Name: Coculture Analyse van extracellulaire eiwit interacties met invloed op de insulinesecretie door bètacellen in de pancreas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Leer cocultuur-analyse van extracellulaire eiwitinteracties die insulinesecretie door bètacellen beïnvloeden. Deze methode gebruikt HEK293-cellen en bètacellen om glucose-afhankelijke insulineafgifte te bestuderen zonder celgezondheid te verstoren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health subsidie ​​R01DK080971 en Juvenile Diabetes Research Foundation subsidie ​​37-2009-44. We waarderen ook ontvangen van de UCSD Pediatric Diabetes Research Center (PdRC) ondersteuning.

1. Transfectie van HEK293 Layer <ol><li> Bereid HEK293 celmedium door aan 500 ml flessen DMEM (met 4,5 g / ml glucose en fenolrood en zonder glutamine): 50 ml FBS, 5 ml 100X penicilline / streptomycine-oplossing, 5 ml 100x L-glutamine-oplossing en 500 pi amfotericine B. </li><li> Plaat uit HEK293 cellen in een 24-wells plaat met 0,5 ml HEK293 media per putje. Zorg ervoor dat de cellen gelijkmatig worden verdeeld over de bodem van de plaat. </li><li> Wanneer HEK293 cellen 100% samenvloeiing bereiken, transfecteren met 0,8 ug van plasmide codeert het eiwit van belang (ingevoegd in een zoogdierlijke expressievector) en 2 pl Lipofectamine 2000 volgens het lipofectamine protocol. We hebben ervoor gekozen om de pcDNA 3.3 ruggengraat ontworpen voor expressie in zoogdiercellen te gebruiken. </li><li> Eventueel, na 6 uur incubatie, wisselen de transfectie media beschreven in de Lipofectamine protocol met normale HEK293 media. </li><li> Om expressie van het getransfecteerde prote evaluerenin, kan een subset van de getransfecteerde weefselkweekputjes worden gebruikt voor immunofluorescentie detectie van het tot expressie gebrachte eiwit of Western blot analyse van eiwitexpressie met behulp van standaardtechnieken. </li></ol> 2. Optioneel Fixatie van HEK293 cellen die Getransfecteerde Protein Getransfecteerde HEK293 cellen voorzichtig om gemengde cultuurmedium in media die schadelijk levende HEK293 cellen (bijv. stap 3.9 hieronder) of de efficiënte bereiding van tevoren platen meerdere experimenten in een keer mogelijk maakt (zie discussie) zou kunnen worden vergemakkelijkt worden vastgesteld. <ol><li> Voeren modelstudies het tijdsverloop van de expressie van het eiwit in de HEK293 cellen te bepalen. </li><li> Na transfectie van de HEK293 cellaag, zuig het medium van de cellen bij de post-transfectie tijdstip in verband met het hoogste niveau van expressie. Indien dit gebeurt binnen de eerste 24 uur, niet aspireer pas 24 uur na transfectie. </li><li> Wassen HEK293 cellen voorzichtig met D-PBS voeg 500 ul 4% paraformaldehyde (PFA) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. (Tot 4% PFA-oplossing te maken, te beginnen met 16% oplossing in 1X PBS en verdunnen 1:04 met 1X PBS.) </li><li> Met steriele PBS voorzichtig was de cellen 3 keer in PBS en incubeer O / N bij 4 ° C. </li><li> Was de cellen 3 maal met steriel PBS, dan PBS toe en laat bij 4 ° C totdat het nodig is (maximale bewaartijd is afhankelijk van eiwitten tot expressie. We slaan HEK293-cellen die aan neuroligin isovormen uitspreken voor maximaal 2 weken zonder significante veranderingen in de waargenomen effecten op de insuline secretie). </li></ol> 3. Co-kweken van INS-1 Beta Cellen met HEK293 Cells <ol><li> Bereid INS-1 media door aan 500 ml RPMI 1640 (met glucose en fenolrood en zonder glutamine): 50 ml FBS, 5 ml 100X penicilline / streptomycine, 5 ml 100x L-glutamine-oplossing, 5 ml natrium pyruvaat, 500 gl amfotericine B, 500 ui beta-mercaptoethanol (dit is bijna identiek aan de medium typisch gebruikt voor de primaire kweek eilandje behalve de toevoeging van beta-mercaptoethanol). </li><li> Met behulp van Cell-stripper (of een ander niet-enzymatische cel remover), oogst INS-1 cellen bij ongeveer 70-80% confluentie door de bodem van een T75 kolf. Elke fles zal ongeveer voldoende cellen voor 48 putjes. </li><li> Na stoppen met draaien cellen in de centrifuge gedurende 3 minuten bij 1200 rpm, resuspendeer in een 50/50 mengsel van INS-1 en HEK media. Voor een 70-80% samenvloeiing kolf van INS-1-cellen, opnieuw in suspensie in circa 25 ml van mixed media. </li><li> Bij gebruik van HEK293 cellen die in paraformaldehyde vastgesteld in plaats van levende HEK293 cellen, resuspendeer de INS-1 cellen in 100% INS-1 media in plaats van mixed media. </li><li> Pipetteer 10 ml, los van de cellen van de pellet tot een homogene celsuspensie te maken. </li><li> Aspireren om de media op de HEK293 cellen te verwijderen. </li><li> Met behulp van een P1000 pipet voorzichtig 500 ul van INS-1 celsuspensie op de HEK cellaag langs de zijkanten of het goed. Na elke 6 putten, gebruik dan een pipet 10 ml van de INS-1-cellen weer opnieuw in suspensie om een ​​homogene celsuspensie te garanderen. De opzet van de co-cultuur opstelling is weergegeven in figuur 1. </li><li> Incubeer de cellen gedurende 24-48 uur, afhankelijk van het experimentele protocol. </li><li> Als er meer dan 48 uur coculture periode is vereist, gebruik optionele stappen in paragraaf 2 hierboven om de HEK293 cellen te repareren. </li><li> Bij gebruik van primaire los knaagdier of menselijke eilandjes [zie bijv. voorafgaande protocollen in JoVE 11-15], ervoor zorgen dat een geschikte media zoals RPMI met 5 ml pen / strep, 5 wordt ml L-Glut, 0,5 ml amfotericine-B gebruikt in plaats van INS-1 media. Hoewel men kan gebruiken los eilandje cellen in een 24 wells plaat, in de praktijk vanwege het grote aantal eilandjes potentieel nodig is, is het aanbevolen dat de aandacht naar beneden worden gegeven aan schaalvergroting een 48 well plaat (noodzakelijk minder eilandje cellen per well). Op een 48 well plaat, voeg ongeveer 100 eilandjes ter waarde van dissociatieted cellen per plaat te beginnen. Afhankelijk van de werkzaamheid van dissociatie en de methode kan minder eilandjes nodig. </li></ol> 4. Glucose gestimuleerde insuline secretie <ol><li> Preincubate cellen in 250 pi 2,5 mM glucose in KRB (Krebs-Ringer bicarbonaat buffer) gedurende ten minste 1 uur. Om preincubate, verwijdert coculture middelgrote en direct te vervangen door KRB. Deze uitwisseling dient te gebeuren een putje in een tijd om blootstelling van INS-1 cellen om milieu zuurstof te minimaliseren. Aspireren met een hand terwijl pipetteren de lage (2,5 mM) glucose KRB met de andere. </li><li> Exchange voorincubatie KRB 250 ui of 2,5 mM of 20 mM glucose in KRB buffer een putje per keer. </li><li> Indien nodig voor de specifieke experiment kunnen aanvullende afscheiding zoals 100 uM IBMX worden toegevoegd aan een robuustere gestimuleerde insuline secretie respons teweeg. Gedissocieerde primaire eilandje beta-cellen in het bijzonder zijn slecht reageren op verhoogde glucoseconcentraties alone, dus even bijzonder toevoeging van IBMX of andere afscheiding worden overwogen 16,17. </li><li> Na 1 uur incubatie, overdracht media microfuge buizen en spin 1500 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder de 200 pi van het supernatant en gebruik deze voor analyse door insuline RIA of ELISA. </li><li> Om cellysaat bereiden, voeg 100 ul RIPA cell lysis buffer (150 mM NaCl, 1,0% IGEPALCA-630 en Nonidet P-40, 0,5% natriumdeoxycholaat, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH 8,0) met proteaseremmers de plaat onmiddellijk na het verwijderen van media en incuberen bij 4 ° C gedurende 20 minuten. </li><li> Gedeactiveerd lysaat gedurende 15 minuten bij 10.000 xg en verwijder 50 pl supernatant voor analyse door insuline RIA of ELISA. </li></ol>

