichia coli DH10B electrocompetent cells.</a> Electronic Journal of Biotechnology. 13, (2010).</li>
<li>Wang, S., Zhao, Y., Leiby, M., Zhu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+positive%2Fnegative+selection+scheme+for+precise+BAC+recombineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A new positive/negative selection scheme for precise BAC recombineering.</a> Mol. Biotechnol. 42, 110-116 (2009).</li>
<li>Venken, K. J., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+upgrades+for+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transgenesis upgrades for Drosophila melanogaster.</a> Development. 134, 3571-3584 (2007).</li>
<li>Dietzl, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-156 (2007).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende belangen met betrekking tot de hier beschreven technieken.

De kracht van genetische modelorganismen in biomedisch onderzoek is grotendeels gebaseerd op de tools beschikbaar voor genetische manipulatie. De kleine modellen C. elegans en Drosophila in het bijzonder zorgen voor goedkope en snelle moleculair genetische analyses van complete trajecten en gen families betrokken bij meercellige ontwikkeling of functie. De afgelopen jaren hebben significante vooruitgang in de ontwikkeling hulpmiddel gezien voor het manipuleren van genen in Drosophila 14,1...

Reinig moleculair-gedefinieerde manipulaties van enkele genen op hun endogene loci bieden een waardevol instrument om een groot aantal vragen aan eukaryote biologie relevante bestuderen. Drosophila reverse genetische technieken voor het genereren van het verlies-van-functie allelen had bewezen een uitdaging tot Golic en collega geïntroduceerd in vivo gene targeting middels homologe recombinatie Drosophila 1-3. Zij toonden aan dat specifieke genomische loci kunnen worden gericht met behulp van een lineair fragment van DNA uit een geïntegreerde transgene construct. Deze lineaire &quot;donor&quot; DNA in vivo gegenereerd door FRT-bemiddelde recombinatie (voor het uitsnijden van het DNA van het chromosoom als een circulair molecuul) gevolgd door linearisatie van het meganuclease I-SCEI. Hoewel deze methode is met succes gebruikt om een ​​verscheidenheid van gedefinieerde laesies genereren, is de techniek niet gemakkelijk schaalbaar is voor het manipuleren van vele genen in parallel omdat elke individueledubbele knockout construct vereist verschillende en aangepaste ontwerp. Zo zijn er problemen naadloos manipuleren van grote stukken DNA (&gt; 5 kb) in vitro met klassieke restriction enzyme / ligatie klonen of PCR, en de grootte beperkingen van traditionele in vivo transformatievectoren vaak belemmeren dat spoedig homologe recombinatie richten vectoren. Om deze beperkingen te overwinnen, combineerden we de recombineering / transgenese P [Acman] systeem, dat de sub-klonen en transgenese van het mogelijk maakt tot 100 kb van DNA, met de uiteinden-out gentargeting methodologie om een ​​efficiënt en relatief snelle platform dat vergemakkelijkt Drosophila gene targeting. Recombinatie-gemedieerde genetische manipulatie (recombineering) is een krachtige homologe recombinatie gebaseerde klonen technologie 4,5. In tegenstelling tot conventionele restrictie-enzym / ligase klonen is recombineering niet beperkt door de sequentie of Size van de gemanipuleerde DNA. Recombineering gebruikt een speciale E. coli-stam die recombinatie machines geleverd door een defecte λ profaag 4 havens. Deze techniek is onlangs goedgekeurd voor toepassing in Drosophila 6,7. Recombineering in Drosophila is gebaseerd op een gemodificeerde voorwaardelijk amplificeerbaar bacteriële kunstmatig chromosoom (BAC) vector genaamd P [Acman] 6,7. Deze vector draagt ​​twee oorsprongen van replicatie: OriV die hoog kopieaantal produceert op chemische inductie voor de zuivering van grote hoeveelheden DNA nodig voor sequencing en embryo injectie en ORIS, die onder basale omstandigheden low-copy number handhaaft. Bovendien, de P [Acman] vector is voorzien van een aanhechting van bacteriën (attB) plaats. De attB site als een substraat voor ΦC31 integrase gemedieerde transgenese is opname van grote DNA-fragmenten kunnen in een vooraf bepaalde landingsplaats in de Drosophila genoom 8,9. We hebben gegenereerd een P [Acman] vector (aangeduid als P [Acman]-KO 1.0) die kunnen worden gebruikt als richtende vector voor ends-out homologe recombinatie 10,11. Op te nemen uiteinden-out gen targeting technologie in het systeem, voegden we twee FRT en twee I-SCEI sites. We hebben ook een Gateway cassette in deze vector gewijzigd om het proces van het opnemen van de homologie-armen in P [Acman]-KO 1.0 stroomlijnen. Dit geeft een snelle en eenvoudige manier om vrijwel elke genoomgebied plaats te introduceren in de targeting vector. In dit protocol beschrijven we hoe u een targeting vector met P [Acman]-KO 1.0, en hoe u deze vector mobiliseren in vivo aan de endogene locus richten ingenieur. Voor de toepassing van dit protocol zullen we de RFP / Kan cassette gebruiken om een ​​gen van belang vervangt, maar een verscheidenheid van cassettes die een antibioticum selectiemerker bevatten kunnen worden gebruikt met dit protocol. We hebben ontworpen en met succes een reeks cassettesgenvervanging en tagging 10,11.

