Coculture Analyse van extracellulaire eiwit interacties met invloed op de insulinesecretie door bètacellen in de pancreas
15 juni 2013
Transcellulaire eiwit interacties zijn belangrijke determinanten van beta-cel functie. Hier beschreven is een methode-aangepast van een co-cultuur model van synaptogenesis-voor het onderzoeken hoe specifieke transmembraaneiwitten beïnvloeden insuline secretie. Getransfecteerde HEK293 cellen brengen eiwitten van belang; beta-cellen hoeven niet te worden getransfecteerd of anderszins direct verstoord.
Het algemene doel van deze procedure is om te onderzoeken hoe transcellulaire interacties die de extracellulaire domeinen van specifieke transmembraaneiwitten betrekken, de functie van bètacellen en meer specifiek de insulinesecretie beïnvloeden. Dit wordt bereikt door eerst een zoogdiercellijn te transfecteren met een plasmide dat het eiwit van belang bevat in de tweede stap. Een bètacellenlijn wordt geco-cultiveerd met de zoogdiercellen.
In de laatste stap wordt de co-cultuur geïncubeerd in media met verschillende glucoseconcentraties om de beoordeling van glucose-geïnduceerde insulinesecretie mogelijk te maken. Uiteindelijk worden insuline-radio-immuno-assays of Eliza's gebruikt om de niveaus van insuline te beoordelen die door de gekweekte bètacellen in het medium worden uitgescheiden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals genoverexpressie en knockdown, is dat het verstoring van de mRNA- en eiwitexpressie voorkomt, wat mogelijk de gezondheid en/of functie van bètacellen kan beïnvloeden op een manier die analyses van de specifieke interactie van het eiwit kan verwarren.
Begin met het overbrengen van de HEC 2 93 cellen naar een 24-wellplaat in 0,5 milliliter HEC 2 93 media per put om ervoor te zorgen dat de cellen gelijkmatig over de bodem van de plaat zijn verspreid. Schud de plaat langs één as tegelijk met een snelheid die synchroon is met de golf gevormd in de put. Wanneer de HEC 2 93 cellen 100% cofluëntie bereiken, transfecteer de culturen met 0,8 microgram van het plasmide dat codeert voor het eiwit van belang in twee microliter lipo 2000.
Volgens het lipo-protocol is het algemene schema van de co-cultuur die nu wordt gedemonstreerd hier afgebeeld met behulp van een niet-enzymatische celverwijderaar. Begin deze stap door INS een cellen te verzamelen bij ongeveer 70 tot 80% confluëntie van de bodem van een T 75 kweekfles. Na het centrifugeren van de cellen gedurende drie minuten bij 150 Gs bij kamertemperatuur, gebruik een P 1000 pipet om het pellet te resuspenderen in één milliliter van de helft INS een en de helft.
He media gebruik vervolgens een 10 milliliter pipet om een extra 24 milliliter gemengd media toe te voegen en resuspendeer de cellen. Aspirateer het medium van de putten van de 24-wellplaat die de HEC 2 9 3 cellen bevatten. Gebruik vervolgens een P 1000 pipet om voorzichtig 500 microliter van de INS een celsuspensie op de hex-celllaag langs de zijkanten van de put toe te voegen. Gebruik na elke zes putten een 10 milliliter pipet om de INS een cellen opnieuw te suspenderen.
Nogmaals om een homogene celsuspensie te garanderen. Bewaar de cellen nu 24 tot 48 uur, afhankelijk van het experimentele protocol. Nadat de cellen gedurende de gewenste experimentele periode zijn geïncubeerd, aspireer de co-cultuurmedium met één hand en vervang onmiddellijk het medium met 250 microliter van 2,5 millimolair glucose in Krebs ringer bicarbonatebuffer met de andere hand.
Nadat de co-culturen een uur zijn voorgeïncubeerd, vervang de lage glucose KRB-buffer met 250 microliter van 2,5 millimolair of 20 millimolair glucose. Na nog een uur incubatie, breng de KRB-buffer over naar microfugebuizen en centrifugeer de buffer gedurende vijf minuten bij 1500 Gs en vier graden Celsius terwijl de buizen in de centrifuge staan. Voeg onmiddellijk 100 microliter rippa-celliysebuffer met proteaseremmers toe aan de plaat en incubeer de plaat gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius.