<ol><li>Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+islet+structure+and+cellular+interactions+in+the+control+of+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion.</a> Islets. 3, 41-47 (2011).</li>
<li>Konstantinova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA-Ephrin-A-mediated+beta+cell+communication+regulates+insulin+secretion+from+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets.</a> Cell. 129, 359-370 (2007).</li>
<li>Jain, R., Lammert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+interactions+in+the+endocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Obes.+Metab%22%5BJournal%5D)">Cell-cell interactions in the endocrine pancreas.</a> Diabetes Obes. Metab. 11, Suppl 4. 159-167 (2009).</li>
<li>Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-secreting+cell+lines%3A+classification%2C+characteristics+and+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab%22%5BJournal%5D)">Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications.</a> Diabetes Metab. 22, 7-14 (1996).</li>
<li>Craig, A. M., Graf, E. R., Linhoff, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+build+a+central+synapse%3A+clues+from+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">How to build a central synapse: clues from cell culture.</a> Trends in Neurosciences. 29, 8-20 (2006).</li>
<li>Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroligin+expressed+in+nonneuronal+cells+triggers+presynaptic+development+in+contacting+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons.</a> Cell. 101, 657-669 (2000).</li>
<li>Abderrahmani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+traits+are+required+for+glucose-induced+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Neuronal traits are required for glucose-induced insulin secretion.</a> FEBS Lett. 565, 133-138 (2004).</li>
<li>Lowe, A. W., Madeddu, L., Kelly, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+secretory+granules+and+neuronal+synaptic+vesicles+have+three+integral+membrane+proteins+in+common%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endocrine secretory granules and neuronal synaptic vesicles have three integral membrane proteins in common.</a> The Journal of Cell Biology. 106, 51-59 (1988).</li>
<li>Suckow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+neurexin%2C+neuroligin%2C+and+their+cytoplasmic+binding+partners+in+the+pancreatic+beta-cells+and+the+involvement+of+neuroligin+in+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Expression of neurexin, neuroligin, and their cytoplasmic binding partners in the pancreatic beta-cells and the involvement of neuroligin in insulin secretion.</a> Endocrinology. 149, 6006-6017 (2008).</li>
<li>Suckow, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+neuroligin-2+interactions+enhance+insulin+secretion+and+are+integral+to+pancreatic+beta+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transcellular neuroligin-2 interactions enhance insulin secretion and are integral to pancreatic beta cell function.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287, 19816-19826 (2012).</li>
<li>Kohnert, K. D., Hehmke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+suspensions+of+pancreatic+islet+cells%3A+a+comparison+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+Biophys.+Methods%22%5BJournal%5D)">Preparation of suspensions of pancreatic islet cells: a comparison of methods.</a> J. Biochem. Biophys. Methods. 12, 81-88 (1986).</li>
<li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreatic+islet+isolation%3A+Part+I%3A+digestion+and+collection+of+pancreatic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue.</a> J. Vis. Exp. (27), e1125(2009).</li>
<li>Qi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pancreatic+islet+isolation%3A+Part+II%3A+purification+and+culture+of+human+islets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets.</a> J. Vis. Exp. (27), e1343(2009).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+pancreatic+islet+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine pancreatic islet isolation.</a> J. Vis. Exp. (7), e255(2007).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2096(2011).</li>
<li>Hauge-Evans, A. C., Squires, P. E., Persaud, S. J., Jones, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+beta-cell-to-beta-cell+interactions+are+required+for+integrated+responses+to+nutrient+stimuli%3A+enhanced+Ca2%2B+and+insulin+secretory+responses+of+MIN6+pseudoislets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets.</a> Diabetes. 48, 1402-1408 (1999).</li>
<li>Spiess, Y., Smith, M. A., Vale, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superfusion+of+dissociated+pancreatic+islet+cells+attached+to+Cytodex+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Superfusion of dissociated pancreatic islet cells attached to Cytodex beads.</a> Diabetes. 31, 189-193 (1982).</li>
<li>Pham, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+gene+expression+in+HEK293+cells%3A+peptone+addition+posttransfection+improves+recombinant+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis.</a> Biotechnol. Bioeng. 90, 332-344 (2005).</li>
<li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+a+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Toxicol.+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 187-200 (2005).</li>
<li>Maurisse, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+transfection+of+DNA+into+primary+and+transformed+mammalian+cells+from+different+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages.</a> BMC Biotechnol. 10, 9(2010).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

