Name: Kweken Primaire Rat Inner Medullary Verzamelen Duct Cells (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Leer primaire rat inner medullary collecting duct cellen kweken voor onderzoek naar arginine-vasopressine-gemedieerde waterresorptie. Dit protocol maakt moleculaire studies van nierfysiologie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, KL 1415/3-2 en KL 1415/4-2).

1. Voorbereiding <ol><li> Voorbereiden van de cultuur gerechten <ol><li> Ontdooi Collageen Type IV O / N bij 4 ° C en oplossen in steriele 0,1% azijnzuur. Het volume is afhankelijk van het soort en aantal schotels waarin de cellen worden gezaaid. Gebruik 2 ug / cm 2. </li><li> Incubeer gerechten tenminste gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en twee keer wassen met gedestilleerd water (A. tridest). </li><li> Laat de gerechten goed drogen. </li></ol></li><li> Suppletie van middelgrote <ol><li> Verhoging van het glucosegehalte tot 4,5 g / L door het toevoegen van 1,75 g glucose tot 500 ml medium. Aan het medium tot 600 mosmol passen, voeg 100 mM NaCl en 100 mM ureum, aan de osmolariteit te verhogen met 200 mosmol en 100 mOsmol, respectievelijk. </li><li> Voeg 1% niet-essentiële aminozuren, 1% ultroser, 500 uM dbcAMP, 20 U / ml nystatine en 0,25 ug / ml gentamicine (1:200 verdunning van voorraad-oplossing met een concentratie van 50 ug / ml) tot 600 mosmol DMEM medium vers op de dag van bereiding. </li></ol></li&gt; <li> Enzymoplossing <ol><li> Voeg 1 mg / ml hyaluronidase en 2,2 mg / ml collagenase aan DPBS-dat 0,25 ug / ml gentamicine en nystatine. Bereid 1 ml van de enzymoplossing voor de vertering van 2 nieren binnen medullae. De oplossing moet worden gesteriliseerd door filtratie en bewaard in 50 ml Falcon buizen. </li></ol></li></ol> 2. Teelt van primaire Rat Inner Medullair Verzamelen Duct (IMCD) Cells Alle procedures voor de behandeling van dieren in overeenstemming moeten worden uitgevoerd met de lokale en federale regelgeving. <ol><li> Verdoven ratten in CO 2 (in een doos verzadigd met CO 2) of isofluraan (U-400 Anesthesie-eenheid, Univentor Ltd, Malta; luchtstroom 350-400 ml / min met 2-2,5% isofluraan). Onthoofden de dieren voor bloedingen die precieze detectie van de grens tussen de witachtige binnenste en de donkere buitenste medulla toelaat. Bovendien minimaliseert de bloeding het aantal geïsoleerde erytrocyten. Verwijder nieren enwas ze in steriele DPBS aangevuld met gentamicine en nystatine (zie boven) op ijs. Alle verdere stappen worden onder steriele clean bench omstandigheden worden uitgevoerd. </li><li> Overdracht van nieren van de DPBS oplossing op een steriel kompres om overmatige vloeistof te verwijderen. Verwijder het vet niercapsule met steriele pincet en een schaar. </li><li> Nadat de nier nog in het kompres vastgesteld gesneden iets naast de lengteas van de buitenste (corticaal) zijde. Zorg ervoor dat niet te snijden door middel van volledig, maar om het te verlaten in een stuk, verbonden in het nierbekken. </li><li> Met gebogen schaar zorgvuldig ontleden de witachtige innerlijke medullae, die worden omgeven door de rose glinsterende buitenste medulla. Verzamel ze in DPBS, met gentamicine en nystatine in een 60 mm cultuur schotel op ijs. </li><li> Zodra alle medullae worden geïsoleerd en op ijs verzameld, zet het volume van DPBS tot een niveau waarop ze gewoon zijn bedekt met buffer. Gebruik een steriel scheermesje om de medullae snijd ze in blokjes van 53 mm. </li><li> Smelt en rond het scherpe uiteinde van een steriele Pasteur pipet door het houden van deze kort in een vlam. Zorg ervoor dat de pipet wordt voordat u verder afgekoeld. </li><li> Overdracht van het weefsel schorsing aan de 50 ml Falcon buizen met vers bereide steriele enzymoplossing met hyaluronidase en collagenase (zie 1.3.1) met behulp van de afgeronde Pasteur pipet. Sluit het deksel stevig en incubeer bij 37 ° C onder continu roeren (220 rpm) in een regelmatig tafelblad waterbad gedurende 1,5 - 2 uur. </li><li> Voor fijnwrijving van de schorsing, pipet het mengsel op en neer meerdere malen met de ronde Pasteur pipet (zie boven) totdat de schorsing wordt homogeen troebel. </li><li> Centrifugeer de suspensie gedurende 5 minuten bij 300 g en 16 ° C. Verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet grondig in DPBS, met gentamicine en nystatine en centrifuge opnieuw. Herhaal deze wasstap eenmaal. </li><li> Resuspendeer de cellen in volledig aangevuld medium en zaad ze in cULTUUR gerechten en / of micro-titer well platen. De bereiding van 2 medullae (1 dier) voldoende cellen opleveren voor een 60 mm cultuur schotel. </li><li> Na 24 uur, wassen cellen tweemaal met 600 mosmol DMEM en voeg vers medium. Gedurende de volgende week de cellen 2-3 keer (figuur 1) worden gewassen. 6-8 dagen na het zaaien, kan IMCD cellen worden gebruikt voor experimenten. Vergeet niet om ze broeden in medium zonder dbcAMP en nystatine voor 24 uur voor aanvang van het experiment. Anders AQP2 zullen uitsluitend worden gevestigd in de plasmamembraan. </li></ol>