Wanneer de buizen klaar zijn met centrifugeren, verwijder 200 microliter van de supernatant voor latere analyse door insuline-radio-immuno-assay of Eliza. Spin tenslotte wat nu cellysaat is gedurende 15 minuten bij 10.000 gs en verwijder vervolgens 50 microliter van de SNAT voor analyse door insuline-radio-immuno-assay of Eliza. Hier worden de resultaten weergegeven die zijn verkregen uit de co-cultuur van INS een bètacellen met HC 2 93 cellen die zijn getransfecteerd om een neuroliggine-isovorm te tot expressie te brengen, hier aangeduid als NLX.
De expressie van NLX verhoogde de basale en gestimuleerde insulinesecretie door de geco-cultiveerde I NS een cellen. Het NX-extracellulaire domein moet interageren met een ander eiwit of molecuul op het I NS een-celoppervlak om de INS een-cellen meer insuline te laten secreteren. De resultaten van andere soorten analyses met behulp van het co-cultuursysteem zijn weergegeven in deze volgende twee grafieken.
In deze eerste grafiek wordt de toename in insuline-inhoud van de geco-cultiveerde INS een cellen door NLY weergegeven. Terwijl in dit experiment RNA uit de cellayar werd verzameld en geanalyseerd door R-T-Q-P-C-R. De co-cultuur met NLY verhoogde de insuline en PDX een mRNA-niveaus.
Volgend op deze procedure kunnen aanvullende methoden zoals QPCR of kwantitatieve immunohistochemie worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of extracellulaire interacties van het getransfecteerde eiwit veranderingen in celstructuur of genexpressie kunnen veroorzaken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de rol van transcellulaire eiwitinteracties in de functie van pancreatische bètacellen, met een specifieke focus op insulinesecretie. De methode omvat het co-cultiveren van getransfecteerde HEK293-cellen met bètacellen om de invloed van specifieke transmembraaneiwitten te beoordelen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Endocrinologie
Achtergrond
- Transcellulaire interacties zijn cruciaal voor de functionaliteit van bètacellen.
- Insulinesecretie is een sleutelproces dat door deze interacties wordt beïnvloed.
- Bestaande methoden kunnen de gezondheid van de bètacellen verstoren, wat analyses bemoeilijkt.
- Deze studie heeft tot doel een meer verfijnde benadering te bieden.
Doel van de studie
- Onderzoeken hoe specifieke transmembraaneiwitten de insulinesecretie beïnvloeden.
- Een co-cultuurmodel gebruiken om directe verstoring van bètacellen te minimaliseren.
- De impact van glucoseconcentraties op de insulinevrijgave beoordelen.
Gebruikte methoden
- Transfecteren van HEK293-cellen met plasmiden die de eiwitten van belang bevatten.
- Co-cultiveren van getransfecteerde HEK293-cellen met bètacellen.
- Incuberen van co-culturen in media met variërende glucoseconcentraties.
- Gebruiken van insulinereadio-immunassays of ELISA's om de insulinsecretie te meten.
Belangrijkste resultaten
- De invloed van specifieke transmembraaneiwitten op de insulinesecretie is aangetoond.
- Er is aangetoond dat de glucoseconcentratie de insulineafgifte in co-gecultiveerde cellen beïnvloedt.
- De effectiviteit van de methode is gevalideerd in vergelijking met traditionele perturbatietechnieken.
- Er is inzicht verschaft in de mechanismen van de bètacelfunctie.
Conclusies
- De co-cultuurmethode maakt het mogelijk om eiwitinteracties te bestuderen zonder de gezondheid van de bètacellen te verstoren.
- De verkregen inzichten kunnen toekomstig onderzoek naar diabetes en de functie van bètacellen informeren.
