A Novel Ex vivo Cultuur Methode voor de embryonale Mouse Hart
May 24th, 2013
Ontwikkelingsstudies in de muis worden gehinderd door de ontoegankelijkheid van het embryo tijdens de dracht. Om de lange termijn cultuur van het embryonale hart te bevorderen in de late stadia van de zwangerschap, hebben we een protocol waarin het uitgesneden hart wordt gekweekt in een semi-vaste, verdunde Matrigel ontwikkeld.
Het algemene doel van deze procedure is om het embryonale hart te verwijderen voor ex vivo-kweek. Dit wordt bereikt door eerst het baarmoederhoorn van een drachtige vrouwelijke muis te verwijderen. Vervolgens wordt een embryo verwijderd en voorbereid voor dissectie.
Daarna wordt de embryonale borstwand geopend om het hart te visualiseren. Ten slotte wordt het hart verwijderd en in een kweekputje geplaatst dat verdund matrigel bevat. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een gezond levend hart tonen door observatie onder een helderveldmicroscoop.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven andere methoden zoals slingerende culturen, is dat het hart kan worden behandeld met lokale agentia zoals een eiwit geconjugeerd aan een kraal, of met globale agentia, zoals het toevoegen van een kleine molecuul aan het matrigel. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar therapie voor hart- en vaatziekten omdat het mogelijk maakt de gebeurtenissen binnen gespecialiseerde segmenten van het hart te onderzoeken in de context van het hele intacte orgaan. Na het euthanaseren van een tijdig zwangere muis op de gewenste embryonale dag, besproeit u de vrouw voorzichtig met 70% ethanol voordat u de buikholte opent en het baarmoederhoorn verwijdert en verwijdert.
Plaats het baarmoederhoorn in een petrischaal met koud XPBS en spoel het. Plaats de schaal op ijs tot u klaar bent om te dissecteren. Snijd vervolgens het baarmoederhoorn open via de middenlijn om de aangehechte embryonale zakjes bloot te leggen.
Snij een embryonale zak open en plaats een embryo in een tweede petrischaal met koud PBS. Plaats de schaal met het baarmoederhoorn op ijs. Nadat het embryo is gedecapiteerd, plaatst u het embryo op zijn rug en snijdt u het open.
Open de borstwand om het hart en de longen te visualiseren. Afhankelijk van het stadium kan de borstwand transparant zijn. Als genotypering moet worden uitgevoerd, bewaar dan de staart van het embryo.
Gebruik een pincet om voorzichtig het hart op te tillen en snij de vaten eronder door. Snijd vervolgens boven de grote vaten om het hart vrij te maken. Verwijder indien nodig overbodig weefsel.
Plaats het hart in een putje van een 24-putjesschaal gevuld met koud PBS en op ijs. Herhaal de dissectie om alle embryonale harten te isoleren. Combineer in een laminaire stromingshaak koud matrigel en het gewenste kweekmedium in een verhouding van een-op-een terwijl u het verdunde matrigel op ijs houdt.
Pipetteer 500 tot 1000 microliters van de oplossing in de putjes van een 24-putjescultuur. Zet die op ijs. Kies voorzichtig en plaats de verwijderde harten in de individuele putjes van de matrigel bevattende kweekschaal.
Als de oriëntatie van een ingebed hart cruciaal is, gebruik dan 70% ethanol om een omgekeerd microscoop en de omringende ruimte voorzichtig te besproeien. Plaats dan, na het werken in de haak, het hart in de put van het matrigel op ijs. Plaats de plaat op een microscooptafel en oriënteer snel het hart terwijl het matrigel begint te stollen.
Plaats de kweekschaal in een bevochtigde 37 graden Celsius incubator en laat het matrigel ongeveer 30 minuten stollen. Voeg een milliliter voorverwarmd kweekmedium toe aan elke put met een hart. De harten kunnen minimaal vier dagen in kweek blijven.
Voeg desgewenst een fluorescerende levende celkleurstof toe, zoals cyto 16. Om het levende hart te visualiseren, zal de fotografie beperkt zijn tot de zijkant van het hart die zichtbaar is op basis van de positie waarin het is ingebed. Als gehele montage beeldvorming of secties worden uitgevoerd, verwijdert u het kweekmedium.
Vervang het door koud 4% formaldehyde en plaats de schaal 30 minuten op ijs. Nadat het matrigel is opgelost, vervangt u het fixeermiddel en matrigel door vers formaldehyde en fixeert u de harten een nacht bij vier graden Celsius. Was de harten met PBS of Triss en bewaar ze bij vier graden Celsius tot verdere analyses.
Wanneer ex vivo gedurende 24 uur gekweekt, lijkt de kransslagaderlijke vaatbundel op een hart dat is verwijderd uit een vergelijkbaar oude embryo dat in utero is gehouden zoals hier getoond. Hemat, toine en eoine analyse van harten verwijderd bij E 16.5 en ex vivo gedurende vier dagen gekweekt, toont aan dat de algehele morfologie, inclusief de wanden van de grote slagaders en het ventrikel en interventriculaire septale myocardium van het hart intact blijft ondanks het ontbreken van circulatie. De kransslagaderlijke osteo zijn duidelijk zichtbaar zoals aangegeven door de pijlpunt.
