Een Multiplexed Luciferase-gebaseerde screening Platform voor ondervragen Kanker-geassocieerde signaaltransductie in gekweekte cellen
July 3rd, 2013
Het bereiken van een systeemniveau begrip van cellulaire processen is een doel van de hedendaagse celbiologie. We beschrijven hier strategieën voor multiplexing luciferase reporters van verschillende cellulaire functie eindpunten naar gen-functie met behulp van genoom-schaal RNAi bibliotheken ondervragen.
Het algemene doel van het volgende protocol is om onderzoek op genoomschaal naar genfunctie mogelijk te maken door gelijktijdig meerdere cellulaire resultaten te monitoren. In deze demonstratie worden Firefly RAN en op Cipro Dina Luciferase gebaseerde reporters gebruikt om respectievelijk P 53 WINT en KRAS-padactiviteit te monitoren. Deze drie reporters worden gecombineerd met irna die zich richt op een gen van belang in HCT one 16 cellen, een darmkankercellijn.
Vervolgens worden de activiteiten van vuurvlieg en vanille luciferase gemeten in de cellysaten terwijl de activiteit van Cipro DEA luciferase, een gesecreteerd enzym, wordt gemeten in het kweekmedium. Resultaten worden verkregen die de reproduceerbaarheid van het testsysteem aantonen, evenals de mogelijkheid om gedeelde en unieke acties van genen binnen deze drie kankerrelevante paden te onthullen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden zoals microray of multicolor pries, is dat het een betaalbare, universele en kosteneffectieve manier is om naar de transcriptionele cellulaire uitkomsten te kijken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen in kankeronderzoek, zoals de ontwikkeling van moleculair gerichte therapeutische strategieën. Hoewel ons protocol voor transiente transfectie IL is en een minimale tijdsinvestering voor de instelling van het scherm vereist, zal het waarschijnlijk de signaalvariabiliteit tussen de putjes verhogen, wat kan worden tegengegaan door te kijken naar de rapportverhoudingen in plaats van naar absolute uitvalresultaten van de putjes. Om deze procedure te starten, wast u vijf 10 centimeter vierkante platen van 80 tot 90% confluente HCT one 16 cellen met PBS en verzamelt u vervolgens de cellen door trypsinisatie voor elke plaat.
Gebruik een milliliter trypsinoplossing gevolgd door neutralisatie met 10 milliliter DMEM met 2%FBS en 1%penicilline. Streptomycine. Breng de geschorste cellen over naar een 50 milliliter conische buis en centrifugeer gedurende ongeveer 130 G gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant en suspendeer het cellulaire pellet in 10 milliliter medium.
Tel het aantal cellen met een celteller en maak vervolgens een celoplossing met 10 tot de vijfde cellen per milliliter. Bewaar 150 milliliter celsuspensie voor de volgende stap met behulp van een multi-drop geautomatiseerde vloeistofdispenserplaat. 100 microliter of 10 tot de vierde cellen in elke put van een 96-well kweekplaat.
De celsuspensie in dit geval zou voldoende moeten zijn om 1296 putjes te bedekken. Bewaar de platen met cellen bij 37 graden Celsius in een incubator met 5% koolstofdioxide terwijl u de transfectiemixturen bereidt. Het hoogwaardige reporterconstruct-DNA dat hier wordt gebruikt, werd geïsoleerd met behulp van standaard MIDI-prepkits en verdund tot een eindconcentratie van één milligram per milliliter.
Bereid voor elke reporter 100 microliter reporterconstruct-basisoplossing door de volgende 30 microliters van P 53, 30 microliters van acht X-T-C-F-R-L, 30 microliters van elk één G vier zes microliters van U-A-S-C-L en vier microliters van H twee oh te combineren. Dit resulteert in een DNA-mengsel met een eindverhouding van één op één op één op 0,2 van de reporters en een eind-DNA-concentratie van 0,3 milligram per milliliter. Bereid vervolgens I-R-N-A-D-N-A-transfectiemixturen die voldoende zijn voor het bedekken van 1296.
Verdun 80 microliter van de reporterconstruct-basisoplossing in acht milliliter EC-buffer van de QIAGEN effecting-kit om een DNA-oplossing te verkrijgen met een eindconcentratie van drie microgram per milliliter plaat. Breng 20 microliter van de DNA-oplossing aan in elke put van een 96-well PCR-plaat. Het aantal 96-well platen hangt af van het aantal irna-pools dat moet worden getest.
In dit geval hebben we bijvoorbeeld 4 96-well platen nodig om 384 verschillende sir a-pools te evalueren. Gebruik een biome geautomatiseerde vloeistofhandler om twee microliter van elke vijf micromolar siRNA over te brengen naar de overeenkomstige put van de PCR-plaat die het verdunde DNA-stock bevat. Voeg vervolgens één microliter van de versterkeroplossing toe aan elke put van de DNA siRNA-plaat.
Laat de versterkerreactie gedurende vijf minuten op kamertemperatuur plaatsvinden. Voeg vervolgens drie microliter van het effectieve transfectiereagens toe aan elke put en incubeer gedurende nog eens 10 minuten op kamertemperatuur. Om de vorming van het transfectiecomplex te stoppen, voegt u 10 microliter DMEM met 2%FBS en 1%penicilline. Streptomycine toe aan elke put van de PCR-plaat.
Haal de 1296-well platen met HCT one 16 cellen uit de incubator. Breng 10 microliter van de transfectiemixturen over in elke put van een 96-well plaat die de cellen bevat, aangezien elke transfectie in drievoudige uitvoering zal worden uitgevoerd. Dezelfde mix zal worden toegepast op twee extra 96-well platen met cellen.