- Deze benadering kan leiden tot een beter begrip van de mechanismen van insulinesecretie.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Het begrijpen van transcellulaire eiwitinteracties is essentieel voor het verminderen van risico's bij de validatie van bètacel-doelen in het onderzoek naar geneesmiddelen tegen diabetes. Deze co-culturemethode maakt mechanistische analyse mogelijk van de effecten van extracellulaire eiwitten op de insulinesecretie zonder de gezondheid van de bètacellen aan te tasten, wat bijdraagt aan een voorspellende zekerheid bij de selectie van doelen. Het pakt een cruciale uitdaging in de ontdekkingsfase aan: het onderscheiden van echte transcellulaire signalering van intracellulaire storende factoren in pathway-analyses.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt functionele beoordeling mogelijk van interacties tussen transmembraaneiwitten bij de insulinesecretie, terwijl de integriteit van de bètacellen behouden blijft.
- Operationele waarde: Voorkomt artefacten door mRNA/eiwit-knockdown of -overexpressie die target-validatiestudies kunnen vertroebelen.
- Strategische waarde: Ondersteunt hypothesegestuurde screening van extracellulaire interactoren voor het verminderen van risico's bij bètacel-signaleringspaden.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantitatieve resultaten van insulinesecretie onder gecontroleerde glucosestimulatie voor standaardisatie van de assay.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van HEK293-cellen als een instelbaar platform voor extracellulaire eiwitpresentatie voor reproduceerbare co-cultuurassays.
- Strategische waarde: Maakt schaalbare evaluatie mogelijk van kandidaateiwitten die de bètacelfunctie beïnvloeden in een fysiologisch relevant formaat.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppelt extracellulaire proteïne-interacties aan de functionele rijping van bètacellen en glucose-responsieve insulineafgifte.
- Operationele waarde: Compatibel met primaire gedisassocieerde bètacellen en bètacellijnen voor cross-model validatie.
- Strategische waarde: Biedt een ziekterellevant systeem om targets te prioriteren met potentieel voor translationele biomarker-afstemming.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van target engagement tot functionele validatie, waarbij specifiek de identificatie van lead-verbindingen wordt ondersteund door mechanistische risicoreductie van bètacelpaden.
- Discovery Biology: Test hoe specifieke extracellulaire domeinen van transmembraaneiwitten de insulinesecretie van bètacellen moduleren in een gecontroleerd co-cultuursysteem.
- Screening: Maakt gestandaardiseerde, reproduceerbare beoordeling van de insulinesecretie onder verschillende glucosecondities mogelijk met behulp van radioimmunoassay of ELISA.
- Analytics: Levert kwantitatieve metingen van de afhankelijke variabele (insulinewaarden) die vergelijking van de effecten van eiwitinteracties onder gedefinieerde experimentele omstandigheden mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt fenotypen van extracellulaire interacties met veranderingen in insulinegehalte en genexpressie (bijv. insuline, PDX1 mRNA) voor preklinische continuïteit.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar co-cultuurplatform voor het onderzoeken van meerdere transmembraaneiwitten zonder de kernprocedures voor de behandeling van bètacellen opnieuw te hoeven vormgeven.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in bètacel-signalering door transcellulaire effecten te isoleren van intracellulaire verstoringen.
- Operationele waarde: Standaardiseert de co-cultuurworkflow met gedefinieerde stappen voor transfectie, incubatie en secretie-assays voor consistentie tussen teams.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen bij targetvalidatie door functionele gegevens over insulinesecretie te leveren die niet worden beïnvloed door artefacten gerelateerd aan de gezondheid van de bètacellen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van gevalideerde effecten op glucosegestimuleerde insulinesecretie.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in transfectie van zoogdiercellen, co-cultuurtechnieken en assays voor glucosegestimuleerde insulinesecretie.
- Is afhankelijk van controles voor transfectie-efficiëntie en de juiste vorming van de HEK293-cellaag voor een consistente eiwitpresentatie.
- Vereist standaardisatie van glucose-challenge-protocollen en methoden voor insulinekwantificering (radioimmunoassay of ELISA) over verschillende experimenten heen.
- Omvat overwegingen voor adaptatie bij uitbreiding naar primaire bètacellen of alternatieve bètacellijnen naast INS-1.
- Beperkt tot de analyse van extracellulaire eiwitinteracties; intracellulaire signaleringsdomeinen kunnen niet direct worden onderzocht zonder aanvullende methoden.