<ol><li>Stoos, B. A., Naray-Fejes-Toth, A., Carretero, O. A., Ito, S., Fejes-Toth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+mouse+cortical+collecting+duct+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Characterization of a mouse cortical collecting duct cell line.</a> Kidney International. 39, 1168-1175 (1991).</li>
<li>Graham, F. L., Smiley, J., Russell, W. C., Nairn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+a+human+cell+line+transformed+by+DNA+from+human+adenovirus+type+5%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+general+virology%22%5BJournal%5D)">Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5.</a> The Journal of general virology. 36, 59-74 (1977).</li>
<li>Gluzman, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SV40-transformed+simian+cells+support+the+replication+of+early+SV40+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants.</a> Cell. 23, 175-182 (1981).</li>
<li>Ala, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+studies+of+twelve+mutant+V2+vasopressin+receptors+related+to+nephrogenic+diabetes+insipidus%3A+molecular+basis+of+a+mild+clinical+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Functional studies of twelve mutant V2 vasopressin receptors related to nephrogenic diabetes insipidus: molecular basis of a mild clinical phenotype.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 9, 1861-1872 (1998).</li>
<li>Richardson, J. C., Scalera, V., Simmons, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+strains+of+MDCK+cells+which+resemble+separate+nephron+tubule+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Identification of two strains of MDCK cells which resemble separate nephron tubule segments.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 673, 26-36 (1981).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin+2+Promotes+Cell+Migration+and+Epithelial+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Aquaporin 2 Promotes Cell Migration and Epithelial Morphogenesis.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. , (2012).</li>
<li>Perantoni, A., Berman, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+Wilms%27+tumor+line+%28TuWi%29+and+pig+kidney+line+%28LLC-PK1%29+typical+of+normal+kidney+tubular+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro%22%5BJournal%5D)">Properties of Wilms' tumor line (TuWi) and pig kidney line (LLC-PK1) typical of normal kidney tubular epithelium.</a> In vitro. 15, 446-454 (1979).</li>
<li>Katsura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+and+regulated+membrane+expression+of+aquaporin+1+and+aquaporin+2+water+channels+in+stably+transfected+LLC-PK1+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7212-7216 (1995).</li>
<li>Hull, R. N., Cherry, W. R., Weaver, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+characteristics+of+a+pig+kidney+cell+strain%2C+LLC-PK%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro%22%5BJournal%5D)">The origin and characteristics of a pig kidney cell strain, LLC-PK.</a> In vitro. 12, 670-677 (1976).</li>
<li>Nedvetsky, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+regulation+of+aquaporin-2+abundance+and+degradation+by+protein+kinase+A+and+p38-MAP+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Reciprocal regulation of aquaporin-2 abundance and degradation by protein kinase A and p38-MAP kinase.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 21, 1645-1656 (2010).</li>
<li>Iolascon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Two+Novel+Missense+Mutations+in+the+AQP2+Gene+Causing+Nephrogenic+Diabetes+Insipidus%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Two Novel Missense Mutations in the AQP2 Gene Causing Nephrogenic Diabetes Insipidus.</a> Nephron Physiology. 105, p33-p41 (2007).</li>
<li>Deen, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-2+transfection+of+Madin-Darby+canine+kidney+cells+reconstitutes+vasopressin-regulated+transcellular+osmotic+water+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-2 transfection of Madin-Darby canine kidney cells reconstitutes vasopressin-regulated transcellular osmotic water transport.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 8, 1493-1501 (1997).</li>
<li>Valenti, G., Frigeri, A., Ronco, P. M., D'Ettorre, C., Svelto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+functional+analysis+of+water+channels+in+a+stably+AQP2-transfected+human+collecting+duct+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Expression and functional analysis of water channels in a stably AQP2-transfected human collecting duct cell line.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271, 24365-24370 (1996).</li>
<li>Steele, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+immortalization+of+principal+cells+from+mouse+collecting+duct%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Telomerase immortalization of principal cells from mouse collecting duct.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 299, F1507-F1514 (2010).</li>
<li>Bens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticosteroid-dependent+sodium+transport+in+a+novel+immortalized+mouse+collecting+duct+principal+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%3A+JASN%22%5BJournal%5D)">Corticosteroid-dependent sodium transport in a novel immortalized mouse collecting duct principal cell line.</a> Journal of the American Society of Nephrology: JASN. 10, 923-934 (1999).</li>
<li>Hasler, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+regulation+of+aquaporin-2+expression+in+vasopressin-responsive+renal+collecting+duct+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Long term regulation of aquaporin-2 expression in vasopressin-responsive renal collecting duct principal cells.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277, 10379-10386 (1074).</li>