Echter, DNA-fragmentatie geïndiceerd met pijlen en waargenomen met zowel h en d als DAPI is duidelijk in het compacte myocardium en rond de grote vaten. Bovendien is het myocardium minder dicht in vergelijking met een hart van een E 18.5 embryo dat zich in utero ontwikkelde, ook al klopte het ex vivo gekweekte hart nog steeds. Dus, er zijn beperkingen aan de tijdsduur of het stadium waarop deze harten kunnen worden gehandhaafd.
Deze kweektechniek kan ook worden gebruikt om harten fluorescent te labelen terwijl ze in kweek zijn na incubatie met een endotheel-specifieke fluorescente kleurstof. Harten worden gedurende 48 uur gekweekt. In dit geval is de visualisatie beperkt op basis van de oriëntatie van het hart en de opaciteit van het weefsel. Daaropvolgende histologische secties door het ventrikelmyocardium bevestigen dat cyto 16 de buitenste cellagen kan doordringen om sub-epicardische vaten binnen de ventrikels te labelen en co-lokaliseert met is selectine zoals hier gedemonstreerd. Na ex vivo kweek gedurende 30 uur, toont een hart verwijderd uit een E 14.5 embryo consistente contractiliteit en pacing tussen de atria en ventrikels.
Bij het uitvoeren van deze techniek is het belangrijk om voorzichtig en zorgvuldig te zijn bij het verwijderen van het hart. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een embryonaal muishart verwijdert en
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het verwijderen en kweken van het embryonale hart uit muis-embryo's in een late ontwikkelingsfase. Het hart wordt gekweekt in een semi-solide, verdunde Matrigel om langdurige observatie en studie mogelijk te maken.
Belangrijkste Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Ontwikkelingsbiologie
- Cardiovasculair Onderzoek
- Muismodellen
Achtergrond
- Toegang tot embryonale structuren tijdens de zwangerschap is uitdagend.
- Ex vivo kweektechnieken kunnen de studie van embryonale ontwikkeling verbeteren.
- Matrigel biedt een ondersteunende omgeving voor gekweekte weefsels.
- Begrip van hartontwikkeling is cruciaal voor inzichten in aangeboren hartafwijkingen.
Doel van het Onderzoek
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het kweken van embryonale harten.
- Om langdurige observatie van hartontwikkeling mogelijk te maken.
- Om onderzoek naar hartfunctie en -ontwikkeling te faciliteren.
Gebruikte Methoden
- Het ophalen van het hoorn van de baarmoeder van een zwangere muis.
- Dissectie om toegang te krijgen tot het embryonale hart.
- Het verwijderen van het hart en het plaatsen ervan in verdunde Matrigel.
- Observatie van het gekweekte hart onder een lichtveldmicroscoop.
Belangrijkste Resultaten
- Het protocol maakt het mogelijk om het embryonale hart met succes te verwijderen.
- Harten blijven levensvatbaar en kunnen in cultuur worden waargenomen.
- Resultaten tonen gezonde hartfunctie in de gekweekte omgeving.
- Deze methode kan worden gebruikt voor verdere ontwikkelingsstudies.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol is effectief voor langdurige cultuur van embryonale harten.
- Deze aanpak kan onderzoek naar hartontwikkeling verbeteren.
- Toekomstige studies kunnen deze methode gebruiken om hartgerelateerde fenomenen te onderzoeken.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This ex vivo culture method enables sustained observation of embryonic mouse heart development, supporting target validation in cardiovascular research by maintaining organ-level physiology outside the uterus. The approach provides a disease-relevant system for mechanistic de-risking of therapeutic candidates affecting cardiac morphogenesis and function. It bridges early discovery with preclinical assessment by preserving three-dimensional structure and contractility for up to four days post-dissection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in an intact organ context without confounding maternal circulation.
- Operational Value: Supports functional target validation by preserving coronary plexus development and myocardial structure.
- Predictive Value: Facilitates assessment of compound effects on heart morphology and contractility over multiple days.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Provides a standardized platform for quantitative imaging of vascular and myocardial parameters.
- Reproducibility: Dilute Matrigel matrix supports consistent tissue embedding and orientation across replicates.
- Scalability: Compatible with 24-well format for parallel compound testing and dose-response analysis.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models late-gestation heart development (E14.5-E16.5) for studying congenital defect mechanisms.
- Translational Continuity: Allows progression from organ culture to histological analysis (e.g., cyto16 labeling, fixation) for target engagement verification.
- Mechanistic De-risking: Enables evaluation of vascular and myocardial integrity under experimental perturbations.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, supporting iterative design-make-test-analyze cycles in cardiovascular drug discovery.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by enabling live imaging of heart development and response to pharmacological agents.
- Screening: Delivers quantitative outputs via bright-field and fluorescence microscopy for assessing structural and functional endpoints.
- Analytics: Generates measurable data on coronary plexus formation, myocardial density, and contraction patterns for comparative analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical work through fixation, sectioning, and biomarker co-localization (e.g., cyto16 with selectin).
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable organ culture platform applicable across multiple study designs and compound classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in cardiac development studies by maintaining intact organ architecture.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized Matrigel preparation and culture conditions.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early functional readouts on heart viability and structure.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on developmental toxicity and target engagement profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic dissection and sterile tissue handling.
- Dependent on access to laminar flow hoods, incubators, and microscopy systems.
- Necessitates standardization of Matrigel dilution and temperature control for consistent gelation.
- Limited to embryonic stages up to E16.5 for viable four-day culture, per source data.
- Orientation sensitivity requires careful embedding when regional analysis is critical.