De co-cultuur hier beschreven methode een effectieve manier om de fysiologische betekenis van specifieke beta-celoppervlak transmembraan eiwitten bepalen en specifiek hun extracellulaire domeinen. Door kweken beta cellen of insulinoma cellen (zoals de INS-1 cellen zijn hier toegepast) in contact met HEK293 cellen die een eiwit van belang op het celoppervlak, kan experimenten om de effecten van extracellulair eiwit-eiwit interacties bepalen zonder direct verstoren het intracellulaire milieu van de cellen. Omdat de eiwitt...

We beschrijven hier een methode om onderzoeken hoe de extracellulaire domeinen van transmembraan proteïnen specifieke invloed insulinesecretie vergemakkelijken. De werkwijze probes de effecten van interacties van het eiwit van belang met eiwitten (of mogelijk andere moleculen) op de beta-cel oppervlak. De werkwijze maakt onderzoeken hoe celoppervlak eiwitten door beta-cellen of andere naburige cellen (bijv. endotheelcellen, neuronen, pancreas alfa-cellen) tot expressie beïnvloeden beta-celfunctie door transcellulaire interacties (dat wil zeggen door interactie met interactiepartners op het oppervlak van aangrenzende beta-cellen). De cellulaire plasmamembraan bevat een complexe reeks van structurele en functionele eiwitten dienen als brug de extracellulaire omgeving. Door de vorming van transcellulaire aansluitingen of door initiatie van plastic signalering evenementen, kunnen interacties tussen cel-oppervlakte-eiwitten helpen bij het coördineren van defunctie van naburige cellen. Bètacellen in de pancreas worden geclusterd binnen de alvleesklier eilandjes en op een gecoördineerde wijze als glucose homeostase 1 te behouden. Zoals geopenbaard, bijvoorbeeld door het belang van extracellulaire EphA-ephrinA en neuroligin 2-interacties in de regulatie van glucose-gestimuleerde insuline secretie, wordt steeds duidelijker dat betere kennis van de extracellulaire interactie optreedt tussen eiwitten op de oppervlakken van aangrenzende bètacellen zal van groot belang zijn voor het verkrijgen van een volledig begrip van de insuline secretie, beta-cel functionele rijping en het onderhoud van de glucose homeostase 1-3. Het doel van de hier beschreven methode voor onderzoek naar de effecten mogelijk over beta-celfunctie van transcellulaire interacties van specifieke of anderszins transmembraan-celoppervlak-geassocieerde eiwitten. Door co-kweken van beta-cellen met HEK293 cellen getransfecteerd met verschillende expressie constructen, de effecten op de beta celfunctie verschillende celoppervlak eiwitten of gemuteerde varianten daarvan kan efficiënt worden onderzocht. Dit wordt bereikt zonder dat de bètacellen zelf transfecteren. Opheldering van de rol van specifieke transcellulaire interacties door knockdown, knockout of overexpressie studies in gekweekte beta-cellen of in vivo noodzakelijk directe verstoring van beta-cel mRNA en eiwit expressie, met mogelijke gevolgen voor beta cel gezondheid en / of functie op een manier die analyses van zou kunnen verwarren de effecten van specifieke extracellulaire interacties. Deze zal ook veranderen niveaus van de intracellulaire domeinen van de beoogde eiwitten en verder geen effecten door interacties tussen eiwitten in of in dezelfde cel worden onderscheiden van de effecten van transcellulaire interacties mogelijk. Hier wordt een werkwijze voor het bepalen van het effect van specifieke transcellulaire interacties op het insuline-capaciteit en responsiviteit van bètacellen described. Deze methode is toepasbaar voor insuline-afscheidende bèta-cellijnen, zoals INS-1 cellen 4, en gedissocieerde primaire knaagdieren of humane B-cellen. Het is gebaseerd op co-cultuur modellen ontwikkeld door neurobiologists die dat blootstelling van gekweekte neuronen specifieke neuronale eiwitten die op HEK293 (of COS) cellagen gevonden kunnen eiwitten die drive synapsvorming 5,6 identificeren. Gezien de parallellen tussen de secretie machinerie van neuronale synapsen en van beta-cellen, redeneerden we dat bèta-celfunctie en functionele rijping zou kunnen worden gedragen door soortgelijke transcellulaire interacties 7-9. Om deze interacties probe, we de hierin beschreven waarin betacellen tezamen gekweekt op een laag van HEK293 cellen die een eiwit van interesse 10 ontwikkeld. Dit systeem maakt het beta-cel cytoplasma onaangetast blijven terwijl extracellulair eiwit-eiwit interacties worden gemanipuleerd.