<li>Miller, R. L., Sandoval, P. C., Pisitkun, T., Knepper, M. A., Hoffert, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasopressin+inhibits+apoptosis+in+renal+collecting+duct+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Vasopressin inhibits apoptosis in renal collecting duct cells.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. , (2012).</li>
<li>Kleinman, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+complexes+with+biological+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Basement membrane complexes with biological activity.</a> Biochemistry. 25, 312-318 (1986).</li>
<li>Storm, R., Klussmann, E., Geelhaar, A., Rosenthal, W., Maric, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmolality+and+solute+composition+are+strong+regulators+of+AQP2+expression+in+renal+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Osmolality and solute composition are strong regulators of AQP2 expression in renal principal cells.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 284, 189-198 (2003).</li>
<li>Maric, K., Oksche, A., Rosenthal, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-2+expression+in+primary+cultured+rat+inner+medullary+collecting+duct+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-2 expression in primary cultured rat inner medullary collecting duct cells.</a> Am. J. Physiol. 275, 796-801 (1998).</li>
<li>Liebenhoff, U., Rosenthal, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Rab3-%2C+Rab5a-+and+synaptobrevin+II-like+proteins+in+a+preparation+of+rat+kidney+vesicles+containing+the+vasopressin-regulated+water+channel%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of Rab3-, Rab5a- and synaptobrevin II-like proteins in a preparation of rat kidney vesicles containing the vasopressin-regulated water channel.</a> FEBS Lett. 365, 209-213 (1995).</li>
<li>Lorenz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+is+sufficient+for+triggering+the+exocytic+recruitment+of+aquaporin-2+in+renal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP is sufficient for triggering the exocytic recruitment of aquaporin-2 in renal epithelial cells.</a> EMBO Rep. 4, 88-93 (2003).</li>
<li>Tamma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prostaglandin+E2+analogue+sulprostone+antagonizes+vasopressin-induced+antidiuresis+through+activation+of+Rho%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The prostaglandin E2 analogue sulprostone antagonizes vasopressin-induced antidiuresis through activation of Rho.</a> J. Cell Sci. 116, 3285-3294 (2003).</li>
<li>Maric, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+volume+kinetics+of+adherent+epithelial+cells+measured+by+laser+scanning+reflection+microscopy%3A+determination+of+water+permeability+changes+of+renal+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cell volume kinetics of adherent epithelial cells measured by laser scanning reflection microscopy: determination of water permeability changes of renal principal cells.</a> Biophys. J. 80, 1783-1790 (2001).</li>
<li>Gonzalez, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+stimulates+renin+in+inner+medullary+collecting+duct+cells+via+protein+kinase+C+and+independent+of+epithelial+sodium+channel+and+mineralocorticoid+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II stimulates renin in inner medullary collecting duct cells via protein kinase C and independent of epithelial sodium channel and mineralocorticoid receptor activity.</a> Hypertension. 57, 594-599 (2011).</li>
<li>Chou, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aquaporin-2+trafficking+by+vasopressin+in+the+renal+collecting+duct.+Roles+of+ryanodine-sensitive+Ca2%2B+stores+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of aquaporin-2 trafficking by vasopressin in the renal collecting duct. Roles of ryanodine-sensitive Ca2+ stores and calmodulin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275, 36839-36846 (2000).</li>
<li>Uawithya, P., Pisitkun, T., Ruttenberg, B. E., Knepper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+native+inner+medullary+collecting+duct+cells+from+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of native inner medullary collecting duct cells from rat kidney.</a> Physiological Genomics. 32, 229-253 (2008).</li>
<li>Tchapyjnikov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+profiling+of+nuclei+from+native+renal+inner+medullary+collecting+duct+cells+using+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic profiling of nuclei from native renal inner medullary collecting duct cells using LC-MS/MS.</a> Physiological Genomics. 40, 167-183 (2010).</li>
<li>Stefan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalization+of+cAMP-dependent+signaling+by+phosphodiesterase-4D+is+involved+in+the+regulation+of+vasopressin-mediated+water+reabsorption+in+renal+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalization of cAMP-dependent signaling by phosphodiesterase-4D is involved in the regulation of vasopressin-mediated water reabsorption in renal principal cells.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 18, 199-212 (2007).</li>
<li>Klussmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inhibitory+role+of+Rho+in+the+vasopressin-mediated+translocation+of+aquaporin-2+into+cell+membranes+of+renal+principal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An inhibitory role of Rho in the vasopressin-mediated translocation of aquaporin-2 into cell membranes of renal principal cells.</a> J. Biol. Chem. 276, 20451-20457 (2001).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