Bewaar de cellen met transfectiemixturen gedurende 36 uur bij 37 graden Celsius in een bevochtigde omgeving met 5% koolstofdioxide. 36 uur na transfectie van cellen. Luciferase-activiteiten zijn klaar voor meting.
Aangezien deze studie meerdere reporters omvat, één gesecreteerd in het kweekmedium en twee andere geëxpresseerd in het celcytoplasma. Metingen worden verkregen van zowel kweekmedium als een cellulair lysate om Cipro Dina luciferase of CL-activiteit in het kweekmedium te detecteren. Replica plaat.
20 microliter van een kweekmedium in een witte, ondoorzichtige 96-well plaat. Voeg met behulp van de multi-drop 20 microliter CL-testbuffer toe aan elke put. Voeg vervolgens 10 microliter Cipro Dina Lucifer en substraat toe aan elke put en detecteer CL-activiteit met behulp van een luminometer om vuurvlieg-luciferase en vanille-luciferase-activiteiten te detecteren. Voor cellysaten moeten eerst worden gemaakt.
Verwijder het kweekmedium van de cellen door elke plaat ondersteboven te draaien en het medium in een gootsteen te gooien. Verwijder resterend medium door voorzichtig op de ondersteboven draaiende plaat op papieren handdo
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol maakt grootschalige onderzoek naar genfunctie mogelijk door meerdere cellulaire meetwaarden tegelijkertijd te monitoren. Met behulp van Firefly en Cipro Dina Luciferase reporters wordt de activiteit van belangrijke kankerpaden beoordeeld in colorectale kankercellen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Oncologie
- Genfunctieanalyse
Achtergrond
- Het begrijpen van cellulaire processen is cruciaal in de moderne celbiologie.
- Multiplexing van luciferase reporters kan de onderzoek naar genfunctie verbeteren.
- RNAi bibliotheken vergemakkelijken het onderzoek naar geninteracties.
- Paden zoals P53, WNT en KRAS zijn belangrijk in kankeronderzoek.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor gelijktijdige monitoring van meerdere cellulaire functies.
- Om de effecten van specifieke gen-knockdowns op kankerpaden te beoordelen.
- Om de reproduceerbaarheid van het assay-systeem aan te tonen.
Gebruikte methoden
- Cotransfectie van luciferase reporters en RNAi in HCT116 cellen.
- Meting van Firefly en Vanilla luciferase activiteiten in cell lysates.
- Beoordeling van uitgescheiden Cipro DEA luciferase activiteit in kweekmedium.
- Analyse van gedeelde en unieke genacties in kankerpaden.
Belangrijkste resultaten
- Demonstratie van reproduceerbaarheid van het assay-systeem.
- Gedeelde en unieke acties van genen in kankerpaden onthuld.
- Inzichten verschaft in de functionaliteit van P53, WNT en KRAS paden.
- Validatie van de multiplexing benadering voor genfunctiestudies.
Conclusies
- Het protocol maakt een uitgebreide analyse van genfuncties mogelijk.
- Multiplexing van luciferase reporters is effectief voor padenanalyse.
- Deze aanpak kan het begrip van kankerbiologie verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This multiplexed luciferase screening platform enables simultaneous interrogation of multiple cancer-associated signal transduction pathways, supporting target validation and mechanistic de-risking in oncology drug discovery. By providing quantitative, reproducible readouts of P53, WNT, and KRAS pathway activity, the method enhances predictive confidence in early-stage target prioritization and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by monitoring pathway-specific responses to gene knockdown.
- Operational Value: Supports functional target validation through multiplexed readouts that clarify mechanistic basis of phenotypic outcomes.
- Predictive Value: Facilitates pathway de-risking by revealing shared and unique gene actions across key oncogenic signaling networks.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, normalized luciferase readouts that enable reliable comparison of gene effects across pathways.
- Operational Value: Delivers a cost-effective, adaptable platform for high-content screening of large molecular libraries.
- Scalability: Compatible with automated liquid handling and 96-well formats for scalable assay deployment.
Translational & Preclinical Research
- Translational Alignment: Uses disease-relevant colorectal cancer cell models to monitor pathway activity with direct relevance to human cancer biology.
- Mechanistic Continuity: Bridges discovery-phase target hits to mechanistic understanding of pathway modulation.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by clarifying whether gene effects are pathway-specific or pleiotropic.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, enabling mechanistic insight before compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking gene knockdown to specific signaling outputs.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible, multiplexed measurements compatible with library-scale applications.
- Analytics: Provides ratio-based luciferase readouts that normalize for transfection variability and enable cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical work by using cancer-relevant pathways and cell models with known pathway genotypes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable screening capability for iterative target validation across multiple oncology projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence by reducing mechanistic ambiguity in phenotypic screening data.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through internal reporter controls and ratio-based analysis.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets before costly lead optimization.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by distinguishing pathway-selective from broad-effect gene modulators.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture, transfection, and luciferase assay protocols.
- Dependent on luminometer access and standardized reagent preparation for consistent signal detection.
- Necessitates cross-team alignment on assay normalization methods (e.g., ratio-based vs. absolute values).
- Involves adaptation considerations when transferring to different cell lines or pathway reporters.
- Subject to well-to-well variability in transient transfection, mitigated by internal reporter ratio analysis.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:54
Preparation of Cells for siRNA and Reporter Transfection
5:42
Adding Transfection Mixtures to Cells
4:10
Preparing siRNA/DNA Transfection Mixtures
6:21
Determine Luciferase Activities from Cell Samples
8:04
Results: High-throughput Interrogation of Gene Function in Wnt/β-catenin, p53, and Kras Singaling
9:53
Conclusion
3:22
Preparing Reporter Construct DNA
3:19
siRNA and Reporter Transfection of Cells
