A Novel Hoge-resolutie

Het algemene doel van deze procedure is om beelden met een hoge resolutie van individuele botmergafgeleide progenitorcellen te verkrijgen, nadat hun rekruteringspatronen naar normale hersenvaten en vaten geassocieerd met hersentumoren in de loop van de tijd zijn gevolgd. Dit wordt bereikt door de tibia en het femur uit donormuizen te verwijderen om fluorescerende botmergprogenitorcellen te verkrijgen, om deze cellen vervolgens in bestraalde recipiëntmuizen te injecteren. De tweede stap is het genereren van intracraniële GB M-xenografts in de chimerische muizen binnen een craniële windowchamber.

Vervolgens ondergaan de muizen verschillende behandelingsregimes, waaronder stereotactisch geleide bestraling. De laatste stap is het beeldvormen van de muizen met een tweefotonen confocale microscoop. Uiteindelijk kan deze methodologie worden gebruikt om de mechanismen van intracraniale vascularisatie dynamisch te bestuderen in diverse modellen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals histopathologie van ex vivo weefsel, is dat we kritieke dynamische informatie kunnen bestuderen die verband houdt met vaatvorming in de hersenen. Hierdoor kunnen we kernvragen beantwoorden over de mechanismen van intracraniële neovascularisatie. Hoewel deze methode kan worden gebruikt om inzicht te krijgen in intracraniële neovascularisatie, kan deze ook worden toegepast op andere systemen en ziekteprocessen in de hersenen, zoals intracraniële ischemie of beroerte, neurodegeneratieve ziekten en mechanismen van tumorcelmetastasen naar de hersenen.

Voor de doeleinden van deze video waren we niet in staat om een strikte aseptische techniek te volgen. Om die reden is de opening van de biosafety cabinet groter dan 12 inch en zijn de dieren niet afgedekt, zodat de kijker een helderder beeld krijgt en een betere toegang heeft om de procedures voor experimenteel werk te oriënteren. De aseptische techniek dient strikt te worden nageleefd.

Begin deze procedure door de fluorescentie-expressie van de GFP-donormuis te bevestigen en euthanaseer deze volgens de richtlijnen van de institutionele commissie voor dierenzorg. Reinig vervolgens beide achterpoten en verwijder het tibia en het femur onder aseptische omstandigheden. Verwijder al het overtollige weefsel van de botten.

Verwijder vervolgens de eindplaten van beide uiteinden van de vier geëxtraheerde botten. Spoel deze door met een naald van 22 gauge en één milliliter steriele PBS. Ze worden helder zodra al het beenmerg is weggespoeld.

Meng vervolgens de geëxtraheerde beenmergsuspensie. Deze zou ongeveer 20 miljoen cellen moeten bevatten, wat voldoende is voor de reconstitutie van drie gastmuizen. Bereid daarna 3 tuberculinespuiten met een 27 gauge naald voor en trek telkens 300 µL van de beenmergsuspensie op in elke spuit.

Terwijl de muis in de fixatiehouder is geplaatst, markeert u het dorsale oppervlak van de staart om uw oriëntatie te bepalen. Injecteer vervolgens de suspensie in de laterale staartader van drie eerder bestraalde muizen.

Gebruik in deze procedure nod skid-muizen terwijl er onder aseptische omstandigheden wordt gewerkt. Anestheseer de chimerische beenmerg nod skid-muizen en dien preventieve analgesie toe die is goedgekeurd door de iacuc. Breng traangel toe om corneale uitdroging te voorkomen.

Reinig de kop eerst met een Betadine-oplossing, vervolgens met alcohol en verwijder het overtollige haar. Reinig daarna de onderliggende hoofdhuid verder met alcohol. Maak een incisie vanaf het midden van de oren tot net boven de ogen.

Verwijder de hoofdhuid aan weerszijden van de eerste incisie om ongeveer vijf millimeter van het onderliggende schedeloppervlak bloot te leggen. Identificeer vervolgens de anatomische referentiepunten van het schedeloppervlak. Identificeer daarna het periosteum en lift dit op door een 2% lidocaïne-oplossing met epinefrine te injecteren.

Dissect vervolgens het periosteum met een scherp instrument los van het schedeloppervlak. Gebruik daarna een 2,7 millimeter TR refine-boor om een circulaire botlap van 2,7 millimeter te verzwakken op de rechterhemisfeer van de schedel, op gelijke afstand van zowel Lambda als bgma. Penetreer het bot niet met de boor om de onderliggende dura en weefsels te beschermen.

Verwijder nu de verzwakte botlap met behulp van de dissectieset, pincetten en een dentale haak met een bewuste maar gecontroleerde kracht. Laad vervolgens een Hamilton-spuit van 30 gauge met 10 µL celspensie en bevestig de naald op het stereotactische frame. Plaats daarna de muis op het stereotactische frame.

Lijn de naald uit met het middelpunt van het venster dat daarna wordt gegenereerd en laat de naald zakken tot deze het corticale oppervlak raakt. Stel vervolgens de digitale coördinaten opnieuw in. Laat de naald nu 3,2 millimeter in het corticale weefsel zakken.

Trek de naald vervolgens 0,2 millimeter terug en injecteer op drie millimeter. De injectie op diepte moet worden uitgevoerd met een snelheid van 10 µL per minuut. Wanneer de injectie is voltooid, laat u de naald één minuut op zijn plaats zitten voordat u deze langzaam terugtrekt.

Verwijder vervolgens de muis uit het frame. Houd daarna het breinoppervlak gehydrateerd met druppels steriele PBS.