We presenteren een gedetailleerd protocol voor de voorbereiding en het kweken van primaire rat IMCD cellen. De aanpak levert tot 21 cm2 van cellen van een rat 20. Het experiment vereist standaard celkweek apparatuur en kan door slechts een persoon binnen ca. 6 uur worden uitgevoerd. Daarom is deze benadering geschikt als standaard laboratoriummethode. Primaire rat IMCD cellen worden gezaaid in kweekplaten van verschillende grootte, variërend van 96 well platen 60 mm sch...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/50366">Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells</a>. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to: Enno Klussmann instead of: Enno Klussman

A correction to author list has been made for article Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells.

Erratum: Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

In renale verzamelbuis OG cellen, arginine-vasopressine (AVP) regelt waterherabsorptie door bevordering van de insertie van het waterkanaal aquaporin-2 (AQP2) in de plasmamembraan. AVP bindt de G-eiwit-gekoppelde vasopressine-type-2 receptor (V2R) adenylylcyclase stimuleren en daardoor vorming van cAMP. Inleiding van deze signalering cascade leidt tot activatie van proteïne kinase A (PKA). PKA fosforyleert AQP2 op serine 256 (S256), die de belangrijkste trigger voor de herverdeling van intracellulaire blaasjes in de plasmamembraan. Het membraan inbrengen vergemakkelijkt waterherabsorptie langs een osmotische gradiënt en verfijnt het lichaam water homeostase. Ontregeling van AVP-gemedieerde water reabsorptie, als gevolg van afwijkingen van AVP secretie of AVP-geactiveerde signalering oorzaken of gepaard gaat met ernstige ziekten. Verminderde waterherabsorptie veroorzaakt door mutaties van V2R of AQP2 leidt tot nefrogene diabetes insipidus, terwijl een elevated bloedplasma AVP niveau wordt geassocieerd met overmatig water reabsorptie in cardiovasculaire ziekten zoals chronisch hartfalen en het syndroom van inadequate secretie van antidiuretisch hormoon (SIADH). De betekenis van de AVP-gemedieerde waterherabsorptie komt niet alleen voort uit zijn betrokkenheid bij ziekte. De AVP-geïnduceerde translocatie van AQP2-dragende blaasjes en fusie met de plasmamembraan is strikt cAMP-afhankelijke exocytose-proces, dat nog niet goed begrepen. Andere voorbeelden van een cAMP-afhankelijke exocytose zijn renine secretie in de nier en H + secretie in de maag. Daarom opheldering van de moleculaire mechanismen die AQP2-translocatie in renale belangrijkste cellen helpt niet alleen soortgelijke moleculaire processen te begrijpen in andere celtypes, maar kan ook tot aan nieuwe therapieën voor de behandeling van ziekten die geassocieerd zijn met afwijkingen in AVP-gemedieerde waterreabsorptie effenen . Elucidating mechanismen die AQP2 vereist opvangbuis hoofdsom cell modellen. Hiervoor is een aantal verschillende zoogdiercellen nier cellijnen beschikbaar. Echter, deze modellen hebben een aantal nadelen. In veel mobiele systemen het eiwitgehalte van AQP2 is laag (tabel 1; M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) 1-10, anderen ectopisch overexpressie menselijke (MCD4, WT10) 11,12 of rat (CD8) 13 AQP2. In MCD4 en COS-7 cellen de V2 receptor niet tot expressie. Voor zover bekend geen permanente cellijn als model beschikbaar, die is afgeleid van de nier binnenste medullaire verzamelbuis, dat deel van de nier waar AQP2 expressie meest voorkomende, maar van de corticale verzamelbuis 1,11,13-16 . Dergelijke celmodellen zijn bijvoorbeeld de veelgebruikte geïmmortaliseerde mpkCCD (bijv. 17) of de recent opgerichte mTERT-CCD 14 cellijnen. Beide cellijnen endogeen uitdrukkelijke AQP2 en V2R maar omdat ze zijn afgeleid van decorticale collecting duct bevatten hoogstwaarschijnlijk een andere proteoom vergeleken met innerlijke medullaire verzamelbuis (IMCD) cellen. Zij moeten bijvoorbeeld uiten verschillende Na + transportsystemen. Hier presenteren we een protocol om cultuur primaire IMCD cellen die V2R en AQP2 endogeen. Dit model vormt derhalve het meest de fysiologische toestand in de renale verzamelen duct. Zoals oprichting van de cultuur vereist enige standaard laboratoriumapparatuur andere laboratoria kunnen gemakkelijk deze aanpak.

<table><tbody><tr><td>Collagen Type IV Mouse</td><td>BD Biosciences</td><td>356233</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>SIGMA</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type CLS-II</td><td>Biochrom AG</td><td>C2-22</td><td></td></tr><tr><td>DMEM + GlutMAX</td><td>Invitrogen GIBCO</td><td>21885108</td><td></td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>SIGMA</td><td>N4014</td><td></td></tr><tr><td>Ultroser G</td><td>Cytogen</td><td>15950-017</td><td></td></tr><tr><td>Non essential amino acids (NEA)</td><td>Biochrom AG</td><td>K0293</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Invitrogen GIBCO</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>DBcAMP</td><td>BIOLOG</td><td>D009</td><td></td></tr></tbody></table>