<table><tbody><tr><td>SW102 Recombination competent bacteria</td><td>NCI-Frederick</td><td>Recombination Bacteria (SW102, SW105 en SW106)</td><td><a href="http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx" target="_blank">http://ncifrederick.cancer.gov/research/brb/logon.aspx</a></td></tr><tr><td>TransforMax EPI300 electrocopmpetent E. coli</td><td>Epicentre</td><td>EC300110</td><td>Bevat CopyControl inductie-oplossing</td></tr><tr><td>PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase</td><td>Aligent Technology Inc.</td><td>600670</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean Gel DNA Recovery Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4001</td><td></td></tr><tr><td>Use Gateway BP ClonaseII Enzyme kit</td><td>Invitrogen</td><td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>P[acman]KO1.010</td><td>Buszczak and Hiesinger Labs</td><td>Op aanvraag</td><td></td></tr><tr><td>pENTR RFP-Kan11</td><td>Buszczak and Hiesinger Labs</td><td>Op aanvraag</td><td></td></tr><tr><td>Flystocks</td><td>Bloomington stock center</td><td>Stocknummers: 25680, 25679</td><td>y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}11 P{70I-SceI}2B snaSco/CyO, P{hs-hid}4 y1 w*/Dp(2;Y)G, P{hs-hid}Y; P{70FLP}23 P{70I-SceI}4A/TM3, P{hs-hid}14, Sb1</td></tr><tr><td>Electroporation machine</td><td>Biorad GenePulser Xcell met PC-module</td><td>165-2662</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes</td><td>Fisher Brand</td><td>#FB101</td><td></td></tr></tbody></table>

recombineering homologe recombinatie in constructen<em&gt; drosophila</em

Recombineering Homologous Recombination Constructs in Drosophila

De verdere ontwikkeling van technieken voor snelle, grootschalige manipulatie van endogene gen loci zal het gebruik van Drosophila melanogaster als een genetisch modelorganisme voor de menselijke-en vaatziekten gerelateerd onderzoek te verbreden. De afgelopen jaren hebben gezien de technische vooruitgang, zoals homologe recombinatie en recombineering. Echter, het genereren van eenduidige nulmutaties of tagging endogene eiwitten blijft een aanzienlijke inspanning voor de meeste genen. We beschrijven hier en demonstreren technieken voor het gebruik recombineering gebaseerde cloneringsmethoden vectoren die kunnen worden gebruikt om te richten en te manipuleren endogene loci in vivo genereren bijzonder hebben we een combinatie van drie technologieën vastgesteld:. (1) BAC transgenese / recombineering, ( 2) uiteinden-out homologe recombinatie en (3) Gateway-technologie om een ​​robuuste, efficiënte en flexibele methode voor het manipuleren van endogene genomische loci bieden. In dit protocol, bieden we stap-voor-stap informatie over hoe u (1) ontwerp individuatiel vectoren, (2) hoe grote fragmenten van genomisch DNA te klonen in de homologe recombinatie vector behulp kloof reparatie, en (3) hoe de genen van belang vervangen of taggen binnen deze vectoren met behulp van een tweede ronde van recombineering. Ten slotte zullen we ook een protocol voor hoe je deze cassettes te mobiliseren in vivo naar een knock-out, of een tag gen via knock-in te genereren. Deze methoden kunnen eenvoudig worden vastgesteld voor meerdere doelen in parallel en vormen een middel voor het manipuleren van de Drosophila genoom op een tijdige en efficiënte manier.

Amplificatie van de RA en LA homologie-armen moet produceren 500 bp producten en SOE PCR-reactie moet opleveren een 1,0 kb product (Secties 2.1-2.4, Figuur 2). De BP reactie uitgevoerd in paragraaf 2.5 is typisch zeer efficiënt en bacteriële transformatie van het product rendementen 5-100 kolonies gemiddeld. Bijna alle getest met PCR kolonies controleren tonen de verwachte PCR-product. Tijdens de eerste ronde van recombineering (hoofdstuk 3) verwacht 20-40 kolonies te krijge...

Homologe recombinatie technieken sterk vooruit<em&gt; Drosophila</em&gt; Genetica doordat de vorming van moleculair precieze mutaties. De recente goedkeuring van recombineering maakt het mogelijk om grote stukken DNA te manipuleren en transformeren ze in<em&gt; Drosophila</em<sup&gt; 6</sup&gt;. De methoden die hier gepresenteerde combineren van deze technieken om snel te genereren grote vectoren voor homologe recombinatie.

Recombineering homologe recombinatie in Constructen<em&gt; Drosophila</em

The continued development of techniques for fast, large-scale manipulation of endogenous gene loci will broaden the use of Drosophila melanogaster as a ...