<table><tbody><tr><td>pcDNA 3.3 vector/backbone</td><td>Invitrogen</td><td>K830001</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>18324012</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Mediatech</td><td>45001-312</td><td></td></tr><tr><td>Pen/strep oplossing</td><td>Mediatech</td><td>45001-652-1</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Mediatech</td><td>45001-808-1/30</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Mediatech</td><td>45001-404</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Mediatech</td><td>45001-434</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvaat</td><td>Mediatech</td><td>45001-710-1</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercapt&#8211;thanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Cell stripper</td><td>Mediatech</td><td>45000-668</td><td></td></tr><tr><td>T75 Flask</td><td>BD</td><td>1368065</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>50980487</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Mediatech</td><td>45001-130</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum</td><td>Mediatech</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Sigma</td><td>I5879-100MG</td><td></td></tr><tr><td>RIPA lysis buffer</td><td>Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr></tbody></table>

coculture analyse van extracellulaire eiwit interacties met invloed op de insulinesecretie door bètacellen in de pancreas

Coculture Analysis of Extracellular Protein Interactions Affecting Insulin Secretion by Pancreatic Beta Cells

Interacties tussen cel-oppervlakte-eiwitten helpen bij het coördineren van de functie van naburige cellen. Bètacellen in de pancreas worden geclusterd binnen pancreaseilandjes en handelen op een gecoördineerde wijze aan glucose-homeostase te behouden. Het wordt steeds duidelijker dat interacties tussen transmembraan eiwitten op het oppervlak van de aangrenzende bètacellen zijn belangrijke determinanten van bèta-celfunctie. Opheldering van de rol van specifieke transcellulaire interacties door knockdown, knockout of overexpressie studies in gekweekte beta-cellen of in vivo noodzakelijk directe verstoring van mRNA en eiwit expressie, met mogelijke gevolgen voor beta-cel gezondheid en / of functie op een manier die analyses van de effecten zou kunnen verwarren specifieke interacties. Deze benaderingen verandert ook het niveau van de intracellulaire domeinen van de beoogde eiwitten en kunnen effecten als gevolg van interacties tussen eiwitten voorkomen binnen dezelfde celmembraan te distinguished tegen de gevolgen van transcellulaire interacties. Hier een werkwijze voor het bepalen van het effect van specifieke transcellulaire interacties op het insuline-capaciteit en responsiviteit van bètacellen gepresenteerd. Deze methode is toepasbaar voor beta-cellijnen, zoals INS-1-cellen, en gedissocieerde primaire bètacellen. Het is gebaseerd op co-cultuur modellen ontwikkeld door neurobiologists die dat blootstelling van gekweekte neuronen specifieke neuronale eiwitten die op HEK293 (of COS) cellagen geïdentificeerde eiwitten belangrijk voor een synapsvorming gevonden. Gezien de parallellen tussen de secretie machinerie van neuronale synapsen en van beta-cellen, redeneerden we dat beta-cel functionele rijping zou kunnen worden gedragen door soortgelijke transcellulaire interacties. We hebben een systeem ontwikkeld waarbij beta-cellen worden gekweekt op een laag van HEK293 cellen die een eiwit van interesse. In dit model wordt de beta-cel cytoplasma onaangeroerd terwijl extracellulair eiwit-eiwit Interactiens worden gemanipuleerd. Hoewel wij hierbij voornamelijk richten op studies van glucose-gestimuleerde insuline secretie, kunnen andere processen worden geanalyseerd, bijvoorbeeld veranderingen in genexpressie bepaald door immunoblotting of qPCR.