kweken primaire rat inner medullary verzamelen duct cells

Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells

Arginine-vasopressine (AVP) faciliteert waterherabsorptie door renale opvangbuis voornaamste cellen en daardoor verfijnt lichaam waterhomeostase. AVP bindt aan vasopressine V2-receptoren (V2R) op het oppervlak van de cellen en daardoor leidt tot de vorming van cAMP. Dit stimuleert cellulaire signalering processen die leiden tot veranderingen in de fosforylering van het waterkanaal aquaporin-2 (AQP2). Proteïne kinase A phoshorylates AQP2 en daarmee het startsein voor de translocatie van AQP2 van intracellulaire blaasjes in de plasmamembraan faciliteren waterherabsorptie uit primaire urine. Aberraties van AVP vrijlating uit de hypofyse of AVP-geactiveerde signalering in hoofdsom cellen kunnen verzwakking van het centrale of nefrogene diabetes insipidus, respectievelijk een verhoogde bloedplasma AVP wordt in verband gebracht met hart-en vaatziekten, zoals chronisch hartfalen en het syndroom van inadequate secretie van antidiuretisch hormoon. Hier, een protocol voor cultivati ​​presenteren weop van de primaire rat binnenste medullaire verzamelbuis (IMCD) cellen, die uitdrukkelijk V2R en AQP2 endogeen. De cellen zijn geschikt voor het ophelderen van de moleculaire mechanismen die de controle AQP2 en aldus nieuwe targets voor de behandeling van ziekten geassocieerd met ontregeling van AVP-gemedieerde waterreabsorptie ontdekken. IMCD cellen worden verkregen van rat nier binnenste medullae en worden gebruikt voor experimenten zes tot acht dagen na het zaaien. IMCD cellen kunnen worden gekweekt in normale celcultuurschalen, flacons en micro-titer platen van verschillende formaten, de procedure vereist slechts een paar uur, en is geschikt voor standaard celkweek laboratoria.

De succesvolle kweken van primaire rat IMCD cellen zal resulteren in een confluente monolaag 6-8 dagen na het zaaien (figuur 2). Per 60 mm cultuur schotel zijn er ongeveer 6 x 10 6 cellen. De cellen strak houden aan de cultuur gerechten, zoals deze werden bekleed met collageen type IV, een basale membraan component 18. Daarom IMCD cellen zullen niet eens gedurende enkele grondige wasprocedures los. Tot 80% van de gekweekte cellen brengen endogeen V2R en AQP2. Dit zijn de belangrijk...

Arginine-vasopressine (AVP) regelt fine-tuning van het lichaam van het water homeostase door het vergemakkelijken waterherabsorptie door renale opdrachtgever cellen. Hier presenteren wij een protocol voor de teelt van primaire rat binnenste medullaire verzamelen duct cellen die geschikt zijn voor de opheldering van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen AVP-gemedieerde water reabsorptie.