Het algemene doel van deze procedure is om snel grote homologe recombinatievectoren te genereren die kunnen worden gebruikt om endogene oph-loci te targeten en te manipuleren. Dit wordt bereikt door eerst een back-kloon te selecteren die de genomische regio van interesse beslaat. De tweede stap van de procedure is het kloneren van homologie-armen in een homologe recombinatievector.De derde stap is het kloneren van genomisch DNA in de homologe recombinatievector met behulp van gap repair. De laatste stap is het vervangen van de genomische regio door de targeting-cassette. Uiteindelijk zullen deze procedures een targeting-vector voor Enzo homologe recombinatie produceren om ondubbelzinnige null-mutaties te genereren of endogene eiwitten in drosophila te taggen via het gebruik van recombinatiegebaseerde technieken.Daarnaast bevat het geschreven manuscript ook een protocol voor de in vivo mobilisatie van deze cassettes om een knockout of een getagd gen via knockin te genereren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat deze eenvoudig kan worden toegepast op meerdere targets in parallel, en dat het een middel biedt om het oph-genoom op een t

recombineering-homologous-recombination-constructs-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De mogelijkheid om transgenen te produceren...

De productie van C. elegans Transgenen via Recombineering met de GalK Selecteerbare marker

In this video, we describe the Southern blotting technique to identify homologous recombination events in the genome of mouse embryonic stem cells using radiolabeled probes. DNA regions containing homologous recombination events appear as distinct bands when the membrane containing the probe-bound DNA is exposed to X-rays.

Southern Blotting to Detect Homologous Recombination in the Mouse Embryonic Stem Cell Genome

Gene targeting-methodologieën kunnen worden gebruikt om transgene muizen te genereren met knockout-, knock-in- en getaggede allelen. Hier beschrijven we een verbeterde methode van recombineren in E. coli, die we 'subklonen plus invoegen' noemen, en die kan worden gebruikt om snel aangepaste gene targeting-vectoren te genereren.

Subkloning Plus Insertion (SPI) - A Novel recombineering Methode voor de snelle bouw van gene targeting vectoren

Dit protocol laat zien hoe fluorescent gemerkt, genetisch bepaald klonale tumoren in de Drosophila oog / antennaal verbeelding schijven (EAD) te genereren. Het beschrijft hoe de EAD en de hersenen ontleden van de derde instar larven en hoe ze te verwerken te visualiseren en te kwantificeren genexpressie veranderingen en tumor invasiviteit.

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

Eiwitten vaak meerdere domeinen die verschillende cellulaire functies kunnen uitoefenen. Gene knock-outs (KO) beschouw dit niet als functionele diversiteit. Hier melden wij een recombinatie-gemedieerde cassette uitwisseling (RMCE) gebaseerde structuur-functie benadering KO embryonale stamcellen waarmee de moleculaire dissectie van verschillende functionele domeinen of varianten van een eiwit.

Structuur-functie studies in muis embryonale stamcellen gebruiken recombinase-gemedieerde cassette uitwisseling

Hier presenteren we een methode voor het genereren van weefsel toepassingsspecifieke binaire transcriptie systemen in Drosophila door vervanging van de eerste codering exon van genen met transcriptie stuurprogramma's. De CRISPR/Cas9 gebaseerde methode plaatst een transactivator reeks onder de endogene regulering van een vervangen gen, en bijgevolg vergemakkelijkt transctivator expressie uitsluitend in gen-specifieke Spatio patronen.

Een efficiënte strategie voor het genereren van weefsel toepassingsspecifieke binaire transcriptie systemen in Drosophila door het bewerken van het genoom

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het identificeren van homologe recombinatie gebeurtenissen die hebben plaatsgevonden in muis embryonale stamcellen met behulp van Southern blotting en/of PCR. Deze methode wordt geïllustreerd door de generatie van nonmuscle myosin II genetische vervanging Muismodellen met behulp van traditionele embryonale stamcel gebaseerde homologe recombinatie-gemedieerde targeting technologie.

Identificatie van homologe recombinatie gebeurtenissen in muis embryonale stamcellen met behulp van Southern Blotting en de Kettingreactie van de Polymerase

Het doel van dit protocol is om het ontwerp en de prestaties van in vivo experimenten in Drosophila melanogaster te schetsen om de functionele gevolgen van zeldzame genvarianten in verband met menselijke ziekten te beoordelen.

In vivo functionele studie van ziekten-geassocieerde zeldzame menselijke varianten met behulp van Drosophila

Dit artikel neemt de phiC31-integrase-gemedieerde transgenese in Drosophila als voorbeeld en presenteert een geoptimaliseerd protocol voor micro-injectie van embryo's, een cruciale stap voor het creëren van transgene vliegen.

Embryo-micro-injectie voor transgenese bij Drosophila

Wolbachia bacteriële infectie in Drosophila

Leer recombineering voor homologe recombinatie in Drosophila om endogene loci te manipuleren met precisie. Deze methode maakt snelle generatie van targetingvectoren voor null-mutaties en eiwit-tagging mogelijk.

Recombineering homologe recombinatie in Constructen

Meer video's verkennen