Plaats een dekglas van drie millimeter op het breinoppervlak om het venster van 2,7 millimeter af te dichten. Droog vervolgens het omliggende schedelbot. Breng daarna vet bond aan om het hoofdhuidweefsel aan het schedelbot te lijmen en het dekglas op zijn plaats te houden.

Breng niet te veel aan, omdat het anders onder het glas kan lekken en het beeldpotentieel kan verminderen. Meng vervolgens het verse tandheelkundige acrylpoeder en de oplossing in de zuurkast en breng het mengsel met een naald van gauge 22 aan over de vet bond. Breng het acrylaat zo aan dat het de rand van het glazen dekglas licht overlapt, maar het glazen dekglas niet bedekt, om een luchtdichte afsluiting te garanderen.

Plaats in deze stap een geanestheseerde muis in een op maat gemaakte hoofdfixeerder binnen de in-house ontworpen XAD 2 25 stereotactische bestralingsunit. Voer een cone beam CT-scan van 360 graden uit waarbij de röntgenbuis werkt op 40 peak kilovolt en 0,05 milliampère door een aluminium filter van twee millimeter. Gebruik het beeld om de tafel zodanig te positioneren dat het ISO-centrum van de straling is gericht op het rechterhemisfeer en centraal ligt in de dorsoventrale richting.

Er zijn verschillende soorten collimatoren beschikbaar om de straling te richten, wat de aanpasbaarheid van het model demonstreert. In dit geval gebruiken we een collimator van 8 mm bij 11 mm voor hemisferische bestraling. Plaats de hemisferische collimator in de X RAD 2 25 stereotactische bestralingsinstallatie.

Verkrijg enkelvoudige orthogonale CT-beelden van zowel de boven- als onderzijde via de collimator om de correcte positionering van het hoofd te waarborgen door de anatomische botstructuren te lokaliseren en de positie van de tafel handmatig via de monitor fijn af te stellen. Vervang het aluminium filter van de XAD 2 25 IRRADIATOR door een koperen behandelingsfilter van 0,93 millimeter. Voer vervolgens het röntgenbuisprogramma uit bij een piekspanning van 225 kV en een stroomsterkte van 13 mA en dien de helft van de stralingsdosis vanaf de bovenzijde in AP-richting toe.

Breng de gantry terug naar de onderste positie en dien de tweede helft van de stralingsdosis vanaf de onderzijde toe in PA-richting. In deze procedure wordt de muis met het eerder gecreëerde intracraniale venster geanestheseerd en wordt het venster gereinigd met een alcoholspray. Stel de kanalen op de confocale microscoop in op basis van de fluorochromen die zijn geïntegreerd in de gegenereerde chimerische muis.

Als alternatief kunnen eerdere instellingen worden hergebruikt om de variabiliteit tussen beeldsessies te verminderen. Injecteer in dit geval alle voor beeldvorming benodigde markers in de laterale staartvene, zoals dextraan voor de vasculatuur. Plaats de muis ondersteboven in de op maat gemaakte kopfixateur, ondersteund met kneedbaar plasticine, waarbij u ervoor zorgt dat de kop loodrecht op de laser staat, en plaats de fixateur vlak op de beweegbare microscooptafel.

Zet de laser van het eerste kanaal aan en positioneer deze in het centrum van het intracraniale venster door direct naar het snijpunt van de laserstraal op het venster van de kamer te kijken. Maak van elk kanaal een afbeelding van het gehele venster met een 5x lens en gebruik deze als kaart voor andere afbeeldingen met een hogere resolutie met 10x en 20x long-range lenzen. Dit schema belicht de technische fouten die geassocieerd worden met het chirurgische proces en demonstreert het effect dat elk hiervan zal hebben op de geproduceerde afbeeldingen.

Ingesloten lucht onder het venster zal als bellen op de beelden zichtbaar zijn. Acrylophoping op het glas is autofluorescerend in het ver-rood kanaal en zal een deel van het gezichtsveld blokkeren. Op dezelfde manier is vuil op het venster tijdens de beeldvorming zichtbaar als autofluorescerende vlekken op de beelden.

Zelfs bij een perfect intracraniaal venster kunnen er problemen ontstaan zodra dit onder de microscoop wordt geplaatst. Ademhalingsartefacten leiden tot gestreepte beelden, terwijl een slechte positionering van de muis op het frame resulteert in een gesegmenteerd beeld. Omdat de laser slechts een deel van het weefsel kruist, is het via post-image processing mogelijk om een extra kanaal voor CFP-getagde cellen toe te voegen, waarbij GFP-beelden van CFP-beelden kunnen worden afgetrokken om het werkelijke CFP-signaal onthuld te krijgen.

Daarnaast kunnen we, door gebruik te maken van de kenmerkende tweede-harmonische-generatie autofluorescentie van collageen IV-vezels, de basaalmembraan van de vasculatuur in beeld brengen. De beschikbaarheid van vijf fluorescentiekanalen biedt de gebruiker een grote mate van flexibiliteit en aanpasbaarheid van het nieuwe spiegelmodel dat in dit artikel wordt beschreven. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om rekening te houden met de gevaarlijke producten die tijdens de chirurgische ingrepen worden gebruikt.

Het is daarnaast essentieel om nauwkeurig te werken en specifiek op details te letten om ervoor te zorgen dat het hersenweefsel onbeschadigd blijft gedurende de langetermijnbeeldvorming. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u een chimerische muis met fluorescerende progenitorcellen creëert, en bijgevolg in staat zijn om hogeresolutie real-time beelden van de intracraniale vasculatuur vast te leggen na implantatie van tumorcellen, met of zonder therapeutische interventie.