Kweken Primaire Rat Inner Medullary Verzamelen Duct Cells

Arginine-vasopressin (AVP) facilitates water reabsorption by renal collecting duct principal cells and thereby fine-tunes body water homeostasis. AVP ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van primaire cellen van de medullaire verzamelbuis (IMCD-cellen) van de rat die geschikt zijn voor het bestuderen van VP-gemedieerde waterreabsorptie. Dit wordt bereikt door eerst de nieren van de rat te verwijderen. De tweede stap is het isoleren van de binnenste medulla van de omringende buitenste medulla en de cortex.Vervolgens worden de binnenste meli enzymatisch verteerd om individuele cellen vrij te maken. De laatste stap is het suspenderen en selecteren van hoofdcellen om deze vervolgens in kweekschalen uit te zaaien. Uiteindelijk zijn de cellen zes tot acht dagen na het uitzaaien klaar voor gebruik in experimenten.Het celkweeksysteem is geschikt voor de ontrafeling van moleculaire mechanismen die ten grond liggen aan VP-gemedieerde waterresorptie, en mogelijk andere CAP-afhankelijke TIC-processen. Bovendien kan het systeem worden gebruikt voor de ontdekking van nieuwe kandidaat-geneesmiddelen en drug targets voor de behandeling van ziekten die geassocieerd zijn met een ontregeling van de VP-gemedieerde waterresorptie. De procedure zal worden gedemonstreerd door een promovendus uit ons laboratorium en door Beata Eman en Andrea Giller, twee technici uit ons laboratorium.Volg deze tijdlijn en coat de kweekschalen met collageen type vier. Bereid de dag vóór de procedure de volgende dag eerst het medium en de enzymoplossingen voor. Voeg supplementen toe aan vers bereid DMEM-medium.Voeg voor de bereiding van de enzymoplossing 1 mg/mL hyaluronidase en 2,2 mg/mL collagenase toe aan gefilterde DPBS. Steriliseer de oplossing en bewaar deze in een Falcon-buis van 50 mL.Bereid één milliliter enzymoplossing voor voor elke twee verteerde niermedullae. De moeilijkste stap van dit protocol is de dissectie van de medulla. Om succes te garanderen, wordt het bloed uit de dieren gedraineerd vóór de dissectie, waardoor de glinsterende grens tussen de medulla en de cortex na euthanasie gemakkelijker te detecteren is.Verwijder de nieren en bewaar deze in de eerder bereide steriele DPBS. Werk onder steriele omstandigheden. Breng de nieren vanuit de DPBS-oplossing, aangevuld met Gentamicine Nystatine, over naar een steriel kompres om overtollige vloeistof te verwijderen.Verwijder vervolgens met het steriele scalpel het vetrijke nierkapsel terwijl de nier nog op het kompres is gefixeerd. Maak een snede nabij de longitudinale as van de buitenste of corticale zijde. Zorg ervoor dat u niet volledig doorsnijdt, maar dat het geheel in één stuk blijft en nog verbonden is in het nierbekken.Identificeer vervolgens de glinsterende rozegekleurde buitenste merglaag (outer medulla) en de witachtige binnenste merglaag (inner medulla). Dissecteer met een gebogen schaar voorzichtig de binnenste merglaag weg van de omringende buitenste