Als hier beschreven, hebben we het effect van verschillende varianten van de proteïne neuroligin op insulinesecretie getest. Dit vult onze gepubliceerde werk wordt de invloed van neuroligin 2-on beta-celfunctie 10. Figuur 2, bijvoorbeeld, toont resultaten van coculturing INS-1 beta-cellen HEK293 cellen getransfecteerd met een expressie neuroligin isovorm hier aangeduid als NL- X. Dit experiment werd ontworpen om de hypothese dat NL-X transcellulaire bezighoudt met interacties verhogen insulin...

Transcellulaire eiwit interacties zijn belangrijke determinanten van beta-cel functie. Hier beschreven is een methode-aangepast van een co-cultuur model van synaptogenesis-voor het onderzoeken hoe specifieke transmembraaneiwitten beïnvloeden insuline secretie. Getransfecteerde HEK293 cellen brengen eiwitten van belang; beta-cellen hoeven niet te worden getransfecteerd of anderszins direct verstoord.

Coculture Analyse van extracellulaire eiwit interacties met invloed op de insulinesecretie door bètacellen in de pancreas

Interactions between cell-surface proteins help coordinate the function of neighboring cells. Pancreatic beta cells are clustered together within ...

Het algemene doel van deze procedure is om te onderzoeken hoe transcellulaire interacties via de extracellulaire domeinen van specifieke transmembraaneiwitten de functie van bètacellen en meer specifiek de insulinesecretie beïnvloeden. Dit wordt bereikt door in eerste instantie een zoogdiercellijn te transfecteren met een plasmide dat het eiwit van belang bevat; in de tweede stap wordt een bètacellijn gecocultiveerd met de zoogdiercellen.In de laatste stap wordt de co-cultuur geïncubeerd in medium met verschillende glucoseconcentraties om de glucosegestimuleerde insulinesecretie te kunnen beoordelen. Uiteindelijk worden insulineradio-immunassays of ELISA's gebruikt om de hoeveelheden insuline te bepalen die door de gecultiveerde bètacellen in het medium zijn uitgescheiden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals gen-overexpressie en knockdown, is dat verstoring van de mRNA- en eiwitexpressie wordt vermeden, wat mogelijk de gezondheid en/of functie van de bètacellen beïnvloedt op een manier die analyses van de specifieke interactie van het eiwit kan bemoeilijken.Begin met het overbrengen van de HEC 2 93-cellen naar een 24-wellplaat in

coculture-analysis-extracellular-protein-interactions-affecting

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

De huidige studie beschrijft een gerichte aanpak van differentiatie in het induceren van de alvleesklier differentiatie van humane embryonale stamcellen. Van grote betekenis is de bevinding dat endotheelcel co-cultuur bemiddelt rijping van menselijke embryonale stamcellen afkomstig van de pancreas voorlopercellen in insuline tot expressie brengen.

Endotheelcel Co-cultuur Bemiddelt Rijping van menselijke embryonale stamcellen te Pancreatic insuline producerende cellen in een Geregisseerd Differentiatie aanpak

Het testen in vitro β-celfunctie met geïsoleerde eilandjes van Langerhans muis is een belangrijke component in de studie van diabetes pathofysiologie en therapie. Terwijl veel downstream applicaties beschikbaar zijn, dit protocol beschrijft specifiek de meting van intracellulaire cyclische adenosine monofosfaat (cAMP) als een essentiële parameter bepalen van β-cel functie.