merglaag. Plaats het weefsel in de eerder bereide DPBS-oplossing.Zodra alle Meli zijn geïsoleerd en op ijs zijn verzameld, wordt het volume van de DPBS-oplossing, aangevuld met Gentamicine en Nystatine, verminderd tot een niveau waarbij ze net met buffer zijn bedekt. Gebruik een steriel scheermesje om de Meli in kubussen van ongeveer vijf millimeter kubiek te snijden. Smelt vervolgens het scherpe uiteinde van een steriele pasteurpipet en rond dit af door het kort in een vlam te houden.Zodra het is afgekoeld, gebruikt u deze pipette om de weefselsuspensie over te brengen naar een Falcon-buis van 50 milliliter die de vers bereide steriele enzymoplossing bevat. Plaats de buis in een waterbad en incubeer deze gedurende anderhalf tot twee uur bij 37 °C onder continue agitatie.Pipetteer na deze tijd het mengsel meerdere keren op en neer met de rondbodem van uw pipetteertip totdat de suspensie homogeen troebel wordt. Centrifugeer de suspensie vervolgens vijf minuten zodra deze volledig is gehomogeniseerd. Verwijder daarna het supernatant.Resuspendeer het pellet en centrifugeer opnieuw. Herhaal deze wasstap nogmaals. Resuspendeer de cellen in volledig aangevuld medium en zaai ze direct na het zaaien in kweekschalen of microtiterplaten; geïsoleerde IMCD-cellen, cũng als erytrocyten en celdebris, kunnen onder de microscoop worden geëvalueerd.Dit geeft een eerste indicatie van het aantal cellen dat na 24 uur is geïsoleerd. Was de cellen met 600 milli osmoles DMEM en voeg vers medium toe. Gedurende de volgende week moeten de cellen twee tot drie keer gewassen worden.De IMCD-cellen moeten zes tot acht dagen na het uitplaten klaar zijn voor experimenten wanneer ze tot confluentie zijn gegroeid, zoals hier te zien is. Vergeet niet de cellen gedurende 24 uur in medium zonder DBC MP en INE te incuberen voordat u aan het experiment begint. Anders zal aquaporine 2 zich voornamelijk in het plasmamembraan bevinden.De succesvolle kweek van primaire ratten-IMCD-cellen resulteert in een confluente monolaag zes tot acht dagen na het uitplaatten; wanneer gestimuleerd met arginine, vasopressine of forskoline, transloceert aqp twee van intracellulaire blaasjes naar het plasmamembraan, zoals hier te zien is. Daarnaast neemt de expressie van AQP twee in IMCD-cellen toe na een uitdaging van 30 minuten met een VP of forline, zoals getoond in deze western blot. Na deze procedure volgen D-N-A-R-N-A-isolatie, R-T-P-C-R en immunoprecipitatie-experimenten.Western blot-analyse en immunofluorescentiemicroscopie kunnen worden uitgevoerd om genen en genproducten van inod-verzamelbuiscellen te analyseren. Dit celcultuursysteem, dat endogene eiwitten tot expressie brengt, is bijzonder aantrekkelijk voor gebruik in onbevooroordeelde screeningsbenaderingen.

culturing-primary-rat-inner-medullary-collecting-duct-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit is een protocol beschrijft hoe te isoleren en cultuur primaire sympathische neuronen van een superieure cervicale ganglia (SCG) van pasgeboren ratten pups.

Protocol voor het kweken van sympathische neuronen van Rat Superior Baarmoederhalskanker ganglia (SCG)

We beschrijven een snelle methode voor het isoleren en cultuur hippocampus en corticale neuronen van knaagdieren embryo's. Dit protocol stelt ons in staat uit te voeren experimenten waarbij bijna zuivere neuronale culturen zijn vereist.

Isolatie en Cultuur van Rat Embryonale neurale cellen: een Quick-protocol

In this video, we demonstrate the steps to isolate and purify renal tubular epithelial cells for a wide range of molecular biology and cell culture studies.

Murine Renal Cell Isolation: A Technique to Isolate and Generate Primary Culture of Renal Tubular Epithelial Cells

This video demonstrates a technique for isolating and culturing dorsal root ganglia (DRG) cells from the rat spinal column. DRGs excised from the spinal column are treated with enzymes and mechanically dissociated to obtain a single-cell suspension. The cells are cultured in a medium containing inhibitors and growth factors that limit glial cell proliferation and promote neuronal growth, respectively.

Establishing a Primary Dorsal Root Ganglia Cell Culture from a Rat Spinal Column

Dit protocol beschrijft de isolatie, cultuur en verkalking van de rat-afgeleide ventiel interstitiële cellen, een zeer fysiologische in vitro model van calcific aortaklep ziekte (CAVD). Exploitatie van dit model rat vergemakkelijkt CAVD onderzoek in het verkennen van de cel- en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan dit complexe pathologisch proces.

Isolatie en karakterisatie van primaire Rat klep interstitiële cellen: een nieuw Model voor het bestuderen van verkalking van de aortaklep

Dit protocol biedt een rendabele aanpak om te isoleren en karakteriseren van muis primaire renale tubulaire cellen die vervolgens sub kunnen worden gekweekt om te beoordelen renale biologische functies- ex vivo, met inbegrip van de mitochondriale Bioenergetica.

Isolatie, karakterisering en High Throughput extracellulaire Flux-analyse van muis primaire renale tubulaire epitheliale cellen

Het hormoon afgescheiden door de bijnierschors is van vitaal belang voor dieren tegen stress en ziekten. Hier presenteren we een protocol bij de cultuur de primaire rat bijnier cellen. Het zou een goede in-vitro platform voor onderzoek naar de mechanismen van het reagens van belang in de bijnier steroidogenesis en lipide biosynthese.

Primaire cultuur van Rat Adrenocortical cellen en testen van Steroidogenic functies

Dit protocol probeert een herhaalbaar protocol vast te stellen voor primaire neuronen en glia-isolatie van rattenblaas voor verdere cellulaire experimenten.

Isolatie en cultuur van primaire neuronen en Glia van volwassen rat urineblaas

Dit artikel beschrijft de isolatie en het kweken van embryonale rat sympathische neuronen van de superieure cervicale ganglia. Het biedt ook gedetailleerde protocollen voor immunocytochemische kleuring en voor de voorbereiding van neuronale extracten voor massaspectrometrische analyse.

Culturing Rat Sympathische Neuronen van Embryonale Superior Cervicale Ganglia voor morfologische en proteomische analyse

Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor het isoleren van primaire retinale Müller-cellen van neonatale Sprague-Dawley (SD) ratten. De procedure omvat enucleatie van de oogbollen, dissectie van netvliesweefsel, extractie en identificatie van cellen en belangrijke overwegingen voor latere celkweek.

Isolatie en kweek van primaire retinale Müller-cellen van Sprague-Dawley (SD) ratten

Leer primaire rat inner medullary collecting duct cellen kweken voor onderzoek naar arginine-vasopressine-gemedieerde waterresorptie. Dit protocol maakt moleculaire studies van nierfysiologie mogelijk.

Kweken Primaire Rat Inner Medullary Verzamelen Duct Cells

Meer video's verkennen