Een methode voor muis eilandjes van Langerhans Isolatie en intracellulaire cAMP Bepaling

Cruciale uitdagingen voor het onderzoeksgebied diabetes zijn de moleculaire mechanismen die eilandje β-cellen replicatie en op werkwijzen voor het stimuleren van β-celregeneratie ontwikkelen begrijpen. Hierin een high-gehalte screening methode voor het identificeren en evalueren van de β-cel-replicatie bevorderende activiteit van kleine moleculen wordt gepresenteerd.

Een High-gehalte<em&gt; In Vitro</em&gt; Eilandjes van Langerhans β-cel Replication Discovery Platform

Bèta-cel functie is belangrijk voor de homeostase van de bloedglucose, die bij eencellige resolutie met behulp van een genetisch gecodeerde verslaggever voor calcium toestroom wordt geëvalueerd.

Analyse van bèta-cel functie met behulp van de resolutie van de eencellige Calcium Imaging in Zebrafish eilandjes

Ex vivo alvleesklier islet studies zijn belangrijk voor onderzoek naar diabetes. Bestaande technieken om te studeren van gekweekte eilandjes in hun oorspronkelijke 3-dimensionale architectuur zijn zelden gebruikte, tijdrovend en inefficiënt. Dit werk beschrijft een nieuwe, eenvoudige en efficiënte methode voor het genereren van kwalitatief hoogwaardige paraffine secties van hele gekweekte eilandjes.

Alvleesklier Islet insluiten voor paraffine secties

Dit protocol schetst een methode voor kwantitatieve analyse van mitophagy eiwit complexvorming specifiek in bètacellen van primaire menselijke eilandje monsters. Deze techniek maakt dus analyse van mitophagie van beperkt biologisch materiaal mogelijk, die cruciaal zijn in de voorbeelden van kostbare humane alvleesklier bètacellen.

Visualisatie van endogene Mitophagie complexen in situ in humane pancreas Bètacellen met behulp van proximity Ligatie test

In dit protocol wordt beschreven hoe u snelle Low-cost Luciferase-analyses uitvoeren bij medium-throughput met behulp van een insuline-linked Gaussia Luciferase als proxy voor insuline secretie van beta-cellen. De assay kan uitgevoerd worden met de meeste luminescentie plaat lezers en multichannel pipetten.

Meten van relatieve insuline secretie met behulp van een co-afgescheiden Luciferase surrogaat

Dit protocol beschrijft een methode voor de synchrone acquisitie en co-registratie van intracellulaire signaleringsgebeurtenissen en de secretie van insuline en glucagon door primaire menselijke pseudo-eilandjes met behulp van de adenovirale toediening van een cyclische adenosinemonofosfaat (cAMP) biosensor, een cAMP-verschildetector in situ (cADDis) en een microperifusiesysteem.

Menselijk pseudo-eilandsysteem voor synchrone beoordeling van fluorescerende biosensordynamica en hormoonsecretoire profielen

Deze studie maakt gebruik van multi-kleuring fluorescentie-gebaseerde markers van celdood en apoptose in combinatie met confocale microscopie om cytokine-geïnduceerde apoptose en β-celspecifieke dood in pancreaseilandjes te beoordelen. Het onthult ruimtelijke en temporele veranderingen in celdood en apoptose als reactie op extracellulaire stimuli.

Geïsoleerde behandeling van pancreaseilandjes en meting van apoptose

Deze studie ontwikkelde een vereenvoudigde methode om efficiënt functionele primaire eilandjes en acinaire cellen uit de muizenalvleesklier te extraheren, wat een waardevol hulpmiddel biedt voor het bestuderen van intercellulaire communicatie in de pathogenese van Acute Pancreatitis-geïnduceerde Diabetes.

Een eenvoudige en snelle methode voor gelijktijdige isolatie van primaire eilandjes en primaire alvleesklier-acinaire cellen van muizen

Leer cocultuur-analyse van extracellulaire eiwitinteracties die insulinesecretie door bètacellen beïnvloeden. Deze methode gebruikt HEK293-cellen en bètacellen om glucose-afhankelijke insulineafgifte te bestuderen zonder celgezondheid te verstoren.

Coculture Analyse van extracellulaire eiwit interacties met invloed op de insulinesecretie door bètacellen in de pancreas

Meer video's verkennen